This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

Hayvan bakım İsviçreli yerel yetkililer (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, onay NRS. 52/11 ve 35/14) tarafından onaylanan kurallarına uygun olarak yapıldı. Bu yönergeler Avrupa Topluluğu Direktifi 2010/63 / AB ile uyum içindedir. Not: Steril aletler ve çözümleri ile bir laminer akış kaputu Çalışma tüm adımlar 1 - alt adımlara dahil 5. ÇÇA hazırlanması 1. Not: taraflı çevre, bir cam alt tabaka, mikro-işlenmiş metal elektrot ve bir SU-8, polimer yalıtım tabakasının oluşmaktadır (. Ayrıca Tscherter ark 3&#39;e bakın). Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, ticari olarak mevcut ÇÇA&#39;lar özelleştirilmiş elektrot dizisi düzeni (Şekil 1 A ve B) ile emredildi. 68 elektrotlar elektrotlar ücretsiz 300 mikron genişliğinde oluk, Elek iki bölgeye bölünmüş olan bir dikdörtgen ızgara şeklinde düzenlenmiştirical yol açar ve yalıtım. Her bir elektrot büyüklüğü 40 x 40 mm olan ve merkezden merkeze 200 um ile birbirinden aralıklıdır. Dört büyük toprak elektrotları kayıt sitenin etrafında konumlandırılmış. Onlar kendi boyutunda (21 mm x 21 mm) piyasada mevcut diğer standart ÇÇA farklı ve sabit bir kayıt odasına sahiptir. <ol><li> En az 30 saniye, her% 100 etanol (2x),% 70 etanol (1 x) ve damıtılmış su (2x) dezenfeksiyon durulama ölçümü için. Kurumaya bırakın. Temiz bir cam petri (150 mm x 25 mm) 12 ölçümü ve kapağını kapatın - 10 koyun. </li><li> 120 ° C de 20 dakika süreyle otoklavlanmaktadır ölç. Oda sıcaklığında saklayın. </li><li> -20 ° C&#39;de ölçümü ve mağaza alikotları kaplama solüsyonu (maddeler listesine bakınız) hazırlayın. </li><li> Bağımsız bir steril petri kabı (35 mm x 10 mm), her MEA koyun. </li><li> Elektrotların üstüne 150 ul soğutulmuş kaplama çözümü koymak ve petri kapağını kapatmak için bir soğutulmuş pipet kullanın. Yaklaşık 10 dakika sonra, üst hava kabarcıkları kontrolGerekirse elektrotlar ve yavaşça bir lastik kaplı spatula ile çıkarınız. Oda sıcaklığında 1 saat bekletin. </li><li> Aspire kaplama çözeltisi kalıntıları, damıtılmış, steril su ile doğum öncesi ve embriyonik nöronlar ve 2x için optimize ortamı ile 1x yıkayın. Taraflı çevre ertesi güne kadar kullanılmadığı takdirde, kuluçka O / N 37 ° C&#39;de damıtılmış, steril su içinde tutmak. Aksi takdirde, oda sıcaklığında direkt olarak kurumaya bırakın. </li></ol> Organotipik Kültürleri Hazırlanması ve Büyüme İçin Gerekli Malzemeler 2. <ol><li> Kalsiyum içermeyen yıkama solüsyonu (malzeme listesine bakınız) hazırlayın. </li><li> Yaklaşık 20 dakika boyunca 3000 x g&#39;de, (kabarcıkların oluşumunu önlemek, hafifçe sallayarak, 1: 1) santrifüj ve steril bir tüpe açık bir içerik süzün yıkama çözeltisi içinde, tavuk plazma sulandırın. Kısım -20 ° C&#39;de cryotubes ve mağaza içine 200 ul. </li><li> Buna göre sığır plazması (200 U / ml) ve steril-filtre (0,2 um gözenek filtresi) trombinin sulandırın. Cryt içine kısım 200 ul-20 ° C&#39;de otubes saklayın. </li><li> 30 kültürler için besleyici ortam 100 ml (malzeme listesine bakınız) hazırlanması. </li></ol> 3. Omurilik Doku Diseksiyon 25 için embriyo, omurilik dilimlerinin sayısına bağlı olarak, Prosedür verim - 35 ko-kültür ve steril koşullar altında, bir laminar akış başlığı içinde hazırlanır: Not. <ol><li> Kas içine enjeksiyon yoluyla ana hayvana pentobarbital (0,4 ml) içindeki bir öldürücü doz uygulanır. Pedal çekilme refleksi kontrol ederek derin anestezi onaylayın. Başları kesilerek sezaryen ve fedakarlık ile E14 sıçan embriyolar sunun. </li><li> Steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş bir petri kabına embriyoların organları aktarın. </li><li> Arka ayaklarında üstünde bir neşter ve ön ayakları üstünde başka biriyle tam bir çapraz kesim yapın ve vücuttan bacaklarda çıkarın. Sonraki frontal düzlemde bir kesim spinal co içeren arka parça viserayı ayırmak için yapmakrd. </li><li> Dilimlemek için, bir montaj disk üzerinde bir seferde omurilik biri içeren parçaları geri aktarın ve 225 kalınlığında kesilmiş - Bir doku kıyıcı ile 250 mikron. Doğranmış doku üzerinde yıkama çözeltisi bir damla koymak ve 35 mm steril, soğutulmuş, yıkama çözeltisi ile doldurulmuş x 10 mm petri kaplarına bir spatula ile dilimleri aktarın. </li><li> Ayrı ayrı dilim için, doku kalan uzak omurilik teşrih. Ekli dorsal kök ganglionlar bırakın. </li><li> Dilimleri 4 ° C&#39;de 1 saat bekletin. </li></ol> 4. ÇÇA üzerinde Omurilik Doku Dilimleri Montaj <ol><li> Inkübatör, steril besin ortamı Isınma (37 ° C, hafifçe oksijenlenme için kapağı sökülebilir). </li><li> Odak elektrod dizi stereo bir mikroskop altında bir petri oda sıcaklığında kauçuk kaplı uçları steril cımbızla Pozisyon MEA. Temiz tozsuz ve steril elektrot dizisinde tavuk plazma 6 ul damlacık ortalayın. Dikkatlice kaydırın, küçük bir spatula kullanarakventral taraf plazma damlacık içine birbirine bakacak şekilde iki omurilik bölümleri. Spatula ile elektrotlara dokunmayın. </li><li> Tavuk plazma damlacık etrafında trombin 8 ul ekleyin. Trombin pipet kullanarak dikkatlice karıştırın ve iki dilim etrafında tavuk plazma / trombin karışımı yayıldı. Yine, doğrudan kırılgan elektrot dizisi dokunmayın. Sadece koagülasyon önce, aşırı tavuk plazma / trombin aspire. </li><li> MEA / kültür takımı, 37 ° C&#39;de inkübatör içinde nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 1 saat süre ile oturur yüksek nem tutmak için petri Cap. </li><li> Dikkatle petri kap ve yaklaşık 30 dakika süreyle tekrar inkübatör içine koymak, kültür odası besin ortamında 10 ul ekle. </li><li> Bir silindir tüp içine steril, kauçuk kaplı uçları her MEA / kültür tertibatını yerleştirin 3 besin ortamının ml ve sıkıca kapatın kapağı ekleyin. % 5 CO 2 inkübatör rpm - 1 dönen silindir tambur roller tüpü yerleştirin <su37 ° C&#39;de b&gt; 2-ihtiva eden bir atmosfer. </li><li> Haftada 2 kez - in vitro 7 gün (DIV) ve daha sonra 1 sonra besin orta yarısı değiştirin. </li></ol> 5. Mekanik Lezyonlar <ol><li> Odak doku ile stereo mikroskop altında besin ortamı olmadan bir petri silindir tüp ve yersiz steril, kauçuk kaplı ipuçları MEA / kültür takımını atın. Görme iki dilim kaynaşmış doğrulayın. </li><li> MEA kauçuk kaplı ipuçları cımbız yerleştirerek montaj sabit MEA / kültür tutun. </li><li> Doku dilimleri yakın MEA oluk bir neşter bıçak yerleştirin. Yerine yatay neşter tutun. </li><li> Neşter kadar idare ancak neşter bıçak tabanından bıçak &quot;rulo&quot; ipucu ve böylece oluk kapsayan doku içinden keser o şekilde MEA oluğuna kalmana izin kaldırın. </li><li> 25 G iğne ucu necess ise şiddetli herhangi bir kalıntı doku bağlantılarıli. Oluk içindeki alanda sadece iş ve ihale kenarları dokunmayın. </li><li> Silindir tüp içine geri MEA / kültür tertibatını koyun. Kültürlere taze besin ortamının 3 ml sağlayın ve inkübatör silindir tambur içine geri koyun. </li></ol> Spontan Faaliyet 6. Elektrofizyolojik Kayıtlar <ol><li> DIV seçilen sayıdan sonra iki omurilik dilim arasındaki fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için, bir mikroskop bir kayıt odasındaki MEA / kültür tertibatını monte ve yaklaşık 500 ul hücre dışı çözüm (malzeme listesine bakınız) uygulanır. </li><li> Sistem stabilize etmek için izin ilk kayıttan önce 10 dakika bekleyin. </li><li> RT&#39;de MEA her aktivite tespit elektrottan yaklaşık 10 dakika süreyle Tutanak temel spontan aktivite 2x. </li><li> Istikrarlı dışı koşulları sağlamak her kayıt seansından sonra hücre dışı çözüm alışverişinde. </li><li> Ağ disinhibit için, hücre-dışı çözelti, co geçerlidirstriknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ntaining. Kayıt başlamadan önce en az 2 dakika bekleyin. </li></ol> 7. Veri analizi Not: ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyellerinin tespiti için her bir elektrodun standart sapmaları ve sonraki diskriminatör dayalı bir dedektör kullanmak. Bu prosedür, Tscherter ve ark., 3 detaylı olarak tarif edilmektedir. <ol><li> Standart prosedürlerle 3 (Şekil 1F) uygun bir tarama planı her elektrotun tespit nöronal aktivitenin gösterir. </li><li> Belirleyin ve 1 msn adımlarla kaydırılır 10 msn kayar pencere içinde uygun kanallar olayların sayısını toplanarak her bir dilim için toplam ağ etkinliğini görüntüler (Şekil 1G ve Tscherter ve ark., 3). </li><li> Her dilim ayrı patlamaları (birkaç elektrotlar üzerinde görünen faaliyet kümeleri) algılamak. Bu nedenleKarşılık gelen toplam ağ etkinliği minimal zirve faaliyeti eşiğini ayarlamak ve her patlama başlangıç ​​ve patlama sonunu tanımlar. Örneğin, uygun bir eşik ortalama patlama genliği% 25 ve bir patlama başlangıç ​​olarak bir zaman penceresinde son olay olmanın en az 5 ms, bir patlama bitiş bir zaman penceresinde ilk etkinlik olma tanımlanabilir en az 25 milisaniye (HEIDEMANN ve ark. 10). </li><li> Fonksiyonel rejenerasyon iki dilim arasında senkronize patlamaları yüzdesini hesaplamak ölçmek için. Bunu yapmak için, bir dilim bir patlama ve diğer dilim aşağıdaki kaymasının arasındaki gecikmeyi hesaplamaktadır. Not: gecikme ortalama patlama uzunluğundan daha küçük olduğunda bir patlama çifti olarak adlandırılan &quot;senkronize&quot; dir. Özellikle birçok aktivite ile ko-kültürlerde olasılığı her iki tarafın tesadüfen seçilen gecikme pencerede bir patlamasını başlatılmasını dair kanıtlar vardır. Bu durum, sy yüzde miktarının dikkate alınmalıdırnchronized patlamaları. Hesaplamalar ayrıntılı bilgi için Heidemann ve ark bakın. 10. </li></ol> Kültürler ve İmmünohistokimya 8. Tespit <ol><li> Yıkama veya inkübasyon dahil tüm adımlar için doku içinden çözümün doğru yayılmasını sağlamak için bir devirme masaya kültürleri koymak emin olun. </li><li> Kayıt oturumu kurulumu dışında MEA / kültür takımını almak bittikten sonra doğrudan, bir petri (35 mm x 10 mm) koymak ve yaklaşık 2 ml ekstrasellüler çözüm ekleyin. </li><li> In vitro süre boyunca oluşmuş çevreleyen hücre katmanlarından dilimleri ayırmak için, 10 ul pipet alabilir ve dilimleri daire. Kültürleri zarar vermemeye dikkat edin. Bu aşamasını atlamak ancak gerçekleştirildiğinde daha sonra gömme kolaydır mümkündür. </li><li> Ince bir ametal şırınga iğne kullanın dışı soluti ile dolu bir 1 ml şırınga ile birlikte (materyalleri listesi bakınız)yavaşça MEA kapalı kültürünü darbe için. </li><li> Pasteur pipet ucu çıkarın ve slivered ucundaki lastik ampulü takınız. (Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 0.1 M) ile% 4 paraformaldehit) fiksatif içine kültür aktarmak için arka uç kullanın. Çok küçük ve kültürler katlanmış olacak ve muhtemelen tahrip çünkü transferi için Pasteur pipet ucu standart kullanmayın. 4 ° C&#39;de 2 saat - 1 saptamak için. Distile su ile durulayın ve MEA parmak uçları ile doku artıkları çıkarmak ama çivi ile çizmeyin. 4 ° C&#39;da damıtılmış su içinde mağazası ÇÇA&#39;lar </li><li> En az 10 dakika her biri PBS içinde 3 kez yıkanır Kültürlerin. 4 ° C de PBS içinde saklayın veya doğrudan boyama işlemi ile başlar. </li><li> Çözeltisi (% 5 keçi serumu,% 1 sığır serum albümini, PBS içinde% 0.3 deterjan) bloke en az 90 dakika boyunca kültürler inkübe edin. </li><li> Bloke çözeltisi içinde seyreltilmiş birinci antikor ekleyin ve 4 ° C &#39;de 3 gece inkübe edilir. </li><li> L at için PBS içinde yıkayın 3xdoğu 30 dakika her. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat süreyle PBS içinde seyreltilmiş ikinci bir antikor ekleyin. </li><li> En az 30 dakika her biri için PBS içinde yıkama 3x. </li><li> Bir nesne slayt kaldırılmış ucu ile Pasteur pipeti ile dilimleri aktarın. Aşırı PBS çıkarın ve orta montaj embed. </li></ol>

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Sunulan prosedürde çeşitli unsurlar doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır. ÇÇA&#39;lar, çözeltilerin hazırlanması ve dilim kültürlerinin üretimi sırasında tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Onlar kendiliğinden aktiviteyi 14 etkileyebilir çünkü antibiyotikler besin ortamına uygulanmaz. MEA kaplama sırasında, en önemli kısmı ekstrasellüler matriks jel çözüm her zaman soğuk kalır emin olmaktır. Buzdolabında ve tüm işlem için buz üzerinde tutmak o çözülme 0 ° C&#39;ye yakın bir maksimal sıcaklığını sağlamak için. Buz soğuk diseksiyon tamponlar kullanarak düşük sıcaklığa dilim hızlı izolasyon ve kesit hazırlanması yanı sıra ödeme dikkat sırasında sağlıklı kültürlerin yüzdesini arttırır. Ayrıca, plazma / trombin koagülasyon en kritik adımlardan biridir. İlk olarak, plazma düzgün Mixe emin oluntrombin d. İkinci olarak, ÇÇA için dilimler düzgün eki sağlamak için mümkün olduğunca fazla kalıntı kaldırılması için özel dikkat. Bu adım son derece zaman duyarlıdır; zaman çerçevesi çok kısa ise, plazma / trombin karışımı çok fazla kaldırılır. Zaman çerçevesi çok uzunsa, pıhtılaşma zaten artık plazma / trombin ile birlikte dilimleri kaldırarak riskini artıran oldu. Mekanik lezyonlar planlanan, bu doğru bir tasarıma sahip ÇÇA kullanmak önemlidir. Lezyon amaçlanan alan elektrotlar, teller ve yalıtımın serbest olması gerekir. Aksi takdirde, MEA elektrik hasarlı ve bu nedenle, hiçbir kayıtlar artık yapılabilir gidiyoruz. Başka önemli bir adım lezyonun boyutunu ilgilidir. Bu lezyon sonrası iki genç dilim bağlamadan iki gün 10 alır, daha önce gösterilmiştir. Tüm deneyler için, kural uzay betwe olduğu kullanıldılezyon sonrası dilimleri en MEA oluk (300 um) genişliğinden daha büyük olması gerekir. Lezyon hiçbir yeniden bağlanma hiç, çok büyük ise A büyük lezyon boyutu, yeniden bağlanma için daha uzun bir zaman dilimi içinde sonuçlanabilir veya olabilir. Açıklama, eski deneyler ortaya koyduğu çok düşük bağlantı hızı bir başlangıç ​​iki dilim yerleştirilmesi daha uzağa 1 mm&#39;den sonuçları. Bunun yerine kuluçka 37 ° C kayıtları, oda sıcaklığına kadar, en az 10 dakikalık bir ayar süresi, başlamasından önce, ve hücre dışı çözeltiye yerine yetiştirme ortamı önerilmektedir. Bu ilk dakika boyunca faaliyet desen yakın gözlem ölçülen veri kayıt başlandı uygun sonra kültür patlaması modelini temsil sağlar. Aktivite, veri toplama ve ileri işleme tespiti için, ev yapımı donanım, Lab programları (, amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları odasına kayıt)GÖRÜNTÜSÜ, C ++, IgorPro kullanılır. Ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Burada, elektrotlar tarafından görülen sinyaller 1001 defa büyütülmüş ve daha sonra 6 kHz hızında dijitalize edilmiştir. In vivo, onlar artan ve lif yolları azalan müdahalesi olmadan çalışmak zordur, çünkü sunulan model propriyospinal bağlantıları incelemek için yararlı bir araç olabilir. İki omurilik dilim eş kültür zarif bu sorunu aşmak olabilir. Kültürler sıkı kontrol ve kolayca manipüle edilebilir bir mikro sağlamak. Öte yandan, Supraspinal ve duyusal giriş eksik tabii ki. Buna ek olarak, kültür hazırlama süreci CNS hasar durumu temsil etmektedir. Astrositler ve mikroglia gibi glial hücreler, bu nedenle artan proliferasyon ve lezyonlarda yanıt bilinmektedir, doku yeniden bir ölçüde olduğunu. Sunulan moda İlişkinmekanik lezyonlar gerçekleştirdikten sonra l glial skar oluşumu gözlenmemiştir. Bir açıklama astrositlerden adaptif mekanizmalar zaten hazırlık sürecinde tetiklenen olduğunu ve kültürlerin lezyonları daha da tepkiye neden olmadığını olabilir. Ayrıca, myelin ilişkili inhibitörlerinin katılımı için, örneğin herhangi bir kanıt yoktur., Nogo-A, eski bir yaşta lezyonlu kültürlerin düşük rejenerasyon potansiyeli. Bununla birlikte, Rolipram, dilim 10 arasında 23 DIV artar fonksiyonel rejenerasyon lezyon gerçekleştirdikten sonra, başlangıçtan fosfodiesteraz 4 inhibitörü ile muamelenin gördü. Bu sonuçlar, fonksiyonel iyileşme eski kültürlerde artabilir göstermektedir. Lezyon sitesini kapısı akson sayısını sayarken Gözle, genç yaşta Lezyonlu kültürler ve eski bir yaşta lezyonlu kültürler arasında hiçbir fark tespit edilmiştir. Bu bulgular aksonal rejenerasyon bu eksikliği en önemli nedeni f değil önermekveya bu nedenle kültür geç lezyonlardan sonra iyileşme kaybı ve yenilenme fonksiyonel analiz sağlayan bir model için gerekliliğini vurgulamaktadır. Sinaptik oluşumu ve sinaptik plastisite kurtarma işlemi 10 önemli bir rol oynayabilir. Bu mekanizmalar son yıllarda çok ilgi kazandı ve günümüzde yaygın olarak onlar omurilik hasarı sonrası sonucun üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, izolasyon ve çok detaylı bu süreçleri araştırmak için kararlı şartları sağlayan bir model kesinlikle omurilik fonksiyonel dönüşüm konusunda fikir edinmek için yardımcı olabilir.

Merkezi sinir sisteminde (CNS) Organotipik dilim kültürler nöron gelişmeden nörodejenerasyona ulaşan muhtelif fizyolojik ve patolojik fenomenler incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrışmış hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim sağlam bir hücre mimarisini ve yerel sinaptik devresi ile daha fazla karmaşıklık avantajı sunuyoruz. Aynı zamanda, dokuya in vivo bağlamda bütünün karışıklık bulaştırmak için gerek kalmadan bir izole edilmiş şekilde analiz edilebilir. Ayrıca, tercih edilen hücrelere kolay ve tekrar erişim garanti edilir hücre dışı ortamı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve genellikle in vitro modelleri, in vivo göre daha az maliyetlidir. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar mukabil yaşayan hayvanların 1,2 karşı uzun vadeli kültürlerinin gelişim profiller arasında çarpıcı benzerlikler sundu. Çeşitli merkezi sinir sistemi regio bu nöronal devreler gösterilmiştirns geliştirme sırasında spontan ağ etkinliğini ifade ve organotipik dilimleri kısmen bu fenomeni 3 -7 korumak. İzole spinal kord hazırlıkları özellikle ritim nesil 6 ve nöronal devrelerin 1 oluşumunu araştırmak için kullanılmıştır. Organotipik dilim spontan aktivite kayıt için bir yol çoklu elektrot diziler (ÇÇA) üstünde kültürüne onları etmektir. Bu cihazlar çok sayıda eşzamanlı hücreleri (multi-unit kayıt) aksiyon potansiyelleri tarafından oluşturulan hücre dışı potansiyelleri izleyebilirsiniz birden elektrotlar içerir. MEA kayıtları yüksek zamansal çözünürlüğü verilen nöronal devrenin içinde kesin aktivite dinamiklerini yeniden kullanılabilir. Ayrıca, aksine yama-sıkma tekniği nöronlar davranışlarında etkilenmez gerçeği uzun vadeli ölçümleri ve sonuçları izin veren, non-invaziv olduğunu. Fya da Bu çalışmanın amacı, omurilik organotipik ko-kültür ve çoklu kayıtları kombinasyonu omurilik içinde fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için kullanıldı. Yetişkin yüksek omurgalıların omuriliğin hasar kurtarmak için potansiyeli sınırlı olduğundan, farklı stratejiler omurilik yaralanması sonrası rejenerasyon teşvik etmek çalışılmıştır. Şimdiye kadar, kortikospinal yolu genellikle bu tür soruşturmaların için seçim model sistem olmuştur. Bu deneyler genellikle zaman alıcı, pahalı ve sonucu tek gruplar içinde yüksek değişkenliğe büyük hayvan kohortlardan gerektirir. Dahası, kanıt propriyospinal bağlantıları (tamamen omurilik içinde sınırlıdır nöronlar) omurilik lezyonları 8 Aşağıdaki toparlanma sürecine çok önemli bir rol oynayabilir düşündürmektedir. Bu elyaflar artan ve elyaf yolları azalan müdahalesi olmadan, in vivo çalışma zordur. Bonnici ve Kapfhammer 9, uzunlamasına omurilik kullanılanalternatif bir yaklaşım olarak doğum sonrası farelerin dilim kültürleri. Mekanik lezyonlar yaptıktan sonra onlar yarı kantitatif omurilik segmentleri arasında akson morfolojik rejenerasyonu analiz. Onlar olgun yaşta kesilen kültürlerde lezyon sitesini kapısı az değil hiçbiri aksonlar gözlemlenmiştir. 7 gün sonra, hasar - Buna karşılık, daha genç bir aşamada lezyonlu sonunda kültürler 5 aksonal rejenerasyon yüksek miktarda gösterilir. Ancak, fonksiyonel bağlantıları için kanıt sundu değildi. Bu nedenle, fonksiyonel rejenerasyon soruşturma sağlar propriyospinal liflerin vitro model bir temsilcisi gelişimi omurilikte rejeneratif süreçleri ile ilgili bilgimizi genişletmek için değerli bir araç olabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

E14 fare embriyonlarının omurilik türetilmiş ko-kültürler fonksiyonel iyileşme potansiyeli araştırmak için, lezyon 28 DIV 8 bir zaman penceresi içinde yapıldı. 2 ila 3 hafta sonra, kendiliğinden nöron faaliyeti ÇÇA (Şekil 1 C ve D) ile kaydedildi. Ekstraselüler kaydedilen aksiyon potansiyelleri, her bir elektrot (Şekil 1E) çevrimdışı tespit edilmiştir. Ağ etkinlik araziler takip raster araziler oluşturulan bu verilerin (Şekil 1F), Dan yan (Şekil 1G) başına ayrı ayrı toplam aktiviteyi görselleştirmek için. Her dilim spontan aktivite genellikle öbekler halinde düzenlenmiştir. Dilimler işlevsel bağlıysa, bu patlamaları bir dilim diğer yaymak olabilir. Bu nedenle, iki dilim arasında senkronize kaymalarının miktarı kantitatif fonksiyonel rejenerasyon ölçmek için hesaplandı. Nasıl dönüşüm int ayrıntılı bilgi içinFarklı araziler o yapılır ve senkronize aktivitenin yüzde hesaplama formülü türetilmiştir nasıl, Heidemann ve ark., 10 bakınız edilir. Tüm deneylerde, etkinliği ilk standart koşullar altında kaydedilmiştir. İkinci bir aşamada, sinaptik inhibisyonu, hücre dışı banyo çözeltisine striknin (1 uM) ve gabazine (10 uM) ilave edilerek bloke edilmiştir. Bu disinhibisyon patlamaları tanımını ve böylece dilimleri arasındaki patlama senkronizasyon belirlenmesini kolaylaştırır uzamış patlamaları ve patlama aralıklarla daha düzenli bir aktivite deseni, genellikle yol açar. Genç yaşta lezyonlu Kültürler - kültürleri sonraki aşamalarda (&gt; 19 DIV) (Şekil 2 A yenilemek yeteneği belirgin bir azalma gösterdi de lezyonlu ise (7 9 DIV) 2-3 haftalar lezyon sonra senkronize aktivitenin yüksek miktarda görüntülenen - F). Bu bulgular rejenerasyon yeteneği olduğunuspinal kord kesit kültürlerinde işlevsel bağlantıların kültür üç hafta içinde in vivo olarak daha gelişmiş olan, temsil eden düşük bir seviyeye, in vivo olarak embriyonik durumu temsil eden yüksek düzeyde azalır. Bağlantıların ne tür aslında iki dilim arasına daldı eşitleme katılıyor? Propriyospinal bağlantıları yanı sıra, lifler de motonöronlar veya dorsal kök ganglion nöronlarının ortaya çıkabilecek. Bu omurilik 10 dilimler arasındaki dorsal kök ganglion nöronları fonksiyonel bağlantı hakkında olmadığını önceden gösterilmiştir. Bununla birlikte, motor nöronlar dahil olması olasılığı kalmıştır. Motor nöronlar nikotinik reseptörlerin 13 ile omurilik nöronlarına kolinerjik bağlantılar oluşturmak bilindiğinden, omurilik ko-kültürler aktivitesi 8 DIV, kültürler yüksek aktivitesi 10 senkronize göstermektedir bir anda ve nikotinik antagonist Mecam kaydedilmiştirilamin (MEC, 100 uM) hücre-dışı banyo çözeltisine ilave edildi. Iki dilim arasındaki bağlantının motor nöronlar bir katılımı senkronize bir aktivite azalması yüzdesi ile sonuçlanacaktır. Ancak, bu durumda değildi (MEC: 91.0 ± 4.5% n = 7; kontrolü: 93.6 ± 4.6%, n = 7, p&gt; 0.05, Wilcoxon eşleştirilmiş çifti testi). Bu sonuçlar kolinerjik sinaps dilimler arasındaki fonksiyonel bağlantının katkıda olmadığını göstermektedir. Motor nöronlar, aynı zamanda merkezi sinir sistemi 11, 15 içindeki sinapslarda glutamat salgılamaktadır gösterilmiştir Bununla birlikte, bu deneyler, tamamen katılımlarını dışlamaz. SMI-32 uygulandı ile motonöronlar olmayan fosforile nörofilaman H karşı immünohistokimyasal lekelenmelerinin tespit etmek. Bu dilim (Şekil 3A) üzerine dağıtılmış motonöronlar için tipik birçok etiketli büyük hücre gövdeleri, ortaya koymuştur. SMI-32 antikoru motoneuro hücre gövdelerini etiketlemek için bildirilmiştirns 12 ve bu bulgu da kullanılabilir kültürler 13 için de geçerlidir. Ayrıca, B-III-tubulin veya neun yanı sıra glial hücre gövdeleri, örneğin. Karşı genel örneğin nöronal hücre gövdeleri, bir renklendirmeler, GFAP antikoru ile astrositler diğer raporlar doğrultusunda ve (bu hücre tiplerinin morfolojik açıklamalarını maç Şekil 3 B - D). Bununla birlikte, SMI-32 antikoru ile akson etiketlenmesi (Şekil 3E) ile ilgili olup. Beklentilerin aksine, bu antikor kullanarak liflerin büyük bir ağ görünür ve fosforile nörofilaman H (Şekil 3F) etiketleri SMI-31 boyanma benzer. Bu sonucun bir yorumu nörofilaman fosforilasyonu / defosforilasyonundan gelişimsel düzenleme, in vivo duruma göre kullanılan kültürlerde olduğu gibi sıkı olmadığını olabilir. Aynı akson fosforile ve fosforilatlanmamış nörofilament karışık olay Expl olabilirBu bulguyu değilim. Başka bir olasılık SMI-32 etiketli aksonlar projeksiyon nöronlarının kaynaklanan olmasıdır. Tsang ve arkadaşları 16 o örneğin göstermiştir, Clark&#39;ın sütun ve sütun intermediolateral hücre nöronlar motor nöronlar yanında SMI-32 tarafından boyandı. Bu tür nöronların belirgin nörit çoğalması da SMI-32 pozitif liflerin bolluğu açıklayabilir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> Şekil 1. Ekran ve spontan Faaliyet Analizi. (A) MEA diyagramı. Platin örtülü elektrotlar, siyah, kırmızı, şeffaf teller ve sarı MEA ortasında oluk tasvir edilmiştir. (B) MEA merkezinde bulunan elektrot dizisinin Close-up. Diyagramları nazik M. Heuschkel tarafından sağlanmaktadır. (C) 8 SAYI eski Kültür Parlak alan görüntüe. Dilimler büyüdü ve birbirine bakan kenarları boyunca kaynaşmış. Sarı bar MEA electrode- ve yalıtım gerektirmeyen oluk temsil eder. Deneylerin Ölçek çubuğu = 400 mikron (D) Timeline. E14 sıçan embriyoların iki spinal kord dilimleri ÇÇA üzerinde yanyana yerleştirilir. Birkaç gün içinde, dilim büyür ve sigorta birbirine bakan kenarları boyunca. 8 bir zaman dilimi içinde - 28 DIV, tam lezyonlar füzyon sitesi üzerinden yapılmaktadır. İki üç hafta sonra spontan aktivite kaydedilir ve kültürler immünohistokimyasal boyamalar için sabittir. (E), bir 23 DIV eski kültürün her bir elektrot spontan aktivite izleri. Net görselleştirme için, sadece her iki eser gösterilmiştir. Turuncu izleri sol taraftan sağ tarafta dilim kaydedilmiştir aktivite, mavi izleri betimliyor. Patlamaların çoğu ikisi arasındaki senkronize edilir. Sol dilim sadece p meydana gelen bir patlama ok noktalarıartially doğru dilimine yayılır. Sağ dilim etkinliği Ancak göre yan ortalama maksimal zirve aktivitesinin en az% 25 seçilmiş eşiğine ulaşamadı ve bu nedenle, bir patlama olarak algılanmaz. Sağdaki büyütme son senkronize patlama çifti tasvir. (E) &#39;de gösterilen faaliyet (F) Raster çizimi. (E) &#39;de gösterilen faaliyet tanımlanan patlamaları (taban çizgisinin altına çubuklar) ile (G) Ağ etkinliği arsa. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> Şekil 2. Değil Senkronize Faaliyet karşı Senkronize. (A, B) kültürlerin Raster araziler lesioneGenç yaşta d (7 at - 9 DIV), standart koşullarda (A) ve disinhibisyon altında (B) kapsamında senkronize aktivitesini gösteren. (C, D) standart koşullar (C) ve disinhibisyon altında (D) altında olmayan senkronize aktivitesini gösteren (&gt; 19 DIV at) bir yaşta lezyonlu kültürlerin Raster araziler. Senkronize aktivitesi (E, F) ortalama yüzdesi, standart koşullar (E) ve disinhibisyon altında (F) altında kaydedilmiştir her lezyon gün için işlenmiştir. 3 hafta lezyonun gün sonra - Kayıtlar 2 alınmıştır. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> FŞEKIL 3. immünohistokimyasal Karakterizasyonu. SMI-32 ile motor nöral hücre gövdeleri (A) Boyama. (B) olgun nöronal hücre gövdeleri ve süreçlerin β-III tubulin etiketleme. GFAP ile astrositlerde (C) Kimlik. Neun olgun nöronal hücre gövdesinin (D) Etiketleme. SMI-31 tarafından tanımlanan fosforilatlanmamış sinir lifi H. (F) Fosforlaştırılmış nörofilaman H (E) SMI-32 boyanması. Heidemann ark. 10 uyarlanmıştır. Her ikisi de dikkat edin, SMI-31 ve SMI-32, liflerin büyük bir ağ kültürlerinde görülebilir. Barlar AD = 20 um, H &amp; F = 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.

Çok elektrot Dizileri Yetiştirilen Organotipik Omurilik Co-kültürler Fonksiyonel Rejenerasyon incelenmesi

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K Görüntüleme.  University of Bern.  Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut. 

Video: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nörobilim

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

Larva Zebra balığı Omurilik Kesisi

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Etkinlik tabanlı eğitim omurilik ile bir koşu bandı üzerinde Wistar fareler yaralı

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Periferik Sinir veya Spinal Kord Kontüzyonu Yaralanması olan Kemirgenlerde Fonksiyonel İyileşmeyi Değerlendirmek için Otomatik Yürüyüş Analizi

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Farelerde Hafif Travmatik Beyin Hasarının Elektromanyetik Kontrollü Kapalı Kafa Modeli

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Spinal Kord Organotipik Kültürlerinde H-SC-NES Hücrelerinin Uzun Süreli Engraftmanı

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches is based on stem cell transplantation to replace lost tissue and promote functional recovery. This approach should be further explored better in vitro and ex vivo for safety and efficacy before proceeding with more expensive and time-consuming animal testing. In this work, we show the establishment of a long-term platform based on mouse spinal cord (SC) organotypic slices transplanted with human neural stem cells to test cellular replacement therapies for SCIs.
Standard SC organotypic cultures are maintained for around 2 or 3 weeks in vitro. Here, we describe an optimized protocol for long-term maintenance (&#8805;30 days) for up to 90 days. The medium used for long-term culturing of SC slices was also optimized for transplanting neural stem cells into the organotypic model. Human SC-derived neuroepithelial stem (h-SC-NES) cells carrying a green fluorescent protein (GFP) reporter were transplanted into mouse SC slices. Thirty days after the transplant, cells still show GFP expression and a low apoptotic rate, suggesting that the optimized environment sustained their survival and integration inside the tissue. This protocol represents a robust reference for efficiently testing cell replacement therapies in the SC tissue. This platform will allow researchers to perform an ex vivo pre-screening of different cell transplantation therapies, helping them to choose the most appropriate strategy before proceeding with in vivo experiments.

Yazar Spotlight: Omurilik Rejenerasyon Tedavilerini İlerletmek için Uzun Süreli Omurilik Dilimi Kültürü

In this paper, we provide a reproducible method to generate and maintain long-term spinal cord organotypic slices transplanted with neural stem cells as an ex vivo model for testing cellular replacement therapies.

Omurilik Yaralanmasında Hücre Transplantasyonunu Doğrulamak için Bir Platform Olarak Uzun Süreli Fare Omurilik Organotipik Dilim Kültürü

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...