Bu çalışma RM Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırmalar Merkezi (NHMRC) projesi hibe ile desteklenmiştir

Burada açıklanan tüm deneysel prosedürleri UNSW Avustralya Hayvan Bakım ve Etik Kurulu uyulması ve Ulusal Sağlık ve hayvan deney için Tıbbi Araştırma Konseyi Avustralya yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Bu protokolde tüm işlemler, ilgili Hayvan Bakım ve Etik Kurulu gereklerine uygun olarak yapılmalıdır. 1. Asetilkolinesteraz Histokimyasal Boyama <ol><li> Asetilkolinesteraz Reaksiyon karışımı hazırlayın <ol><li> 0.1 M fosfat tamponu (PB) 200 ml asetiltiyoklolin iyodür 290 mg ekleyin. 900 rpm&#39;de bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. </li><li> Sürekli karıştırma altında, glisin, 600 mg ekleyin. </li><li> Ürün tamamen çözünene kadar yavaş yavaş sürekli karıştırma altında, reaksiyon karışımına bakır sülfat ve 420 mg ekleyin. </li></ol></li><li> Hayvan karkas deriyi kaldır kesiler yaparak (doku paylaşımı yoluyla elde edilen)Bir perfüze sıçan veya fare derisi, boyun bölgesinde cildi tutup ayağa geçmiş çekerek içine. Her kas kapsayan fasya kaldırıldı veya önemli ölçüde reaksiyon çözeltisine kas liflerinin bol pozlama sağlamak için delikli ya olduğundan emin olun. </li><li> Reaksiyon karışımına tüm vücudu veya ilgi bacak daldırın ve 4 ° C de O / N inkübe edin. </li><li> Damıtılmış su içinde 2 dakika boyunca karkas yıkayın. Not: Bu aşamada, kaslar mavi bir renk ve motor uç plakaları (MEP) beyaz noktalar olarak görülebilir sergiler. </li><li> 3-5 saniye için% 10 amonyum sülfit çözeltisine karkas Açığa. Not: kas lifleri hızla kahverengi dönecek ve Parlamento üyeleri siyah benekli noktalar olarak gözlemlenebilir olacak. Reaksiyon çok hızlı oluşur ve kas lifleri amonyum sülfit çözeltisi (örneğin,% 5) daha düşük konsantrasyonlarını kullanmayı deneyin milletvekilleri ve kas lifleri ayırt etmek çok koyu lekeli ise. Tepkime süresi almak içinAP üyeleri ve kas lifleri arasında iyi kontrast bir örnekten diğerine değişir. Bu nedenle ayıracı kesin pozlama süresini tanımlamak zordur. Reaksiyon yakından izlenmeli ve kontrast yeterli görüldüğünde durdurulmalıdır. </li><li> Distile su içinde çalkalanarak karkas iki kez yıkayın ve yavaşça kurulayın karkas. </li><li> Fotoğraf ilgi tüm kaslar için milletvekilleri yakalanır sağlamak ekstremitenin lateral ve medial yönleri, hem de. </li></ol> 2. İntramüsküler Enjeksiyonlar Motor Sonu Plakalar de <ol><li> Mikropipet çektirmesi ile cam mikropipetler çekin (pistonları ile kademeli mikropipetlerin kullanılması tavsiye edilir). Inceleyici bir mikroskobun yardımıyla, mikropipet lümenin iç çapı yaklaşık olarak 0.5 mm, öyle ki bir çift forseps ile mikropipetler ipuçlarını bölünürler. </li><li> Kullanılan tüm cerrahi aletler taze otoklava ve inci emin olunCerrahi alanda sterildir. </li><li> Floro-Gold (distile su içinde% 5) ile mikropipetler doldurun. </li><li> Izofloran (O 2% 4) ile bir indüksiyon odasında hayvan anastetize neden olur. Refleksi kontrol edin ve indüksiyon odasından çıkarmadan önce onun yokluğunda sağlamak. Sıçan burun üzerinde bir burun konisi Güvenli ve anestezi bakımı için isofluorane (O 2% 2) teslim. Hayvanın ayak parmakları Pinch ve yavaşça pedal çekilmesi ve kornea refleksleri hem bulunmadığına emin olmak için hayvanın gözü dokunun. Not: ketamin ve xylazil bir karışımı da kullanılabilir (80 ve 10 mg / kg, intraperitonal olarak verilen). Ketamin bir zamanlama 8 (&quot;Kontrollü&quot;) ilaç ve uyulması gerekecektir ilacın satın alınması, kullanılması, depolanması ve bertaraf ile ilgili gerekli protokoller olduğunu. </li><li> Prosedürü sırasında gözlerin kurumasını önlemek için göz yağlayıcı. </li><li> T Tıraşargeted bacak ve kullanım gazlı bez, üç klorheksidin alternatif scrubs ve% 70 alkol ile traş bölgeyi silin. Cerrahi alana hayvan aktarın. </li><li> Temiz bir underpad hayvan koyun ve hedeflenen kas (lar) iyi erişim sağlamak için uygun bir şekilde yerleştirin. </li><li> Uzakta yatan kas hedeflenen kas üzerindeki deriyi kaldırın ve cerrahi makas ile deride bir kesi yapmak için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Kesi tamamen ilgi kas (lar) maruz yeterince büyük olduğundan emin olun. Fasya minimal bozulma olduğundan emin olun. </li><li> Zihinsel kas (lar) üzerine MEP bölgenin konumunu ve şeklini devrik MEP fotoğrafları kullanın. Not: Bir ince keçe işaretleyici ilgi kas (lar) üzerine fotoğraftan MEP bölgesini çoğaltmak yardımcı olabilir. </li><li> Her bir s 1-2 ul 3-4 enjeksiyonlar, Flor-Gold için (MEP bölgenin tüm uzunluğu boyunca çok sayıda enjeksiyon gerçekleştirmehould) yeterli olabilir. Yavaşça herhangi sızıntıyı gidermek için kas (lar) silin. </li><li> Birbirine yakın künt forseps ile kazıma cilt iki ucunu getirin ve cerrahi klipler ile yarayı kapatmak. Yaranın tüm açıklık boyunca 0.1 mi bupivakainin (su içinde% 0.5) (ya da başka lokal anestezikler) sızın. </li><li> Kapalı anestezi Makineyi açın ve tamamen anestezi kurtarılır kadar hayvan izleyin. </li><li> Kas içi enjeksiyonların uygulanmasından ve hayvanların perfüzyon arasında 14 gün boyunca bekleyin. </li></ol> 3. Perfüzyonları <ol><li> Periton içine enjeksiyon yoluyla bir hayvana (150 mg / kg, örneğin Lethabarb) pentobarbiton sodyum çözeltisi öldürücü doz uygulayın. <ol><li> Pedal çekilmesi yokluğunda ve kornea refleksleri tarafından onaylandıktan anestezi derin bir düzeyde, ulaşılana kadar yakından hayvan izlemek. </li></ol></li><li> Bir perfusio üzerine yerleştirilen bir diseksiyon gemide sırtında hayvan yerleştirinn lavabo. </li><li> Sternum tabanını kaplayan derinin kaldırılması için diş kılıf ile forseps bir çift kullanın. Hemen sternum altında güçlü cerrahi bir makasla küçük bir cilt kesisi yapın ve daha sonra kavrama sternum kılıç şeklinde kıkırdak forseps kullanabilir. Kılıç şeklinde kıkırdak tutarken, koltukaltı için sternum, göğüs boşluğunun her iki tarafında kesi büyütmek. </li><li> Kalp maruz diyaframı kesin. <ol><li> Kan pıhtılaşmasını önlemek için doğrudan kalp apeksine heparin 0.ml enjekte edilir. </li><li> Sol ventrikül içine bir kanül yerleştirilmesine imkan vermek için tepe kesin ve daha sonra hızlı bir şekilde Hemostatik yardımı ile yerine kanül kelepçe. </li><li> İnce bir makas ile sağ atrium bir kesi yapmak ve hemen peristaltik pompa başlar. Atrium dışarı akan sıvının kan neredeyse ücretsiz ve karaciğer rengi açık kahverengi oluncaya kadar 0.1 M PB ile serpmek. Daha sonra, Solu serpmekhayvanın tüm vücut kadar paraformaldehid (0.1 M PB% 4) tion sertleşmektedir. </li></ol></li></ol> 4. Servikal Spinal Kord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık <ol><li> Kendi karın hayvan karkas yatırın. </li><li> Bir neşter ile vücudun orta hatta cilt kesin ve iliak kemik seviyesine kafatası tabanından yansıtmak. </li><li> Kesmek ve omurganın dorsal yönünü ortaya çıkarmak için paravertebral kaslar yansıtmaktadır. </li><li> Atlas, ikinci servikal segmentte (yani, C2) kemik spinoz sürecini tanımlayın ve ilgili temel dorsal kök bulmak için cerrahi rongeurs veya forseps bir çift ile çıkarın. <ol><li> Kalıcı keçe işaretleyici ile boyama sağ C2 kök tanımlayın. </li><li> Bir sonraki vertebra tek çıkarın ve alternatif renkler (yani, C2, C4, C6 ve C8 yeşil ve C3 renkli olabilir sağ dorsal kökleri işaretlemek, C5, C7, T1 col olabilirORed mavi). </li></ol></li><li> Küçük bir cerrahi iğne kullanın (örneğin, 30 G iğne) hafifçe delmek omuriliğin alt ucunu kaplayan dura aracılığıyla. Uzunlamasına yarık yapmak için rostrally iğne taşırken yukarı bakacak şekilde iğne eğim sayesinde, kordon uzak dura kaldırın. <ol><li> Dura Reflect. </li></ol></li><li> Yeni bir neşter bıçağı ile bir veya iki kademeli bloklar halinde omurilik enine doğru kesin. <ol><li> Dikkatlice iki komşu kökleri arasındaki neşter bıçağı yarım her bloğun sol tarafında küçük bir referans işareti yapmak, her blok için, in situ omurilik segmentleri bırakın ve. Blokların ventral görünür olması için referans işareti dokusu sayesinde yeterince derin olduğundan emin olun. Diseksiyon sonra doku parçasının oryantasyon yardımcı olmak için, hayvan anatomisi ile ilgili olarak, ya öne ya da arkaya doğru işaret eden, yaklaşık 45 ° &#39;lik bir açı ile referans işareti sağlayın. </li></ol></li><li> Paraformaldehitten (0.1 M PB% 4) çözeltisi içeren küçük, açıkça etiketlenmiş şişeler içine bireysel blokları toplayın ve RT O / N bırakın. </li><li> Sukroz (0.1 M PB% 30) ihtiva eden bir çözelti ihtiva eden, temiz, açık bir şekilde etiketlenmiş şişelerde blokları aktarın ve en az iki gün boyunca 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Cryo-kalıplar kesimleri yerleştirin ve doku dondurma ortamı ile onları kaplı. Boyuna histolojik hazırlanması için, yukarı bakacak şekilde dorsal bloklar yönlendirmek ve cryo-kalıplarda blok yönlendirmek için referans işareti kullanın. </li><li> -20 ° C&#39;de krio-kalıpları dondurun ve 50 um kalınlığında kesitler bir kriyostat ile kesilmiş. Not: bölümler doğrudan yapışma mikroskop slaytlar üzerine monte ve / N O kurumaya bırakılabilir. Seçenek olarak ise, bölümler 0.1 M PB ile doldurulmuş 48 oyuklu plakalar içinde yüzen edilebilir ve daha sonra, slaytlar üzerinde doku bölümleri yönlendirmek için referans işareti kullanılarak monte edilebilir. </li></ol> 5. Lomber Spinal Cord Diseksiyon ve Histoloji Hazırlık <ol><li> Geri geldi hayvan karkas yatırın. </li><li> Hayvanın karın boyunca bir orta hat kesi gerçekleştirin ve iç organları çıkarın. Vertebral kolonun ventral maruz arka karın duvarı kasları parçalara ayır. </li><li> T13 ventral kök kemiği çıkar kısa kuyruk-en kaburga ve onun bitişiğindeki T13 omur bulun. <ol><li> Ardışık T13 teker, iki veya üç omur rostral birini çıkarın (örneğin, T12, T11 ve gerekirse, T10) ince cerrahi rongeurs ile ventral kord ventral yönünde giriş noktası kadar T13 ventral kök takip etmek ve Kalıcı keçe işaretleyici ile işaretleyin. </li><li> Bu noktadan itibaren, alternatif renkler ile boyama, L1, L2, L3, L4, L5, L6 ve S1 için ventral kök giriş noktaları yerini belirlemek için aynı işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Lum için Bölüm 4,5-4,10 açıklandığı gibi aynı prosedürü uygulayınOmurilik diseksiyonu bar. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model.">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li><li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease.">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li><li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li><li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li><li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression.">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li><li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).</li><li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li><li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1/2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy).">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li><li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice).">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li><li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy.">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li><li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model.">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS.">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li><li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice.">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li><li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS.">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li><li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles.">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport.">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+Alternative+energy+for+neuronal+motors.">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li><li>Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.

İntramüsküler hedefleme ve nöromüsküler durumun deneysel tedavi için gelen α motor nöronlar terapötik transgenlerin sonraki retrograd transferi, yeni bir strateji değildir. Örneğin, bu dağıtım yöntemi SOD1 fareler ve sıçanlar 1,9-12 ALS ilerlemesi farklı aşamalarında olarak SMA 13 olan farelerde kas dejenerasyonu geciktirmek için kullanılmaktadır. Umut verici iken, bu gen terapisi senaryoları etkinliği sınırlı kalmıştır. Bu bağlamda, belkemiği ipliği motor nöron...

Böyle motor nöron hastalığı gibi nörolojik koşullar kaynaklanan ve spinal- istemli hareket yanı sıra Duchenne müsküler atrofi kontrolünün kaybı, etkilenen bireylerin günlük yaşamda yüksek ve uzun ömürlü bir etkiye sahip bir zayıflatıcı bir durumdur. Son on yılda, durdurmak ya da en azından bu nöromusküler hastalıkların zararlı etkilerini geciktirmek amacıyla araştırma çabalarının dünyadaki birçok klinisyen ve bilim adamı için bir öncelik olmuştur. Bu bağlamda, bu nöromüsküler hastalığı taklit hayvan modellerinin son nesil bu koşullar 1-13 gelişimi ve ilerlemesini altında yatan fizyolojik mekanizmaları temel anlayışlar elde vesile olmuştur. Bu nöromüsküler hastalığın tedavisi omurilik doğrudan erişim gerektirir ve omurilik enjeksiyonlar 14,15 ile elde edilebilir. Gen terapisinde son gelişmeler de üst ve çizgili kaslar hedef aldılar veomurilik 1,9-13 ventral boynuz içinde yer almaktadır karşılık gelen α motor nöronlar servis terapötik genlere alt ekstremite. Ancak, bu kez umut verici bir strateji bu nörolojik durumların sonuçlarını iyileştirmek için başarısız oldu. Bu kötü sonuçların olabileceği sonucuna adil olsa da, en azından kısmen, bu koruyucu genlerin düşük etkinliğine bağlı olduğu, kimse bu gen aktarım yöntemleri, düşük etkinliğini gözardı edilemez. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α kaynaklanan büyük periferik motorlu liflerin akson terminalleri girintilendirildiği iskelet myofibres uzman bölgeleridir. Birlikte, periferik sinir lifi uçları ve Parlamento üyeleri, yani nöromüsküler kavşak, sinaptik darbeleri nörotransmiterin ileriye salınımı, asetilkolin tarafından tetiklenen bölgesini oluşturur. Önemlisi, periferik sinir lifleri ve milletvekillerinin arasındaki ilişki iki Direc olduğunuarası, farklı motorlar yanı sıra uzak nörondan doğru moleküllerin ve organellerin taşınmasından sorumlu olmasına rağmen 16-18 somata. Bu anatomik düşüncelerin ışığında, AP üyeleri ilgili motor nöronlara teslimat ve genetik malzeme daha sonra geriye doğru taşınması için tercih edilen hedefler olarak görünmektedir. Bu bağlamda, bu motor nöron iletimi başarısı büyük ölçüde viral vektörler ve kasın AP üyeleri 19-20 intramüsküler enjeksiyon arasındaki mesafeye bağlı olması şaşırtıcı değildir. Ancak şaşırtıcı bir şekilde, laboratuar sıçan ve fare myofibres ilgili MEP bölgelerinin kesin konumu, seçim iki tür kas hastalıkları modellemek için, yakın zamana kadar mevcut değildi. Biz sıçan ve fare 21-22 çeşitli ön ayakları kaslar için MEP bölgenin kapsamlı haritalar üretmişlerdir. Daha yakın zamanlarda, biz MEP r organizasyonu detaylarını göstermiştirFare hindlimb 23 çeşitli kaslar için egion ve şu anda sıçan hindlimb milletvekilleri özelliklerini analiz ediyoruz. Bizim ellerde, bu kasların bütün MEP bölgelerine yönelik retrograd izleyiciler kas içine enjeksiyonlar önceden bildirilen daha omurilik segmentleri kapsayan vardır daha etiketli motor nöronlar doğurdu. Burada dış yüzeyinde yanı sıra hindlimb derinliği boyunca Avrupa Parlamentosu üyelerinin yerini ortaya koymak ve fare ve sıçan hem de kasları ön ayakları son birkaç yıldır geliştirilmiştir protokol mevcut.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Omurilik motor nöron bütünlüğünü etkileyen hastalıklar en zayıflatıcı nörolojik durumlar arasında yer almaktadır. Son on yıl içinde, bu nöromüsküler bozuklukların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi geciktirmek veya bu şartların ilerlemesini tersine çevirmeyi amaçlayan farklı tedavi senaryolar bilimsel topluluk sağlamıştır. Nöronların retrograd makine yararlanarak, bu yaklaşımlardan birisi omurilik motor nöronlarını karşılık gelen mekik terapötik genlerin amacıyla iskelet kasları hedef olmuştur. Bir kez umut verici olmasına rağmen, bu tür gen verici bir yaklaşım başarılı bugüne kadar elde etmek göstermiştir kalıt motor nöronların alt optimal sayısı engel olmuştur. Motor uç plakaları (MEP) motor nöronların α omuriliğe doğrudan sinaptik temas halindedir iskelet kas üzerinde son derece uzman bölgelerdir. Bu bağlamda, dikkat etmek önemlidir, şimdiye kadar, çabalar retrograd içinMotor nöron içine transfer genlerinin hedeflenen kaslarında MEP bölgenin konumu referans olmadan yapılmıştır. Burada basit bir protokol 1) iskelet kaslarında yüzeyinde milletvekillerinin tam yerini ortaya çıkarmak için ve 2), motor nöronların içine intramüsküler teslimat ve retrograd izleyiciler sonraki optimum retrograd taşıma yönlendirmek için bu bilgileri kullanarak açıklar. Biz Avrupa Parlamentosu üyelerinin hedefleme üzerinden omurilik motor nöronlar terapötik genlerin retrograd taşıma araştıran içine ileri çalışmalar bu izleme deneylerin sonuçlarını yararlanmak istiyoruz.

Asetilkolinesteraz histokimyasal boyama kaslarının genişliği boyunca motor uç plakaları yerini ortaya koymaktadır. 1 bütün sıçan ön ayakları üzerinde gerçekleştirilen bu tür boyama sonuçlarını gösterir Şekil. Bu, amonyum sülfit çözeltisinin konsantrasyonu optimize etmek için önerilmektedir (örn.,% 5-7 yerine% 10) da bir örnek çözelti içine daldırılmaktadır zaman olarak kas lifleri üzerinde spesifik olmayan arka plan boyaması çok ise, Aşır...

Watch this Scientific Journal Video about Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons at JoVE.com

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Motor End Plates boyunca İntramüsküler Enjeksiyonlar: Doğrudan Motor Nöronlar içine Servis Tarayıcıları Bir Minimal İnvaziv Yaklaşım

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Görüntüleme.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Video: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Nörobilim

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Sıçan Optik Sinir içine Enjeksiyon için minimal invaziv Tekniği

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Endoskopik Endonasal Trans-sfenoidal yaklaşım: Hipofiz adenomları için minimal invaziv cerrahi

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Gelişmekte olan beyin motor Cortex non-Invaziv modülasyon ve robotik haritalama

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...