This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Deneysel işlemler Thomas Jefferson Üniversitesi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış ve (86/609 / EEC ve 87-848 / EEC 2010/63 / AB), Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi, NIH Kılavuzu ile uyumlu yapılmıştır bakım ve laboratuar hayvanlarının kullanımı ve Nörobilim Araştırma Hayvanların Kullanımına İlişkin Neuroscience adlı Politikalar Derneği. 1. Bileşik kas Aksiyon Potansiyelleri (Cmaps) <ol><li> Hayvan hazırlanması: <ol><li> Enjeksiyonu (ketamin, ksilazin, asepromazin) etkisi veya teslim% 1-2 bir inhalant (izofluran) kullanarak sıçan anestezisi. Ketamin 95.0 mg / kg, 10.0 mg / ksilazin kg, 0.075 mg / kg asepromazin aşağıdaki gibi enjekte edilebilir anestezi dozajdır. NOT: Biz başarıyla hem inhalant kullanabilir ve bu CMAP kayıt protokolü yaparken enjektabl anestezi hiçbir tercihle, yaklaşımlar. </li><li> Hayvan uygun a muhafaza edilmelidirAmeliyat öncesi nesthetic derinlik ameliyatı sonucunda yoluyla başlatılır ve post-operatif buprenorfın kadar etkili almıştır. Bir geri çekme tepkisi ortaya olmadığını belirlemek için kısa ayak tutam tarafından uygun anesthetization onaylayın. Ayrıca, bir pamuklu çubukla kornea refleksi sınayın. Cerrahi işlem boyunca, kalp hızı ve solunum sayısı anestezi derinliği çok hafif hale geldiğini ileri süren artış olmamıştır belirlemek. </li><li> Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri bir veteriner merhem sürün. </li><li> Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin fırçalayın) ile / ellerini ona yıkamak gerekir. Cerrah, steril eldiven, yüz maskesi ve cüppe veya temiz laboratuvar önlüğü giymeli. Tüm enstrümanlar yıkanır ve ameliyat öncesi otoklava edilmelidir. Bu sterilizasyon işlemi tamamlandıktan doğrulamak için araçların seviyesinde otoklav önce alet kiti içinde bir sterilizasyon göstergesi şeridi ekleyin. Cerrah gerekirStrip tüm çizgi ameliyat başlamadan önce siyah olduğunu doğrulayın. Yanı sıra otoklav bandı gösteren kutunun dışını bantlayın. Cerrahi aynı gün birkaç hayvanlar üzerinde yapılacak olursa, ameliyatlar arasında aletleri temizlemek ve cam boncuk sterilizatör sterilize edin. Gerekirse, steril hemostatla aleti kaldırarak, uygun süre sterilizatör enstrümanın kolu yerleştirerek steril bir alanda soğutulması ve daha sonra fonksiyonel ucunu yerleştirerek cam boncuk sterilizatör enstrümanın iki ucunu sterilize zaman uygun bir süre için cam boncuk sterilizatör içine alet. </li><li> Hayvan anestezi edildikten sonra, aşağı dorsal yüzeyi ile cerrahi gemide ve böylece bant yukarı bakacak karın yerde cerrahi kuruluna hayvanın ön ayakları korumak için kullanılabilir. </li><li> Kafatasının dibinde başlayan ventral yüzey kaudal Tıraş ve orta hat her iki tarafında karın çevresi sh olduğundan emin olunaved hemi-diyafram kaydedilirken bağlı olarak hangi. Cilt traş yüzeyine povidon-iyot uygulayın. </li></ol></li><li> CMAP kayıtları için hazırlık: <ol><li> Kuyruk içine hayvan hazırlama, yer zemin elektrot deri altına takiben (Şekil 1). </li><li> Kontralateral alt karın bölgesi içine referans elektrot deri altına yerleştirin. </li><li> Kendinden yapışkanlı yüzey şerit veya disk kayıt elektrot (yüzey şerit elektrot boyutları: 0,5 x 3 cm) üzerine iletken jel yerleştirin ve sonra tek taraflı kot kenarı boyunca enine yüzey elektrodu yerleştirin. </li><li> Transkutanoz 0.5 cm arayla trakea lateral ve klavikula üstün uyarıcı elektrotlar yerleştirin. Deri yoluyla yaklaşık 1.0 cm derinliğinde elektrotlar yerleştirin. Onların yeri daha sonraki uyarılara ile hareket etmez, böylece elle elektrotlar sabitleyin. Not: yapışma yeri yerinde cilde 90 ° görece açı uyarıcı elektrotlarn. </li></ol></li><li> Bileşik kas Aksiyon Potansiyeli (CMAP) kayıtları: <ol><li> Bilgisayar destekli veri analizi ve ardından bir uyarıcısı / amplifikatör kullanarak elektrofizyolojik kayıtlar edinin. </li><li> Tek çekme stimülasyon uyaran parametreleri 0.5 msn, 1.0 Hz supramaksimal darbeleri olmalıdır. uyarıcı genlik V 6.0 ile 8.0 arasında (Şekil 2A) olmalıdır. NOT: Bir deney içinde, hayvanlar üzerinde aynı genlikli bir uyarıcı yoğunluğu kullanın. Amaç stimülasyon az genliği kullanarak yanıt genlik maksimize etmektir. Bu stimülasyon sırasında meydana ilk tepkisi bir uyarım eser olduğuna dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, bakımı daha sonra hızlı bir şekilde CMAP tepki izlemektedir stimülasyon artifakt sonra kararlı / yassı taban öncesinde bir CMAP tepki elde etmek için dikkat edilmelidir. Bu tür bir yanıt elde etmek için, bu uyarım yeniden konumlandırmak için gerekli olabilir ve / veyaKayıt elektrotları. </li><li> Uyarımlar arasında 30 saniye bekleyin ve ortalama yanıt (Şekil 2B - C) elde etmek için arka arkaya 10 uyarılmalara tekrarlayın. Pik (Şekil 2A), başlangıçtan genlik ölçün. Frenik sinir / diyafram aktif değilken hayvanın solunum döngüsünün aşamasında frenik sinir stimülasyonu yürütün. işlem karşı yarı-diyafram için aynı hayvan üzerinde tekrar edilebilir. </li><li> NMJ boyama yapılacaktır eğer son BKAP kayıt seansından sonra, hayvan serpmek. Yaklaşık bir kez aynı hayvan üzerinde defalarca her hafta CMAP kayıtları Davranış (ya da tercih aralığında). </li><li> Sağkalım CMAP kayıtları sonrasında, hayvan uyanık ve sternally yatarak kadar kurtarma sırasında dolaşan sıcak su ısıtma yastığı kurtarmak ve sürekli izlemek için izin verir. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. &lt;/ Li&gt; <li> Bir kez sternally yaslanmış, hayvana ilk 48 saat (günde bir kez bundan sonra) her 12 saat izliyoruz. (Siteleri döndürülmüş olan enjeksiyon başına 1-2 ml,,, deri altından laktatlı zilleri çözümü 2 günde kez) hayvan susuz (sarkık cilt, halsizlik) olarak görünüyorsa, sıvılar yönetmek ameliyat sonrası kilo ve sıvı kaybı stabilize kadar. Onlar tel çubuk kapak besleyici ulaşamadığı takdirde yeme teşvik etmek gerekirse, akut post-operatif dönemde küçük yemekler yumuşatılmış gıda ile hayvanların sağlamak. </li><li> Ameliyat sonundan önce 0.05 mg / kg bir dozda buprenorfin yönetme ve daha sonra 12 saat aralıklarla, ilk 24 saat boyunca (ve bundan sonra da ağrı / stres belirtileri bağlı) deri altı enjeksiyon yoluyla (Alanı döndürülmüş). Ağrı veya sıkıntı belirtileri sonra fark ise, buprenorfin hayvanları davranın. Gösterge ağrı / sıkıntı belirtileri aktivite eksikliği, vocalizations, yeme eksikliği veya içme (dehidratasyon), aşırı kilo kaybı, nöbet, exc dahilkemiren veya kesi yerinde tırmalama essive. Ağrı ve sıkıntı belirlenmesinde kullanılan ek ölçütler yabancı uyaranlara yanıtsızlık, geçici ya da sebepsiz seslendirme, yorucu veya anormal nefes, kalıcı kırmızımsı-kahverengi nazo-oküler akıntı, işaretli piloerection içerir. Ayrıca hasta hayvanlar öneririm kötü hijyen kanıt izlemek. Hayvan hala tedavi 72 saat sonra sıkıntı olduğu gözlenirse hayvan euthanize (yukarıda ana hatlarıyla ağrı / stres kriterlerine göre ve aldıktan sonra analjezik protokol yukarıda açıklanan). </li></ol></li></ol> 2. Diyafram Nöromüsküler Junction (NMJ) Analizler <ol><li> Hayvan diseksiyonu: <ol><li> Hayvana enjekte edilebilir anestezi aşırı dozda yönetme (:; intraperitoneal olarak uygulanmıştır 0.225 mg / kg ve 30.0 mg / kg, asepromazin de 285,0 mg / kg ksilazin ile ketamin 3 kez yukarıda kullanılan doz). Doz aşımı sonrasında, tüm hayvanlar t ötenazi (torakotomi) ikinci bir yöntem olmalıdıro ölüm sağlamak. Ölüm kalp ve solunum arrest gözlemleyerek ve hayvanın sabit ve dilate öğrenciler belirterek tarafından teyit edilmelidir. </li><li> Neşter veya diseksiyon makas kaudal orta hat boyunca zyphoid süreçten eksizyonu uzanan bir laparotomi yapınız. Dikkatle neşter ve forseps kullanılarak altta yatan kas deri ve bağ dokusu ayırın. </li><li> Zyphoid süreci yukarı çekerken, diyafram kemiği çevreleyen bağlı kalır sağlanması, bütün diyaframı kaldırmak için diseksiyon makas kullanın. O bütün diyaframın başarılı diseksiyon sağlayacak, diyafram kası zarar görmesini önlemek ve daha sonraki boyama için kas temizliğinde yardımcı olacak gibi bu çok önemlidir. Not: Gerekirse, bu noktada, hayvan perfüze edilebilir. </li></ol></li><li> Temizlik ve diyaframın boyama: <ol><li> Bütün disseke diyaframı aşağı pin, üstün yüzey cam 100 mm petri içinde silikon kauçuk, yukarı bakacak şekildeBir stereomikroskop kullanılarak 20 dakika boyunca -% 4 paraformaldehit (PBS,% 1 fosfat yapılan tamponlu tuz). O gergin hale getirmek için diyaframı gerin ve böcek pimleri kullanarak, diyafram kasını kendisi (Şekil 3) iğneleme önlemek için çevredeki dokuyu aşağı pin. </li><li> Dikkatle 5. forseps ve küçük makas ile kas sadece üstün yüzeyinden bağ dokusu temizleyin. NOT: Aksi belirtilmediği sürece, bu boyama protokolü yavaş yavaş ışık kaplı oda sıcaklığında sallanan sonraki tüm adımları uygulayın. Diyafram kası her zaman tamamen kurumasını önlemek için sıvı batık emin olun. </li><li> (0.2 1 x PBS,% 2 sığır serum albümini (BSA) / PBS BSA / PBS,% 4 paraformaldehit 1x PBS (PFA), ve% 0.2 TBP% 2 yapılır 0.1 M glisin: boyamadan önce, gerekli tüm reaktifleri hazırlanması 2% BSA / PBS) içinde% Triton X100. -20 ° C&#39;de metanol-serin öncesi emin olun. </li><li> 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x. </li><li> 2&#39;de yapılan 0.1 M glisin (inkübe% BSA, 30 dakika boyunca / PBS). </li><li> 15 dakika boyunca RBTX (rodamin-konjuge α-bungarotoxin) çözelti içinde inkübe edilir. Şöyle RBTX için çözüm: Rhodamine-konjuge a bungarotoxin 1: 1 x PBS içinde 400 dilüsyon. NOT: Bu protokol, rodamin kullanılır, ancak tercih edilen bir flüorofor boyanması için de kullanılabilir. </li><li> 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x. </li><li> -20 ° C dondurucu içinde, 5 dakika boyunca MeOH ile inkübe edin. NOT: dondurucuda kas yerleştirmeden önce MeOH ekleyin ve hemen kuluçka dönemi izleyen çözümü çıkarmayın. </li><li> 1 x PBS içinde 10 dakika boyunca yıkama 3x. </li><li> 1 saat süre ile% 0.2 TBP Blok (% 0.2 Triton% 2 BSA / PBS içinde yapılan). </li><li> Sallanan ise gece boyunca 4 ° C &#39;de primer antikor çözeltisi (% 0.2 TBP) ile inkübe edin. Antikorların çözeltiler aşağıdaki gibi: SV2 olduğunda (1:10) ve SMI-312 (1: 1.000). </li><li> % 0.2, TBP ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. </li><li> FGM1 (FITC-konjuge keçi anti-fare IgG-100 seyreltme: 1 kullanılarak ikincil antikor ile inkübe1 &#39;dir; 1 saat için sallanan ise% 0.2 TBP) yapılmış. NOT: boyama için protokol kalanı için ışıktan koruyun. </li><li> 1 x PBS ile 10 dakika boyunca yıkama 3x. </li><li> Yeniden temiz öncesinde montaj ve coverslipping kasın üstün (yukarıya bakınız) yüzeyinde bağ dokusunu çevreleyen. NOT: temizlemek ve sonra lekelenme hemen sonra örnek monte edilmesi tavsiye edilir. Ancak gerektiğinde, örnek 1 x PBS içinde kapsanabilir halinde, buharlaşmayı önlemek için parafilm ile sarılmış ve günlük PBS değişen, 1 haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilmiştir. </li><li> Cam slayt, sigara hardset Vectashield ile lamel üzerine monte üzerine. Kurumasını önlemek için net bir oje ile lamel kenarları mühür. Uzun vadede -20 ° C karton slayt klasörlerinde düz yalan Mağaza slaytlar. </li></ol></li><li> Analiz ve Konfokal Görüntüleme: <ol><li> Kantitatif lekeli morfolojisi analiz ve dik bir Epifloresans kullanarak 20X ve 40X büyütme altında hemi-diyaframı montemikroskop. NOT: Diyafram lekeli ve tüm montaj şekilde analiz olduğundan, kas oldukça kalındır. Statik görüntü olmayan konfokal floresan mikroskopi kullanılarak alındığında Sonuç olarak, floresan boyama çoğu tamamen odak dışında. Bu nedenle, bu sürekli düzgün bireysel NMJs her morfolojisi tanımlamak için &quot;yukarı&quot; ve &quot;aşağı&quot; kas içinden odaklanmasını sağlar olarak mikroskop üzerinde gerçek zamanlı olarak NMJ analiz yapmak en iyisidir. Onlar post-sinaptik reseptör kümelerine mekansal ilişki içinde doku yoluyla hareket olarak bu yaklaşımı kullanarak, kolayca bireysel motorlu akson yörüngesini takip edebilirsiniz. </li><li> Kas ventral-to-dorsal uzunluk ölçerek, belirli omurilik düzeyleri (Şekil 4H) topografik innervasyon şekillerine göre analiz için 3 ayrı bölüme kas bölün. </li><li> Kas ve mov ventral bölgede başlayandorsal ing, yüzey kas lifleri üzerinde bulunan yüz NMJs en tüm analiz. RBTX nedeniyle etiketlemek için kullanılan büyük antikorlar ile karşılaştırıldığında toksin küçük boyutu kas içine çok daha derin nüfuz (nedeniyle yoksul antikor penetrasyonu yorumlanması zor olabilir gibi daha derin yüzeyinden ilk 3-4 liflerden daha kaslar lifleri analiz etmeyin nöronlar). </li><li> Nöronun öncesi terminali akson çapı kalın ve sinir terminali bütün bölgeler tamamen altta yatan kas asetilkolin reseptörleri (AChRs) ile çakışıyorsa sağlam olarak her NMJ tanımlayın. </li><li> Altta yatan kas AChRs herhangi bölge sinir terminali karşılık gelen boş olup olmadığını kısmen Denerve her NMJ tanımlayın. </li><li> Olarak tamamen Denerve her NMJ tanımlayın eğer kas AChRs henüz gelen sinir terminali (bir sinir terminalinin olmaması nedeniyle sadece olmadığından emin olabilirsiniz böylece, odak aynı alanda etiketli nöronlar diğer NMJs olması da önemlidir poor kas bu bölgede antikor penetrasyon). </li><li> Birden fazla ön uç akson innerve bireysel NMJ (bu kavşakta denervasyon ve reinnervation olası girişimleri belli bir düzeyde yaşandığını gösterir) varsa her NMJ olarak çarpma innerve tanımlayın. </li><li> Olarak ince NMJ sinir terminali ve altta yatan AChRs arasında tam bir örtüşme vardır ama ince bir ön-uç akson varsa innerve her NMJ (bu da reinnervation de denervasyon ve girişimleri bazı düzeyinin göstergesidir) tanımlayın. </li><li> Her bir hayvan için, yukarıda NMJ tüm kategoriler için 3 belirlenen bölgelerin her biri için analiz yapıldı. Aynı deneysel grup için diğer hayvanlardan elde edilen sonuçlar, her bir hayvandan alınan verileri ortalama. Fare, hemi-diyafram sıçan yarı diyafram kası ve 150-200 Yaklaşık 200-300 birleşme deney grubu başına en az 3 (tercihen 5-6 veya daha fazla), hayvanlarda miktarı gerekmektedir. </li><li> Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüler elde, kullanımıkonfokal mikroskop ile yayına d. </li><li> 20-40 mikron derinliklerde 0.3 mikron adım boyutunda Z-yığınlarının edinin ve tüm sinaptik profil dahil olmasını sağlamak için yukarıda ve her kavşağın altında ilave optik bölümleri toplamak. </li><li> Maksimum yoğunluğu projeksiyonları içine z serisi görüntüleri yeniden satın alma yazılımını kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+parameter:+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+(an+evidence-based+review):+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology:+ALS+Practice+Parameters+Task+Force.">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li><li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection.">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li><li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li><li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spinal Cord Injury. , (2010).</li><li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions.">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li><li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration,+plasticity+and+adaptation.">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li><li>Gour&#233;vitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preB&#246;tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat.">The preB&#246;tzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li><li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury.">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li><li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats.">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li><li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury.">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li><li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung.">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li><li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice.">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS.">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Solunum fonksiyon solunum ve özellikle diyafram innervasyon hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, travmatik SKY ve ALS hem tehlikeye klinik olarak 5,6 alakalı. Kapsamlı solunum fonksiyonu çalışma için, bir birleşik yaklaşım yöntemi kullanılmalıdır. Cmaps dış frenik sinir stimülasyonu yoluyla diyaframın fonksiyonel inervasyonun derecesini ölçmek değil, endojen bulbospinal solunum sürücü 8. Buna ek olarak, bu kayıtlar, özellikle tek bir motor akson ve post-sinaptik asetilk...

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), üst ve alt motor nöron ve buna bağlı olarak, kas felci, hem kaybı ile bağlantılı bir zayıflatıcı motor nöron hastalığıdır. Tanı üzerine, hasta sağ kalım ortalama sadece 2-5 yıl 1 üzerindedir. Frenik motor nöron (PhMN) zarar ALS patogenezinde kritik bir bileşenidir. Hastalar sonuçta nedeniyle diyaframın PhMN innervasyonu, ilham 2,3 birincil kas kaybı ölmektedir. Travmatik omurilik yaralanması (SKY) da ilişkili solunum güçlüğü ile ciddi bir sorundur. SCI yaklaşık 12.000 yeni vaka nedeniyle omuriliğe travmatik hasar her yıl 4 oluşur. Konumu, türü ve şiddetine göre hastalık heterojenite rağmen, SCI vakaların çoğunluğu genellikle zayıflatıcı ve kalıcı solunum uzlaşma ile sonuçlanan servikal spinal kord, travma içerir. ALS ve SCI ek olarak, diğer merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları w ilişkilendirilebiliri&#39;inci diyafragma solunum fonksiyon bozukluğu 5,6. frenik sinir ipsilateral hemi-diyaframı innervates bir efferent motor sinir olduğunu ve aynı taraftaki servikal spinal kord C3-C5 düzeylerinde bulunan PhMN hücre gövdeleri kaynaklanır. PhMN çıkışı rostral ventral solunum grubunda (rVRG) 7 olarak bilinen bir bölgede beyin sapından bulbospinal girdi inen tarafından kontrol edilir. rVRG-PhMN-diyafram devre inspiratuar solunum yanı sıra diğer non-solunum diyafram davranışları kontrol merkezidir. Bu devrelere etkileyen çeşitli travmatik yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, solunum fonksiyon ve hastanın yaşam kalitesinde düşüşe derin yol açabilir. Diyafram nöromüsküler bileşke (NMJ) de rVRG, PhMN hayatta kalma, frenik sinir bütünlüğü ve uygun innervasyonunun gelen PhMNs girdi Azalan Normal diyafram fonksiyonu için gerekli tüm vardır. Bu teknikler istihdam nedenle önemli olduğunukantitatif ALS, omurilik yaralanması ve diğer merkezi sinir sistemi hastalıklarının, kemirgen modellerinde in vivo olarak bu devre değerlendirebilir. Bu protokol ile, hedef elektrofizyolojik ve morfolojik düzeyde hem de diyaframın PhMN innervasyonu değerlendirmek için deneysel araçları tanımlamaktır. Bileşik kas aksiyon potansiyelleri (Cmaps) verilen bir motor sinirin tüm efferent motor nöron aksonları uyarıcı ve daha sonra hedef myofibers bir ortaya çıkardı depolarizasyon tepkisini analiz ederek kaydedilir. Bu teknik, PhMNs 8 ile hemi-diyafram fonksiyonel innervasyon ölçmek için anestezi uygulanmış farelerde ve sıçanlarda in vivo olarak kullanılabilir. Nedeniyle Cmaps hemi-diyafram bütün, aynı zamanda hastalığa izlemek için diyafram NMJ bireysel motorlu akson ve myofibers fenotipleri incelemek yararlıdır tüm (ya da en azından birçok / en) myofibers eşzamanlı kayıt temsil gerçeği - ve bu tür parsiyel ve komple olarak tedavi açısından önemli morfolojik değişimlerte denervasyon, rejeneratif filizlenme ve reinnervation. Bu kas 9 genelinde bireysel NMJs detaylı morfolojik değerlendirmenin ardından, diyaframın tüm montaj immünohistokimya (İHK) üzerinden gerçekleştirilebilir. Cmaps birleştiren ve NMJ analiz nicel MSS ve PNS hastalığı kemirgen modellerinde diyafram innervasyon çalışmak için güçlü bir yaklaşım sağlamaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Yetişkin Sprague-Dawley sıçanları C4 omurilik düzeyinde 10-12 ya laminektomi sadece (yaralanmamış kontrol) veya tek taraflı hemi-kontüzyon SCI aldı. 5 hafta sonrası Ameliyatta, zirve CMAP genlik kaydedilen hemi-diyafram ölçüde laminektomi sadece kontrol (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında SCI sıçanlarda (Şekil 2C) azalmıştır laminektomi / yaralanma siteye ipsilateral. Hemi-diyafram tüm NMJs kontrol dışı hastalıklı yabani tip sıçanlarda <st...

Watch this Scientific Journal Video about Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons at JoVE.com

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Frenik Motor Nöronlar tarafından Diyafram İNNERVASYONU Fonksiyonel ve Morfolojik Değerlendirmesi

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K Görüntüleme.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

Video: Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Nörobilim

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Belirli Fonksiyonel İçsel Sinyal birleştiren tarafından neokorteks Mikro-etki ve İki foton Görüntüleme nöronlar Hedefli Etiketleme

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em&gt; Aplysia&#39;nın californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Siyatik Sinir Ezilme Hasarının Sıçan Modelinde Fonksiyonel Değerlendirme için 3D Kinematik Analiz

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Drosophila melanogaster'de Akson Ölümü Sırasında Aksonların ve Sinapslarının Morfolojik ve Fonksiyonel Değerlendirilmesi

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Morfolojik ve Proteomik Analiz için Embriyonik Superior Servikal Ganglia'dan Sıçan Sempatik Nöronlarının Culturing

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Sıçan Medial Gastroknemius KasTek Motor Üniteleri Fonksiyonel İzolasyon

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...