Yazarlar araştırma ve tesisler için destek ve finansman için doktora öğrencisi Dave Hartnell ve Bournemouth Üniversitesi kabul etmek istiyorum.

Moleküler Probe ve Akış Sitometre 1. hazırlanması <ol><li> Ultra saf süzüldü H2O gerekli konsantrasyonlarda alikuota dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 5 mM çözelti olarak tedarik edilir, nükleik asit prob, ana solüsyonları seyreltin </li><li> 25 o C kadar kullanım - -5 o C arasındaki karanlık koşullarda nükleik asit probları saklayın. </li><li> Akış sitometresi ve yük yazılım paketi açın (FCM özellikleri için Malzeme / Ekipman tabloya bakınız). </li><li> Numune enjeksiyon probu (SIP) boş bir hemoliz tüpü (12 x 75 mm) koyun, FCM temizleme işlemini başlatmak için geri floş sonra unclog ve tıklayın. NOT: SIP için bazı örnek aşamaları mikrosantrifüj tüpler dahil tüpler çeşitli barındırabilir. FCM tertibatında kullanılan moleküler prob seyreltici madde ve kılıf sıvısı analitik dereceli &quot;tip 1&quot; 0,22 um membran filtre kaynağı yer alıyor. </li><li> Yeri15 dakika karıştırıldı ve hızlı bir akışkan hızına (veya&gt; 66 | il / dakikalık bir akış oranı) - SIP, aşırı saf, süzüldü, H2O, 2 ml taze bir hemoliz tüpü 10 için bir zaman limiti belirlemek. </li><li> Arka plan gürültüsünü azaltmak ve &#39;koşmak&#39; tıklayın floresan ve ışık yayılımı kanallar hakkında eşikler koymak yeni bir veri hücresini seçin. </li><li> Saniyede toplam etkinlik üretici firmaların tavsiyelerine altında değilse, o zaman oruç 2 dakika süreyle dekontaminasyon solüsyonu 2 ml örneği çalıştırmak ve daha sonra 1.4 ve 1.5 adımları tekrarlayın. NOT: modelleri arasında değişebilir olarak, start-up protokolleri temizlik FCM için üreticilerin öneriler kontrol ediniz. Belirli eşikleri için test de bazı ekipman arttırmak veya optik dedektörler kaydedilen elektrik sinyali azalan photomultiplier tüpleri (Proje Yönetim Ekipleri) için gerilimler kazanımları uygulamak için izin verir FCM modeli ile uyumlu olması gerekir. Bu deney kullanılan FCM modeliment gerilim PMT sabit ve parçacıkları daha küçük 2.0 mm ve elektronik gürültü dışlamak için 80,000 ileri ışık yayılımı (FSC-H) bir eşiğini kullandı. </li></ol> Kültürler ve İlk Hücre Sayımı 2. Hazırlık <ol><li> 120 o C&#39;de 20 dakika boyunca 250 ml&#39;lik bir cam kaba alg ortam (x50 konsantrasyonu), aşırı saf, süzüldü H2O ve 2 ml Otoklav 98 mi </li><li> SIP kapsamında bir tüp içine, yüksek kararlı durum yoğunluğu yer örnek 2 ml M.aeruginosa (7806 PCC) bir ilk tarımı kaynaktan. Vorteks veya sonikasyon 20 herhangi bir koloni oluşumunu bölmekte ve ışık mikroskobu ile eşit dağılmış hücreleri onaylayın. NOT: Ultrasonik dalgalar aşırı maruz kalma hücre erimesi neden olabilir ve dikkatli kullanılmalıdır. Böyle yan ışık yayılımı olarak çıkışlar (M.aeruginosa gibi türlerde bulunan gibi) sonication gaz veziküller daraltabilirsiniz beri (SSC-H) yoğunluk se daha olabilirnsitive. </li><li> FCM yazılımı içinde, ileri ışık saçılım (FSC-H) verileri kaydetmek ve eksen üzerinde bir günlük ölçeğinde görüntülemek için &quot;log&quot; linkine tıklayarak arsa özelliklere yapılandırmak için bir histogram arsa seçin. </li><li> Ayrı bir çıkış, böyle M.aeruginosa bulunan aksesuar fotosentetik pigment phycocyanin (FL4-H, 675 ± 12.5 nm) gibi doğal floresan kaydetmek için (ekseni log) Başka bir histogram seçin. </li><li> Phycocyanin ve elde edilen floresan kaynaklanan emisyonları filtre bir dedektör heyecanlandırmak bir ışık kaynağı kullanın. NOT: fikosiyanin 600 nm üzerinde heyecanlı ve sadece kırmızı ışık kaynağı 21 ile tespit edilecektir ise fotosentetik pigment gibi klorofil olarak, yaygın olarak kullanılan 488 nm mavi lazer ile heyecanlı olabilir. Uyarma ışık kaynakları için akış sitometrelerinde üreticisi ve emisyon dedektörleri spektrumları, burada hem 488 nm ve 640 nm lazer ile kontrol ile birlikte kullanılmıştırBir 675 ± 12.5 nm optik filtre. </li><li> Hedef organizmanın (10 mikron) ve nispeten yavaş akış hızı (/ dak 14 ul) çekirdek büyüklüğüne yakın yüksek çözünürlük seçme ayarları kayıt için. NOT: En iyi çözünürlük örnekleri için saniyede olayların öneri üreten göre çalıştırılmalıdır. </li><li> Elde veri kapı dışarı ışık saçılımı ve / veya floresan sinyallerine bir eşik kullanmadan önce elektronik arka plan gürültüsü veya hücre numunesi enkaz neden olduğu. </li><li> Yeni bir veri hücre seçin bir günlük ölçeğinde FSC-H ve SSC-H parametreleri ile bir yoğunluk arsa oluşturmak ve çalıştırmak tıklayın. </li><li> Numune yoğunluğu aşırı olay oranı neden olursa, seyreltme adımlar doğruluk ve hassasiyetini arttırmak için alınabilir. </li><li> Yoğunluk arsa üzerinde arka plan gürültü ya da enkaz (FSC &lt;320000) tarafından üretilen düşük seviyeli dağılım sinyalleri, dışlamak için önceki histogram yazılım kapıları geçerlidir. Yüksek bağıl floresan Tersine kapısıfikosiyanin hücrelerinden gelen sinyaller ve sadece bu olayları (- 1950000 FL4, 56000) içerir. </li><li> Ml başına kaç hücre çalışmak, kapı alanlarda kaydedilen hücre sayısını kullanın ve FCM geçti numunenin toplam hacmine bölerek. Not: Burada kullanılan FCM modeli örnek hacmi belirlenecek sağlayan bir mikroişlemci kontrollü peristaltik pompa sistemi vardır. Diğer FCM ekipman kalibre boncuk süspansiyonu veya toplam Numune hacmini doğrulamak H 2 O ağırlık / hacim farklılıkları bir hesaplama gerektirebilir. </li><li> M.aeruginosa bir parti büyüme çevriminin (250,000 hücre / ml) başlatmak için taze olarak hazırlanmıştır ortama hücrelerin gerekli hacim. NOT: Türler yani bir toplu döngüsü yaşam döngüsü aşamaları belirlemek için önceden kaydedilmiş olmalıdır onların yerinde çevre parametreleri ve besin durumuna bağlı olarak büyüme oranlarında farklılık gösterir. </li></ol> 3. OptimMoleküler Probe Hücre Alımı ve zasyon <ol><li> M.aeruginosa kültür hasat yarım üslü fazda aşama 2&#39;de hazırlanan bir &quot;canlı&quot; bir kontrol olarak kullanırlar. NOT: Düz bir üstel faza yüksek yoğunluklu kültüründen seyreltilmiş numuneler bir başlangıç ​​gecikme / indüksiyon fazından aşılanan kültürlerin karşılaştırıldığında, ölü hücre ciro yoluyla optimizasyon sonuçlarını etkileyebilir. </li><li> 30 dakika 6,11,22 1 saat, paraformaldehid veya% 4 formaldehit 60 o C&#39;de yöntemleri gibi% 70 etanol, ısıtma örnekleri kullanarak, bir &quot;ölü&quot; bir kontrol olarak, diğer yarısı hazırlayın. Numuneler mikroçevrede varyasyonları (örneğin., PH) kontrol edin. NOT: M.aeruginosa pozitif, ısı ile öldürülmüş, &#39;ölü&#39; kontrol fikosiyanin sinyalleri onun azalması yoluyla &#39;canlı&#39; örnek ayrılır. Diğer yöntemlerle mortalite uyaran aynı çıktıyı neden olmayabilir ve bir yerdedirtürlerde y. </li><li> Farklı oranları kullanılarak karışık örnekleri kurmak &#39;canlı&#39; ve &#39;ölü&#39; örnekleri (örneğin,% 0,% 25,% 50,% 100). </li><li> Vorteks veya sonikasyonla koloni oluşumunu bölmekte ve pH&#39;ı kontrol edin. </li><li> Kendi ilgili dedektör vasıtasıyla fikosiyanin sinyalleri kaydetmek için 488 nm yeşil floresan gelen kaydedebilirsiniz dedektörleri yanında lazer (FL1, 530 ± 15 nm) ve portakal (FL2, 585 ± 20 nm) nükleik asit probları ve 640 nm lazer seçin. Not: DNA ya bağlandığı zaman turuncu bir nükleik asit sondası 570 nm 547 nm ve emisyon maksimumlar bir eksitasyon dalga boyuna sahip iken, yeşil bir nükleik asit probu, 523 nm 504 nm ve emisyon maksimumlar yaklaşık flüoresan uyarma dalga boyuna sahiptir. Bir 488 nm argon iyon katı hal lazer hem moleküler problar uyarmak için kullanılabilir, ancak, (547 nm kadar) yeşil bir lazer daha yüksek bir turuncu bir floresan üretir. </li><li> Başlangıç ​​noktası olarak tanıtmaküreticileri ile moleküler prob% 50 &#39;canlı&#39; ve% 50 &#39;ölü&#39; kültüre konsantrasyonunu tavsiye ve karanlıkta inkübe edin. </li><li> Yeni bir veri hücre seçin arka plan gürültüsünü (FSC-H 80000) azaltacaktır eşikleri ve tetikleyiciler ile SIP altına numuneyi yerleştirin. </li><li> FSC-H ve SSC-H parametreleri ve üç histogramlar ile yoğunluk arsa oluşturun. Ilgili moleküler prob optik detektör kanal (FL1 veya 2), tek bir fikosiyanin emisyonlarını (FL4-H) ve bir log ölçeğinde için diğer FSC H, bütün tespit etmek için kullanılarak, bir histogram. </li><li> Zaman noktalarında (1, 5, 10, 15, 30 ve 60 dakika) bir sayıda, ayrı bir veri hücrelerinde kayıt kadar 60 dakika boyunca karanlıkta nükleik asit probları ile M.aeruginosa örnekleri inkübe edin. NOT: Belirli kimyasalların potansiyel reaksiyonlar için üretmektedir ile pH kontrol gibi parametreler ayarlarken (test nükleik asit için bir tampon fosfat veya tek değerlikli veya diva yüksek düzeyde içeremez sondalarödünç katyonları, DNA bağlanma azalacaktır gibi). </li><li> İlgili floresan prob kanal histogram içine hücre boyutu organizmalar hedef - Bir yazılım kapısı sadece FSC-H histogram (1.500.000 320.000) dahil etmek uygulayın. NOT: Bu protokolde kullanılan konsantrasyonlar arttırılması veya M.aeruginosa numune veya nükleik prob başlangıç ​​stok çözeltisi hacmi azaldığı biri ile değiştirilebilir 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50 ve 100 uM idi. </li><li> Floresan prob kanalında en yüksek histogram tepe (- 1650000, turuncu FL2-H, 30.000 - Yeşil FL1-H, 240.000 165.000) başka herşey bir yazılım kapısı uygulamak ve daha sonra kapının o yoğunluk arsa içine pozitif prob floresan. </li><li> Moleküler prob konsantrasyonları (örneğin x 0.1 x 10) ve / veya sıcaklık ve pH düzeyini gerekirse ayarlanması,% 100 &quot;canlı&quot;,% 100 &#39;ölü&#39; ve tüm karışık kültür örnekleri ile 3.11 - Run 3.1 adımları tekrarlayın. </li> &lt;li&gt; nükleik aside ile boyanmış hücrelerin toplam yüzdesini bulmak için (yarım toplam FSC-H veya% 100 &#39;ölü&#39; kültüründen alınan) &#39;ölü&#39; hücreleri orijinal hücre yoğunluğuna pozitif moleküler prob floresan sinyalleri sayısını karşılaştırın Problar. </li><li> Non-spesifik boyama (bir Tek Yönlü Varyans Analizi veya Kruskal-Wallis tek yönlü analizi araçları kullanmak üretmeden hücre nükleik prob alımı en yüksek yüzdesi için en uygun protokol bulmak için her konsantrasyon içinde her süre için yapın, verileri) parametrik olmayan ise. </li></ol> 4. Moleküler Probe Floresan Ayrımcılık <ol><li> Intrinsik veya spesifik olmayan hücre boyama floresan girişim / örtüşme testi için 50% &#39;canlı&#39; ve% 50 &#39;ölü&#39; karışık kültür verilerini seçin ve tüm kapıları kapalı alır. </li><li> Sadece FSC-H histogram (320000 - 1500000) dahil etmek için bir yazılım kapısı uygulayın hedef için phycocyanin içine hücre boyutu organizmalarKanal histogram. </li><li> Kapısı &#39;ölü&#39; olarak etiketlenmiş düşük zirve ilavesi ile &#39;canlı&#39; olarak en yüksek fikosiyanin zirve ve etiket. </li><li> Ortalama dalga boylarını hem kayıt, &#39;canlı&#39; ve ardından &#39;ölü&#39; fikosiyanin (FL4) sinyalleri aynı anda birini kullanarak, ilgili moleküler prob floresans histogram kanalına başka bir kapı adımı gerçekleştirin. NOT: Bu deneyde mortalite başlatılması için mod bu protokol kapsamında açıkça fikosiyanin sinyallerini azaltır ısıl işlem, tarafından yapıldı. &#39;Ölü&#39; hücreleri üreten popülasyonlarının diğer yöntemler edinilen çalışır farklı çıkışları verebilir. </li><li> Oran pozitif moleküler prob floresan (&#39;ölü&#39;) ve içsel / spesifik olmayan sinyal (&#39;canlı&#39;) ortalama dalga boyları protokol hassasiyetini belirlemek için. NOT: &#39;canlı&#39; ve &#39;ölü&#39; popul floresan ayrımcılığı artırmak içinkus, hücre duvarı geçirgenliği ve elde edilen floresan sinyalleri 6 geliştirmek için besin tükenmiş hücreleri veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içinde Etkin leke alımı karbon kaynağı artar. Spektral örtüşme bazı FCM modellerinde sınırlı tazminat örnek edinme (PMT gerilim değişiklikleri) sırasında veya sonrasında analitik özel yazılım kullanıcı-manipüle ikili düzeltme yapılabilir. </li><li> &#39;Ölü&#39; en yüksek hücre miktarı oluşumu non-spesifik boyanması olmadan lekeli olmuştur optimize protokolü seçin. Testin bir numara varsa benzer sonuçlar iyi floresan sinyal ayrımcılık ile birlikte düşük konsantrasyon ve inkübasyon süresi ile protokol kabul. Takip sitometresinin kapatma işlemi için talimat üretmektedir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R., Barer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+and+Activity+in+Readily+Culturable+Bacteria:+A+Review+and+Discussion+of+the+Practical+Issues.">Viability and Activity in Readily Culturable Bacteria: A Review and Discussion of the Practical Issues.</a> Anton. Leeuw. Int. J. G. 73, 169-187 (1998).</li><li>Adams, D. G., Duggan, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tansley+Review+No.+107.+Heterocyst+and+Akinete+Differentiation+in+cyanobacteria.">Tansley Review No. 107. Heterocyst and Akinete Differentiation in cyanobacteria.</a> New Phytol. 144 (1), 3-33 (1999).</li><li>Lidstrom, M. E., Konopka, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Physiological+Heterogeneity+in+Microbial+Population+Behavior.">The Role of Physiological Heterogeneity in Microbial Population Behavior.</a> Nat. Chem. Biol. 6 (10), 705-712 (2010).</li><li>Dagnino, D., de Abreu Meireles, D., de Aquino Almeida, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Nutrient-Replete+Microcystis.+PCC+7806+Cultures+is+Inhibited+by+an+Extracellular+Signal+Produced+by+Chlorotic+Cultures.">Growth of Nutrient-Replete Microcystis. PCC 7806 Cultures is Inhibited by an Extracellular Signal Produced by Chlorotic Cultures.</a> Environ. Microbiol. 8 (1), 30-36 (2006).</li><li>Davey, H. M., Kell, D. B., Weichart, D. H., Kaprelyants, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+Microbial+Viability+Using+Flow+Cytometry.">Estimation of Microbial Viability Using Flow Cytometry.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter. Chapter 11, (2004).</li><li>Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life,+Death,+and+In-Between:+Meanings+and+Methods+in+Microbiology.">Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology.</a> Appl. Environ. Microb. 77 (16), 5571-5576 (2011).</li><li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+7,+Parameters+and+Probes.">Chapter 7, Parameters and Probes.</a> Practical Flow Cytometry. , 273-410 (2003).</li><li>Hammes, F., Berney, M., Wang, Y., Vital, M., K&#246;ster, O., Egli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-Cytometric+Total+Bacterial+Cell+Counts+as+a+Descriptive+Microbiological+Parameter+for+Drinking+Water+Treatment+Processes.">Flow-Cytometric Total Bacterial Cell Counts as a Descriptive Microbiological Parameter for Drinking Water Treatment Processes.</a> Water Res. 42 (1-2), 269-277 (2008).</li><li>Wang, Y., Hammes, F., De Roy, K., Verstraete, W., Boon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Past,+Present+and+Future+Applications+of+Flow+Cytometry+in+Aquatic+Microbiology.">Past, Present and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology.</a> Trends Biotechnol. 28 (8), 416-424 (2010).</li><li>Shapiro, H. M., Nebe-von-Caron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Flow+Cytometry+of+Bacteria.">Multiparameter Flow Cytometry of Bacteria.</a> Methods. Mol. Biol. 263, 33-44 (2004).</li><li>Peperzak, L., Brussaard, C. P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometric+Applicability+of+Fluorescent+Vitality+Probes+on+Phytoplankton.">Flow Cytometric Applicability of Fluorescent Vitality Probes on Phytoplankton.</a> J. Phycol. 47 (3), 692-702 (2011).</li><li>Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Viability+and+Antibiotic+Susceptibility+Testing+with+SYTOX+Green+Nucleic+Acid+Stain.">Bacterial Viability and Antibiotic Susceptibility Testing with SYTOX Green Nucleic Acid Stain.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63 (6), (1997).</li><li>Franklin, D., Airs, R., Fernandes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Senescence+and+Death+in+Emiliania+huxleyi.+and+Thalassiosira+pseudonana.">Identification of Senescence and Death in Emiliania huxleyi. and Thalassiosira pseudonana.</a> Cell Staining, Chlorophyll Alterations, and Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) Metabolism. Limnol. Oceanogr. 57 (1), 305-317 (2012).</li><li>Lebaron, P., Catala, P., Parthuisot, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+SYTOX+Green+Stain+for+Bacterial+Viability+Assessment.">Effectiveness of SYTOX Green Stain for Bacterial Viability Assessment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (7), 2697-2700 (1998).</li><li>Mikula, P., Zezulka, S., Jancula, D., Marsalek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Activity+and+Membrane+Integrity+Changes+in+Microcystis+aeruginosa.-+New+Findings+on+Hydrogen+Peroxide+Toxicity+in+Cyanobacteria.">Metabolic Activity and Membrane Integrity Changes in Microcystis aeruginosa.- New Findings on Hydrogen Peroxide Toxicity in Cyanobacteria.</a> Eur. J. Phycol. 47 (July), 195-206 (2012).</li><li>Regel, R. H., Brookes, J. D., Ganf, G. G., Griffiths, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+Experimentally+Generated+Turbulence+on+the+Mash01+Unicellular+Microcystis+aeruginosa+Strain.">The Influence of Experimentally Generated Turbulence on the Mash01 Unicellular Microcystis aeruginosa Strain.</a> Hydrobiologia. 517 (1-3), 107-120 (2004).</li><li>Kameyama, K., Sugiura, N., Inamori, Y., Maekawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+Microcystin+production+in+the+Cell+Cycle+of+Microcystis+viridis.">Characteristics of Microcystin production in the Cell Cycle of Microcystis viridis.</a> Environ. toxicol. 19 (1), 20-25 (2004).</li><li>Gustafsson, S., Hultberg, M., Figueroa, R. I., Rengefors, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Control+of+HAB+Species+using+Low+Biosurfactant+Concentrations.">On the Control of HAB Species using Low Biosurfactant Concentrations.</a> Harmful Algae. 8 (6), 857-863 (2009).</li><li>Bouchard, J. N., Purdie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperature,+Darkness,+and+Hydrogen+Peroxide+Treatment+on+Oxidative+Stress+and+Cell+Death+in+the+Bloom-Forming+Toxic+Cyanobacterium+Microcystis.">Effect of Elevated Temperature, Darkness, and Hydrogen Peroxide Treatment on Oxidative Stress and Cell Death in the Bloom-Forming Toxic Cyanobacterium Microcystis.</a> J. Phycol. 47 (6), 1316-1325 (2011).</li><li>Reynolds, C. S., Jaworski, G. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+Natural+Microcystis+Populations.">Enumeration of Natural Microcystis Populations.</a> Br. Phycol. J. 13 (3), 269-277 (1978).</li><li>Marie, D., Simon, N., Vaulot, D., Andersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoplankton+Cell+Counting+by+Flow+Cytometry.">Phytoplankton Cell Counting by Flow Cytometry.</a> Algal culturing techniques. , 253-268 (2005).</li><li>Assun&#231;ao, P., Antuees, N. T., Rosales, R. S., de la Fe, C., Poveda, C., Poveda, J. B., Davey, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+method+for+the+assessment+of+the+minimal+inhibitory+concentrations+of+antibacterial+agents+to+Mycoplasma+agalactiae.">Flow cytometric method for the assessment of the minimal inhibitory concentrations of antibacterial agents to Mycoplasma agalactiae.</a> Cytom Part A. 69, 1071-1076 (2006).</li><li>Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting+of+Heterogeneous+Microbial+Populations:+The+Importance+of+Single-Cell+Analyses.">Flow Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations: The Importance of Single-Cell Analyses.</a> Microbiol. rev. 60 (4), 641-696 (1996).</li><li>Franklin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explaining+the+Causes+of+Cell+Death+in+Cyanobacteria:+What+Role+for+Asymmetric+Division?.">Explaining the Causes of Cell Death in Cyanobacteria: What Role for Asymmetric Division?.</a> J. Plankton Res. 36 (1), 11-17 (2013).</li><li>Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Davey, H. M., Kell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Analysis+of+the+Physiological+Heterogeneity+within+Starved+Cultures+of+Micrococcus+luteus.+by+Flow+Cytometry+and+Cell+Sorting.">Quantitative Analysis of the Physiological Heterogeneity within Starved Cultures of Micrococcus luteus. by Flow Cytometry and Cell Sorting.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1311-1316 (1996).</li><li>Waggoner, A., Melamed, M. R., Lindmo, T., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+for+cytometry.">Fluorescent probes for cytometry.</a> Flow cytometry and sorting. , 209-225 (1990).</li><li>Gray, J. V., Petsko, G. A., Johnston, G. C., Ringe, D., Singer, R. A., Werner-washburne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Sleeping+Beauty&#34;:+Quiescence+in+Saccharomyces+cerevisiae.">&#34;Sleeping Beauty&#34;: Quiescence in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68 (2), 187-206 (2004).</li><li>Keer, J. T., Birch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Methods+for+the+Assessment+of+Bacterial+Viability.">Molecular Methods for the Assessment of Bacterial Viability.</a> J. Microbiol. Methods. 53 (2), 175-183 (2003).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

15,19,22,23 - moleküler problar kullanılarak yayın artan sayıları, güvenilir ve bilgilendirici veriler 5,6,8 elde edilebileceğini gösterir. Henüz itibarıyla aynı konsantrasyon ve kuluçkalama süresi 6,10 Tüm türler arasında etkili olabilir hücre canlılığı için mükemmel bir leke yoktur. Değişmiş floresan emisyonları ile prob hatta aynı tip doğru konsantrasyon ve inkübasyon süresi (Tablo 1 ve 3) kurmak için bir gereksinim olduğunu...

Hücre sürekli fizyolojik parametrelerini değiştirerek ve işlevini değiştirerek çevreye yanıt karmaşık bir sistemdir. 3 - izogenik mikrobiyal nüfus doğada ve laboratuar hem de nüfus dinamikleri bile nispeten sabit çevresel koşullar altında meydana gelen 1, alt popülasyonlar gelişimi etkilenir. Doğal mikrobik topluluk değişkenliği nedeniyle çevre koşullarının oldukça değişken doğası ortaya çıkmaktadır. Bunlar bazen stokastik süreçler sonradan nüfus ortalamasına çok farklı subpopülasyonunun üretirler. Son kanıtlar bu fizyolojik alt popülasyonlar çevresel koşullara farklı tepki ve dramatik etkiler ve genel nüfus 3,4 etkileyen sinyal bileşikleri veya inhibitörleri üretebilir ortaya koymuştur. Bir nüfus içinde heterojenliği tanımlamak için bir yöntem oluşturulması un anahtarıdırÇeşitli ortamlarda mikroplar ekolojisini ların önemli ve heterocysts gibi özel hücrelerin geliştirilmesi, çevresel dalgalanmalara tepki olarak morfolojik heterojenlik gösterir ağır etkiler insan su güvenliği konusunda. Türler gibi Anabaena gibi toksik Microcystis gibi, sıkıntı siyanobakterilerin bilgi oluştururken gereklidir ve akinetes 2. Buna karşılık, Microcystis hücreleri stres yanıtı sırasında belirgin morfolojik heterojenliğini görüntüler yok. Canlı ve cansız hücreler arasında ayrımcılık fizyolojik farklılaşmanın en önemli yönüdür ve mikrobiyal populasyon dinamiği daha iyi anlaşılmasını verir. Ancak, bakteriyel canlılığı kendisinin kavramsal sorunu zor ve kötü 1,5,6 karakterize kalır. Flow sitometri (FCM) tek tek hücrelerin analiz güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Tek hücreli fizyo anlayışı artırmak içinFCM aracılığıyla logy moleküler problar metabolik ve biyokimyasal süreçlerin 7 bir dizi ayırmak için kullanılmıştır. Bu hücresel ve nüfus düzeyinde türlerin artan bilgiye açtı ve sırayla su kaynakları yönetimi 8,9 yardımcı oldu. Bununla birlikte, organizmalar, moleküler prob tasarımı ve protokolü uygulaması 6,10,11 bir dizi yol açan hücre duvarları ve zarlarına gözenekler ve pompalar, moleküler prob alımı ve efflux bakımından farklılık gösterir. Ticari ve araştırma amaçlı kullanılabilir moleküler problar genellikle çok farklı hücre tipine uygulanabilir genel bir protokol ile temin edilmektedir. Bir başka 6&#39;ya bir hücre tipi için geliştirilen protokoller transferinde çok dikkatli olmalı, etkin kullanımdan önce moleküler problar optimize etmek önemli bir görev bu nedenle. Yeşil ve turuncu bir nükleik asit probları en az bir baz ile çift ve tek sarmallı nükleik asit hem bağlama seçinivity ve hücrelerin plazma zarı bütünlüğünün değerlendirmek için kullanılır. Yeşil bir nükleik asit probu, hücre canlılığının bir göstergesi olarak hareket edebilir örneğin propidium iodide bazlı bileşikler 12 gibi diğer moleküler problar, kıyasla belirgin bir şekilde daha iyi hücre etiketleme floresan sinyalini alır. Terimi hücre canlılığı, &#39;burada, DNA parçalanma, plazma zan bütünlüğü kaybı sonra meydana varsayar. Nükleik asit probları üç pozitif ücretleri ile simetrik olmayan siyanin boyalar ve hem de ökaryotik ve prokaryotik 11,13 14,15 organizmalarda karakterize konsantrasyonlarda altında intakt membranlı hücrelere giremez. Nükleik asitlerin bir nükleik asit sondasının bağlanması, bunların zar bütünlüğü tehlikeye sahip hücrelerde endojen sinyallerden flüoresans emisyonlarının a&gt; 500 misline kadar artış ile sonuçlanabilir. Örneğin yeşil bir nükleik asit prob olarak moleküler problar tek hücre fizyolojisinin iyi bir göstergesi olabilir, ancak, bir ihtiyaç vardır tYalnız Microcystis deneylerde 0.5 uM 15 - - 0,1 mcM 30 dakika ve konsantrasyon aralıkları - 19 inkübasyon süreleri 7 dk arasında değiştiği gibi o, amaçlanan hedef organizmanın her prob optimize. Burada yeşil sitometrik deneyleri ve (bugüne kadar siyanobakteriyel türler M.aeruginosa üzerinde test edilmemiştir) nispeten yeni turuncu nükleik asit probları optimize etmek bir protokol mevcut. Aşağıdaki gelişmiş metodoloji sonra diğer türlere aktarılır ve böylece mikropların anlayış ve ekolojik davranışları artırarak, diğer moleküler problar protokolleri optimize etmek için bir platform olarak kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="926">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:168px;">Cyanobacteria Media</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">C3061-500ML</td>
			<td style="width:501px;">BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Decontamination Fluid</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>653155</td>
			<td>Run for 2 mins when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 &#181;L/min.&#160; Followed by 2mins of sheath H2O.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A (by request)</td>
			<td>BD Accuri C6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S7020</td>
			<td>Nucleic acid stain &#8211; 5mM solution in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYTOX Orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S11368</td>
			<td>Nucleic acid stain &#8211; 5mM solution in DMSO</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

molecular probe optimization to determine cell mortality in a photosynthetic organism (microcystis aeruginosa) using flow cytometry

Saha ve laboratuvar çalışmaları mikrobiyal alt popülasyonlar morfolojik ve fizyolojik parametrelerin yüksek heterojenite görüntülemek için gösterilmiştir. Mikropların hücre bölünmesi ve metabolik faaliyetler azalır sayede atıl durumda, var gibi bir mikrobiyal hücre gerçek zamanlı durumunu belirlemek, canlı ya da ölü kategorilerde ötesine geçer. Genel nüfus canlılığı belirlemeye yardımcı olmak için hızlı ve doğru bir yöntem moleküler problar ile tespit ve mikropların ölçümü ihtiyacını, sitometri (FCM) akış sağlar Verilen. Membran bütünlüğünü algılamak için bir model siyanobakterilerin olarak Microcystis aeruginosa SYTOX Yeşil ve SYTOX Turuncu kullanarak, tek bir hücre ölümlerinin hızla endikasyon için bir transfer yöntemi geliştirmek. Actio karşılaştırılabilir moduna sahip benzer bir eksitasyon ve emisyon dalga boyları ile diğer ürünlerin olmasına rağmen, bu derginin içinde kullanılan moleküler problar (sırasıyla yeşil ve turuncu bir nükleik asit problarının anılacaktırön probları belirtilen n, biz özellikle) başvurun. Moleküler problar kullanılarak protokoller konsantrasyon ve inkübasyon süreleri esas olarak farklı türler arasında değişiklik göstermektedir. M.aeruginosa yola Bu protokol izlenerek, yeşil bir nükleik asit probu 30 dakika kuluçkalama ve 10 dakika sonra 1 uM turuncu bir nükleik asit probu sonra 0,5 uM konsantrasyonlarında optimize edilmiştir. Membran hasarı olan hücrelerin raporlama altında yol açtı belirtilen optimum az Her iki probları konsantrasyonlarda. Bunun aksine, her iki sondalarda 5 uM konsantrasyonları ve daha yüksek &#39;canlı&#39; hücreler &#39;canlı olmayan hücreli bir sayı üzerindeki gösterimine neden hedef floresan ürettiği ve böylece spesifik olmayan lekelemeye bir tür, sergiledi. Kontrol nesil uygunluğu tartışma konusu olmaya devam rağmen pozitif kontroller (ısı ile öldürülmüş), sınanabilir ölü biyokütle sağladı. Yeşil ve turuncu nükleik asit probları biz de optimize etmek için adımlar mantıklı bir dizisini gösterereketkin bir siyanobakteriyel fizyolojik durumunu analiz etmek için kullanılabilecek bir protokol oluşturmak için nasıl monstrate.

Üslü fazda bir M.aeruginosa toplu kültüründen İleri doğru ışık saçılımı (FSC) ve yan ışık dağıtma (SSC) çıkışları, sırasıyla, hücre boyutu (çapı) ve iç boyu bilgileri (Şekil 1A) içerir. FSC M.aeruginosa olmak için çok büyük ve / veya küçük olan hücreleri ayırabilir. Bu ayrımcılık veya yolluk bir FSC çıkışı (Şekil 1C) belli noktaları arasındaki rafine verilerle yapılabilir. Kırmızı ...

Watch this Scientific Journal Video about Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry at JoVE.com

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar.

Moleküler Probe Optimizasyonu (a Fotosentetik Organizmaya Hücre Ölümlerini belirleme<em&gt; Microcystis aeruginosa</em&gt;) Akım Sitometri Kullanımı

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

8.8K Görüntüleme.  Bournemouth University.  Mikrobiyal popülasyonları genel davranışı dikte edebilir önemli hücre heterojenitesini içerir. Flow sitometri ile Moleküler prob analizi ancak uygulama türler arasında değişir, hücrelerin fizyolojik durumlarını belirlemek. Bu çalışma küçümseyen ya da yanlış pozitif sonuç kayıt olmadan, doğru bir siyanobakteryumdur nüfus içinde hücre ölümlerini belirlemek için bir protokol sağlar. 

Video: Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological conditions including parasitic infection, inflammation, traumatic stress, graft-versus-host disease, diabetes and cancer1-7. In mice, MDSC express Mac-1 (CD11b) and Gr-1 (Ly6G and Ly6C) surface antigens7. It is important to note that MDSC are well studied in various tumor-bearing hosts where they are significantly expanded and suppress anti-tumor immune responses compared to na&iuml;ve counterparts7-10. However, depending on the pathological condition, there are different subpopulations of MDSC with distinct mechanisms and targets of suppression11,12. Therefore, effective methods to isolate viable MDSC populations are important in elucidating their different molecular mechanisms of suppression in vitro and in vivo.
Recently, the Ghansah group has reported the expansion of MDSC in a murine pancreatic cancer model. Our tumor-bearing MDSC display a loss of homeostasis and increased suppressive function compared to na&iuml;ve MDSC 13. MDSC percentages are significantly less in lymphoid compartments of na&iuml;ve vs. tumor-bearing mice. This is a major caveat, which often hinders accurate comparative analyses of these MDSC. Therefore, enriching Gr-1+ leukocytes from na&iuml;ve mice prior to Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) enhances purity, viability and significantly reduces sort time. However, enrichment of Gr-1+ leukocytes from tumor-bearing mice is optional as these are in abundance for quick FACS sorting. Therefore, in this protocol, we describe a highly efficient method of immunophenotyping MDSC and enriching Gr-1+ leukocytes from spleens of na&iuml;ve mice for sorting MDSC in a timely manner. Immunocompetent C57BL/6 mice are inoculated with murine Panc02 cells subcutaneously whereas na&iuml;ve mice receive 1XPBS. Approximately 30 days post inoculation; spleens are harvested and processed into single-cell suspensions using a cell dissociation sieve. Splenocytes are then Red Blood Cell (RBC) lysed and an aliquot of these leukocytes are stained using fluorochrome-conjugated antibodies against Mac-1 and Gr-1 to immunophenotype MDSC percentages using Flow Cytometry. In a parallel experiment, whole leukocytes from na&iuml;ve mice are stained with fluorescent-conjugated Gr-1 antibodies, incubated with PE-MicroBeads and positively selected using an automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Next, an aliquot of Gr-1+ leukocytes are stained with Mac-1 antibodies to identify the increase in MDSC percentages using Flow Cytometry. Now, these Gr1+ enriched leukocytes are ready for FACS sorting of MDSC to be used in comparative analyses (na&iuml;ve vs. tumor- bearing) in in vivo and in vitro assays.

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells MDSC from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting AutoMACS

This is a rapid and comprehensive method of immunophenotyping Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) and enriching Gr-1+ leukocytes from mouse spleens. This method uses flow cytometry and AutoMACS Cell Sorting to enrich for viable Gr-1+ leukocytes prior to FACS sorting of MDSC for use in vivo and in vitro assays.

Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

MDSC are a heterogeneous population of immature macrophages, dendritic cells and granulocytes that accumulate in lymphoid organs in pathological ...

Tıp

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle degeneration1, 2. In patients, the ability of resident muscle satellite cells (SCs) to regenerate damaged myofibers becomes increasingly inefficient4. Therefore, transplantation of muscle progenitor cells (MPCs)/myoblasts from healthy subjects is a promising therapeutic approach to DMD. A major limitation to the use of stem cell therapy, however, is a lack of reliable imaging technologies for long-term monitoring of implanted cells, and for evaluating its effectiveness. Here, we describe a non-invasive, real-time approach to evaluate the success of myoblast transplantation. This method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes (firefly luciferase [fluc], monomeric red fluorescent protein [mrfp] and sr39 thymidine kinase [sr39tk]) whose expression can be imaged with different imaging modalities9, 10. A variety of imaging modalities, including positron emission tomography (PET), single-photon emission computed tomography (SPECT), magnetic resonance imaging (MRI), optical imaging, and high frequency 3D-ultrasound are now available, each with unique advantages and limitations11. Bioluminescence imaging (BLI) studies, for example, have the advantage of being relatively low cost and high-throughput. It is for this reason that, in this study, we make use of the firefly luciferase (fluc) reporter gene sequence contained within the fusion gene and bioluminescence imaging (BLI) for the short-term localization of viable C2C12 myoblasts following implantation into a mouse model of DMD (muscular dystrophy on the X chromosome [mdx] mouse)12-14. Importantly, BLI provides us with a means to examine the kinetics of labeled MPCs post-implantation, and will be useful to track cells repeatedly over time and following migration. Our reporter gene approach further allows us to merge multiple imaging modalities in a single living subject; given the tomographic nature, fine spatial resolution and ability to scale up to larger animals and humans10,11, PET will form the basis of future work that we suggest may facilitate rapid translation of methods developed in cells to preclinical models and to clinical applications.

A non-invasive means to evaluate the success of myoblast transplantation is described. The method takes advantage of a unified fusion reporter gene composed of genes whose expression can be imaged with different imaging modalities. Here, we make use of a fluc reporter gene sequence to target cells via bioluminescence imaging.

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell (CTC) Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the presence of circulating tumor cells (CTCs). These rare cells have been demonstrated to be of clinical significance in metastatic breast, prostate, and colorectal cancers. The current gold standard in clinical CTC detection and enumeration is the FDA-cleared CellSearch system (CSS). This manuscript outlines the standard protocol utilized by this platform as well as two&#160;additional adapted protocols that describe the detailed process of user-defined marker optimization for protein characterization of patient CTCs and a comparable protocol for CTC capture in very low volumes of blood, using standard CSS reagents, for studying in vivo preclinical mouse models of metastasis. In addition, differences in CTC quality between healthy donor blood spiked with cells from tissue culture versus patient blood samples are highlighted. Finally, several commonly discrepant items that can lead to CTC misclassification errors are outlined. Taken together, these protocols will provide a useful resource for users of this platform interested in preclinical and clinical research pertaining to metastasis and CTCs.

Adaptation of Semiautomated Circulating Tumor Cell CTC Assays for Clinical and Preclinical Research Applications

Circulating tumor cells (CTCs) are prognostic in several metastatic cancers. This manuscript describes the gold standard CellSearch system (CSS) CTC enumeration platform and highlights common misclassification errors. In addition, two&#160;adapted protocols are described for user-defined marker characterization of CTCs and CTC enumeration in preclinical mouse models of metastasis using this technology.

Klinik ve Klinik Öncesi Araştırma Uygulamaları Tümör Hücre (CTC) Tahliller Sirkülasyon semiautomated adaptasyon

The majority of cancer-related deaths occur subsequent to the development of metastatic disease. This highly lethal disease stage is associated with the ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

Formation Odak: bir hücreye dayalı tahlil, bir genin onkojenik potansiyeli belirlemek için

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Süspansiyon Retina pigment epiteli Hücreleri sunun Kemirgenler Subretinal Enjeksiyonları Sahne

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Electrophysiological Measurement of Noxious-evoked Brain Activity in Neonates Using a Flat-tip Probe Coupled to Electroencephalography

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. In non-verbal patients, it is very difficult to measure pain, even with pain assessment tools. Those tools are subjective or determine secondary physiological indicators which also have certain limitations particularly when exploring the effectiveness of analgesia. As cortical processing is essential for pain perception, brain activity measures may provide a useful approach to assess pain in infants. Here we present a method to assess nociception with electrophysiological brain activity recordings optimized for the use in newborn infants. To produce highly standardized and reproducible noxious stimuli we applied mechanical stimulation with a flat-tip probe, e.g., PinPrick, which is not skin-breaking and does not cause behavioral distress. The noxious-evoked potential allows the objective measurement of nociception in non-verbal patients. This method can be used in newborn infants as early as 34 weeks of gestational age. Moreover, it could be applied in different situations such as measuring the efficacy of analgesic or anesthetic drugs.

Measuring pain in non-verbal patients is a challenge. In this study we combine EEG recording with stimulation using a flat-tip probe to detect noxious-evoked brain activity in an objective manner.

Ventilasyon elektroansefalografi için birleştiğinde bir düz uçlu sonda kullanarak zararlı uyarılmış beyin aktivitesinin Elektrofizyolojik ölçüm

Pain is an unpleasant sensory and emotional experience. In non-verbal patients, it is very difficult to measure pain, even with pain assessment tools. ...