Bu yayında bildirilen Araştırma Bilimsel Araştırma Temel Girişimi Hibe FA9550-12-1-0464 Hava Kuvvetleri Ofisi tarafından desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties.">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> P NATL ACAD SCI USA. 69, 3561-3566 (1972).</li><li>Tsofina, L., Liberman, E., Babakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+bimolecular+protein-lipid+membranes+in+aqueous+solution.">Production of bimolecular protein-lipid membranes in aqueous solution.</a> Nature. , (1966).</li><li>Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Bilayer+Formation+by+Contacting+Monolayers+in+a+Microfluidic+Device+for+Membrane+Protein+Analysis.">Lipid Bilayer Formation by Contacting Monolayers in a Microfluidic Device for Membrane Protein Analysis.</a> ANAL CHEM. 78, 8169-8174 (2006).</li><li>Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+bionetworks+from+nanoliter+water+droplets.">Functional bionetworks from nanoliter water droplets.</a> J AM CHEM SOC. 129, 8650-8655 (2007).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> J AM CHEM SOC. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Maglia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+networks+with+incorporated+protein+diodes+show+collective+properties.">Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties.</a> Nat Nano. 4, 437-440 (2009).</li><li>Sarles, S. A., Stiltner, L. J., Williams, C. B., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilayer+formation+between+lipid-encased+hydrogels+contained+in+solid+substrates.">Bilayer formation between lipid-encased hydrogels contained in solid substrates.</a> ACS APPL MATER INTER. 2, 3654-3663 (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+attachment+method+for+reconstituting+lipid+bilayers+of+prescribed+size+within+flexible+substrates.">Regulated attachment method for reconstituting lipid bilayers of prescribed size within flexible substrates.</a> ANAL CHEM. 82, 959-966 (2010).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Physical Encapsulation of Interface Bilayers. , (2010).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane-based+biomolecular+smart+materials.">Membrane-based biomolecular smart materials.</a> SMART MATER STRUCT. 20, 094018 (2011).</li><li>Sarles, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+droplet+interface+bilayers.">Asymmetric droplet interface bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 130, 5878-5879 (2008).</li><li>Bayley, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayers.">Droplet interface bilayers.</a> MOL BIOSYST. 4, 1191-1208 (2008).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+torus+surrounding+planar+lipid+bilayer+membranes.">Analysis of the torus surrounding planar lipid bilayer membranes.</a> BIOPHYS J. 12, 432 (1972).</li><li>Tien, H. T., Ottova, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+bilayer+concept+and+its+experimental+realization:+from+soap+bubbles,+kitchen+sink,+to+bilayer+lipid+membranes.">The lipid bilayer concept and its experimental realization: from soap bubbles, kitchen sink, to bilayer lipid membranes.</a> J MEMBRANE SCI. 189, 83-117 (2001).</li><li>Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+prokaryotic+mechanosensitive+channels.">Gating prokaryotic mechanosensitive channels.</a> NAT REV MOL CELL BIO. 7, 109-119 (2006).</li><li>Kung, C., Martinac, B., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+channels+in+microbes.">Mechanosensitive channels in microbes.</a> ANNU REV MICROBIOL. 64, 313-329 (2010).</li><li>Bialecka-Fornal, M., Lee, H. J., DeBerg, H. A., Gandhi, C. S., Phillips, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+census+of+mechanosensitive+channels+in+living+bacteria.">Single-cell census of mechanosensitive channels in living bacteria.</a> PLoS ONE. 7, e33077 (2012).</li><li>Levina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+of+Escherichia+coli+cells+against+extreme+turgor+by+activation+of+MscS+and+MscL+mechanosensitive+channels:+identification+of+genes+required+for+MscS+activity.">Protection of Escherichia coli cells against extreme turgor by activation of MscS and MscL mechanosensitive channels: identification of genes required for MscS activity.</a> The EMBO Journal. 18, 1730-1737 (1999).</li><li>Chiang, C. -. S., Anishkin, A., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+of+the+large+mechanosensitive+channel+in+situ:+estimation+of+the+spatial+scale+of+the+transition+from+channel+population+responses.">Gating of the large mechanosensitive channel in situ: estimation of the spatial scale of the transition from channel population responses.</a> BIOPHYS J. 86, 2846-2861 (2004).</li><li>Anishkin, A., Chiang, C. -. S., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain-of-function+mutations+reveal+expanded+intermediate+states+and+a+sequential+action+of+two+gates+in+MscL.">Gain-of-function mutations reveal expanded intermediate states and a sequential action of two gates in MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 125, 155-170 (2005).</li><li>Sukharev, S. I., Sigurdson, W. J., Kung, C., Sachs, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetic+and+Spatial+Parameters+for+Gating+of+the+Bacterial+Large+Conductance+Mechanosensitive+Channel,+MscL.">Energetic and Spatial Parameters for Gating of the Bacterial Large Conductance Mechanosensitive Channel, MscL.</a> J GEN PHYSIOL. 113, 525-540 (1999).</li><li>Deplazes, E., Louhivuori, M., Jayatilaka, D., Marrink, S. J., Corry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+investigation+of+MscL+gating+using+experimental+data+and+coarse+grained+MD+simulations.">Structural investigation of MscL gating using experimental data and coarse grained MD simulations.</a> PLOS COMPUT BIOL. 8, e1002683 (2012).</li><li>Kubalski, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial ion channels and their eukaryotic homologs. , (2005).</li><li>Chang, G., Spencer, R. H., Lee, A. T., Barclay, M. T., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+MscL+homolog+from+Mycobacterium+tuberculosis:+a+gated+mechanosensitive+ion+channel.">Structure of the MscL homolog from Mycobacterium tuberculosis: a gated mechanosensitive ion channel.</a> Science. 282, 2220-2226 (1998).</li><li>Steinbacher, S., Bass, R., Strop, P., Rees, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+prokaryotic+mechanosensitive+channels+MscL+and+MscS.">Structures of the prokaryotic mechanosensitive channels MscL and MscS.</a> Mechanosensitive Ion Channels, Part A. , 1-24 (2007).</li><li>Sukharev, S., Durell, S. R., Guy, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+models+of+the+MscL+gating+mechanism.">Structural models of the MscL gating mechanism.</a> BIOPHYS J. 81, 917-936 (2001).</li><li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels.">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li><li>Betanzos, M., Chiang, C. -. S., Guy, H. R., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+iris-like+expansion+of+a+mechanosensitive+channel+protein+induced+by+membrane+tension.">A large iris-like expansion of a mechanosensitive channel protein induced by membrane tension.</a> NAT STRUCT MOL BIOL. 9, 704-710 (2002).</li><li>Corry, B., Jayatilaka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulation+of+structure,+orientation,+and+energy+transfer+between+AlexaFluor+molecules+attached+to+MscL.">Simulation of structure, orientation, and energy transfer between AlexaFluor molecules attached to MscL.</a> BIOPHYS J. 95, 2711-2721 (2008).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+FRET+Reveals+Pore+Size+and+Opening+Mechanism+of+MscL.">Single Molecule FRET Reveals Pore Size and Opening Mechanism of MscL.</a> eLife. 3, e01834 (2014).</li><li>Anishkin, A., Akitake, B., Kamaraju, K., Chiang, C., Sukharev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydration+properties+of+mechanosensitive+channel+pores+define+the+energetics+of+gating.">Hydration properties of mechanosensitive channel pores define the energetics of gating.</a> J Phys Condens Matter. 22, 454120 (2010).</li><li>Ko&#231;er, A., Walko, M., Meijberg, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+interface+bilayer+reconstitution+and+activity+measurement+of+the+mechanosensitive+channel+of+large+conductance+from+Escherichia+coli.">Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli.</a> J R Soc Interface. 11, 20140404 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mechanosensation yaşayan organizmaların gelişti ilk duyusal iletim yollarının biri anlamına gelir. Okuyan ve DIB mekano-elektriksel özelliklerini anlamak için bu olguyu kullanarak, fonksiyonel uyaranlara duyarlı malzemeler doğru önemli bir adımdır. Bu mekanoelektriksel dönüştürücü ve çift katlı lipid arayüzünde gerginlik artışı tespit etmek için bir zorlanma göstergesi olarak DIB bir mechanosensitive kanalı, MsCl, birleşmesini ve aktivasyonunu içerir. Bir başka not, MS kanallarının fonksiyon kalınlığı, içsel eğrilik ve kompresibilite dahil lipit bilayers temel malzeme özelliklerine düzenlenir olabilir. Yukarıda bahsedilen ışığında, mikropipet bazlı bir tekniktir araştırmacı Dıb&#39;leri MS kanallar çalışma ve çift katlı lipid yapısına, aynı zamanda, lipid-protein etkileşimleri kavranmasını sağlar yeteneği sağlayan değerli bir araç sağlar. Son üç on yıl içindes, patch-kelepçe o gerilim ve gerginlik hem kenetlenmesini sağlar beri, MS kanallarını incelemek için birincil yöntem oldu. Ancak, patch-kelepçe hantal ekipman ve minyatür, duyusal ve dönüşüm cihazlarının mühendislik için gerekli bir özellik için uygun değildir gerektirir. Onların basitlik, kararlılık ve kompakt nedeniyle Dıb&#39;leri MsCl aktivitesini incelemek için uygun bir ortam oluşturmaktadır. Burada, damlacıklar ve iki katmanlı arayüzü boyutunu her damla kimyasal kompozisyonunu ve dinamik uyarılması yoluyla arayüzünde gerginliği kontrol etme yeteneği ile, bir mikropipet tabanlı tekniği önererek DIB oluşum teknikleri önceki gelişmeler uzatmak. Tekniği eş eksenli cam kapilerleri karşıt uçlarına, proteoliposomes içeren sulu damlacıkları ankraj oluşur. Temas ara yüzeyde bir lipid iki katmanlı formları getirdi damlacıkları organik çözücünün bir banyoda üstüne yerleştirilmiştir. Mikropipetler p bağlandıklarıdamlacıkların, yatay yer değiştirmesine izin iezoelectric osilatörler. Dinamik Su-yağ ara yüzeyinde ara yüzey geriliminde bir artış ve bu nedenle iki tabakalı geriliminde bir artış damlacıklar sonuçları sıkıştırılması. İki önemli yönleri benzer ve yakın zamanda yayınlanan iletişim kabarcık iki tabakalı (CBB) tekniği 37 bu yöntemi ayırt. Burada sunulan tekniği kullanarak, iki katmanlı boyutu mikromanipülatörler kullanılarak kontrol edilir ve böylece damlacıklar hacimleri CBB yönteminde aksine, sabit kalır. Buna ek olarak, CBB tekniği daha basit ve inşa etmek kolaylaşır, bu yazıda sunulan yöntemde gerekli değildir basınç pompaları için çağırır. Biz birleştirmek ve bir yama pipet veya kimyasal modifikasyonlar 38 kullanılmadan ilk kez bakteriyel MsCl uyarabilen. Sistem sağlam asimetrik çift katlı lipid membranların oluşumunu kolaylaştırmaktadır beri, daha yakından l taklitBiyolojik membranların bulunan IPID asimetri. Bu MsCl aktivitesi kontrollü membran bileşimi ya da asimetri etkilerini incelemek için bize izin verir. Ayrıca, görüntü işleme teknikleri ile, bu yöntem iki tabakalı arayüzünde gerilimi tahmin etmenize yardımcı olur. DIB toplu ve yüzey kuvvetleri arasındaki interconversion prensiplerini anlamada Bu teknik asist, temel zar özelliklerinin ölçümleri kolaylaştırır ve gerginlik membran MsCl yanıtının anlayışı geliştirir. Bu yöntem MsCl incelemek için bir adım daha yakın biyomoleküler uyaranlara duyarlı malzeme sistemi doğru ve farklı fizyolojik ortama bizi alır da, sisteme sınırlamalar vardır. Bu sistemde Gerilim nedeniyle yağ / su ara yüzeyinde gerilimini azaltmak için, eğilimi her damla, lipozomların şeklinde lipid rezervuarın varlığı sıkıştırılır edilemez. Bu nedenle, bu mechanosensitive kanallarda stimüle edilebilirsadece dinamik bir rejimde Dıb&#39;leri bölgesindeki. Sistemdeki hava kabarcıklarının varlığı önemli ölçüde deney hassasiyet ve tekrarlanabilirlik etkiler. Hidrojeller mevcut hava kabarcıkları Elektrik bağlantısı varsa kaybına neden olabilir. Biz MsCl uyarılması için mikro-pipet bazlı yöntemin kullanımını tarif ederken, bu teknik MS kanalların diğer tip incelemek için kullanılan ve biyomoleküllerin çeşitli çalışma için araştırmacılar tarafından kullanılmak üzere bir potansiyele sahip olabilir. Örneğin, benzer kurulum kanalsız damlacık arayüzü iki tabakalı zarın mekanoelektriksel tepkisini incelemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Çeşitli proteinler yeniden ve her biyomolekülün sulandırma ortamları farklılık göz önüne alarak, bu son derece kontrollü kurulumu kullanarak aktive edilebilir. Bu makalede açıklanan yöntemi yalnızca araştırmacı hayal gücünüzle sınırlı bir ölçüde geniş bir uygulama potansiyeline dokunur.

Son on yılda, yapay lipid iki katmanlı montajı ölçüde damlacık arayüzü iki tabakalı yönteminin geliştirilmesi yoluyla ileri olmuştur. Istikrarlı ve sağlam olarak bilinen, Dıb&#39;leri (Mueller) boyalı klasik ve katlanmış (Montal-Mueller) düzlemsel bilayers 1 alternatif model sistemler olarak kendilerini empoze. Lipit katmanlarını oluşturmak için damlacıkları kullanma fikri 1960&#39;larda 2 büyük olsa da, yakın zamana kadar popülerlik kazandı değildir. İlk başarılı girişim Bayley gruptan 4-6 damlacıkların bir ağ kullanarak iki tabakalı oluşumunu gösteren çeşitli çalışmalar takip Takeushi grubunda 3, tarafından rapor edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kapsülleme teknikleri yeni uyaranlara duyarlı malzeme sistemlerinin 10 yapı taşları olarak Dıb&#39;leri kullanarak kavramını öncülük Leo grubunun 7-9, tarafından önerilmiştir. Daha önceki çalışmalarda, Dıb&#39;leri elektrik 9,11, kimya yanıt yeteneklerini kanıtladılar10,12 ical ve optik uyaranlar 13. DIB 10,14 sulandırılmış zaman farklı uyaranlara duyarlı fonksiyonları ile çeşitli biyomoleküllerin etkin bir teşvik edilmiştir. Önemli bir soru ortaya çıkar bu başarılı girişimleri ışığında: mekanik uyarana cevap DIB, uygun biyomoleküllerin dahil edilmiştir ki? Bir DIB etkiyen arayüzey kuvvetleri diğer iki tabakalı sistem 15,16 olarak farklıdır. Bu nedenle, damlacıklar tarafından tutulan iki tabakalı gerilim Su-lipit yağ ara yüzlerinde gerilimin düzenlenerek kontrol edilebilir; boyalı veya katlanmış iki tabakalı sistemler ile uygulanamaz bir kavram. Yaygın osmolite bırakma vanaları ve bakteriyel sitoplazmik membran temel unsurları olarak bilinen MsCl kanalları, artan membran gerilimi 17,18 tepki. Hipo-osmotik şok durumunda, birkaç kanal küçük hücre membranında bulunan 19 mas oluşturabilirsive geçirgenlik tepkisi hızlı lizis 20 bakteri tasarruf iyonları ve küçük molekülleri serbest bırakmak için. Biyofizik, MsCl iyi incelenir ve belirgin yama kelepçe tekniği 21-23 ile öncelikle karakterizedir. MsCl en yolluk mekanizması 24,25 açıklayan Güvenilir yapısal modeller kendi homolog kristal 28 modelleme yapısı 26,27, ve kapsamlı deneylerle 24,29-31 sonuçlarına göre önerdi almaktadır. ~, Uygulanan gerilim altında 10 mN / m, zar geçiş sarmallarının sıkı bir demet oluşur kapalı kanal, bir p 28 bir su dolu ileten ve gözenekleri 21,24,32 oluşturan büyük ölçüde eğik sarmallarının bir halka dönüşür. Ayrıca, iç TM1 etki kesişme yerleştirilmiş sıkı bir kapının hidrofobiklik, kanal 33 aktivasyon eşiğini belirler olduğu tespit edilmiştir. Buna bağlı olarak, bulunmuştur ki, kapının hidrofobikliğini azaltarak, tension eşiği 22 indirdi olabilir. MsCl bu özelliği öncelikle ilaç dağıtım amaçlı çeşitli kontrol valfleri 34 tasarımı mümkün kıldı. Tüm yukarıda belirtilen özellikleri için ve elektrofizyolojik faaliyetler içine hücre zarı aşırı gerilimleri tercüme onun temel rolü dayalı MsCl Dıb&#39;leri bir mekanoelektriksel transdüser olarak büyük bir uyum yapar. Bu yazıda, mekanik uyarım altında birleşmiş MsCl kanallarının aktivitesini Dıb&#39;leri oluşturmak ve ölçmek için orijinal bir mikropipet tabanlı yöntem mevcut. Biz ilk defa, mekanik uyarıcı ve Dıb&#39;leri 35 içinde MsCI ve V23T düşük eşikli mutant fonksiyonel rekonstitüsyondan KYB&#39;lerin yanıt rapor. Deneysel sistem karşılıklı iki borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzü fo olduğuonaylanmamis. Bu teknik, her damlacık (dökme) kimyasal bileşimi ve boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Buna ek olarak, her bir broşür koşullarında çeşitli lipid bileşimleri ile asimetrik membranlar kolayca oluşturulabilir. , Harmonik piezoelektrik aktüatörün bağlanmış mikropipetler birine sahip bir önceden programlanmış tek siklus ya da titreşimli uyarıcı uygulamak olanağı sağlar. Gerginlik onu destekleyen hem damlacıkların sıkıştırma yoluyla yapay membran teslim edilir. Damlacık deformasyonun bir neticesi olarak, su-lipit yağlı arayüzler artış, ve aynı zamanda damlacıklar arasındaki açının alanları membran gerilimi ve geçici MsCl aktivasyonunda bir artışa neden azalır. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu makaledeki odak DIB mekano-transdüksiyon özelliklerine olsa bile, biz de vurgulayan diğer tip biyoörneğin alamethicin gibi moleküller, bu çok fonksiyonlu platform tarafından aktive edilebilir. Biz hazırlanması montaj ve adım adım bir şekilde bu yeni yöntem ile ölçüm tüm teknik özellikleri, burada sunulmuştur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MsCl, büyük bir iletkenliğe mechanosensitive kanalı (MSC), bakteri ani hipo-osmotik şok hayatta yardımcı olan bir yerde osmolite salma valfidir. Keşfedilmiştir ve sıkı yaklaşık üç yıl için patch-clamp tekniği kullanılarak araştırılmıştır. Geçirgenliği yanıta hücre zarına uygulanan gerilme çevirme Temel rolü yapay membran bazlı biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel transdüktör olarak işlev için güçlü bir aday yapar. Bu tür aygıtlara yapı blokları olarak hizmet veren, damlacık ara biriminde iki katlı tabakalar (Dıb&#39;leri) MsCl kanallarının dahil edilmesi ve uyarılması için yeni bir platform olarak kullanılabilir. Burada, ilave MsCl kanallarının aktivitesini Dıb&#39;leri oluşturulması ve ölçmek için bir mikropipet dayalı bir yöntem tarif eder. Bu yöntem, iki karşılıklı (ortak eksenli bir konuma) borosilikat cam mikropipet uçlarına sabitlenmiş lipid kaplı, sıvı damlacıklarının meydana gelir. Damlacıklar temas ettirildiği zaman, bir lipid iki katmanlı arayüzükurdu. Bu teknik, kimyasal bileşime ve her bir damlacık boyutu üzerinde kontrol, hem de iki tabakalı arayüzünün bir boyut sunar. Harmonik piezoelektrik aktüatör bağlı mikropipetler birine sahip istenen salınım uyaran sunmak için yeteneği sağlar. Deformasyon sırasında damlaların şekil analizi sayesinde, ara yüzeyde oluşan gerilim tahmin edilebilir. Bu tekniği kullanarak, DIB sisteminde MsCl kanallarının ilk etkinlik bildirilmektedir. MS kanalları Bunun yanı sıra, kanalların diğer tip aktiviteler, bu platformun çoklu işlevselliğini kanıtlayarak, bu yöntem kullanılarak incelenebilir. Burada sunulan yöntem, temel zar özelliklerinin ölçümü sağlayan simetrik ve asimetrik membranların oluşumu üzerinde daha fazla kontrol sağlar ve teşvik ve mechanosensitive kanalları incelemek için alternatif bir yoldur.

1 Şekil ve çift katlı lipid membran mekanik uyarılması sırasında protein aktivitesini kaydetmek için 2 ekran deney düzeneği ve ekipman kullanılan. Bizim ölçümlerde içine elektriksel gürültü en aza indirmek için, iş istasyonu, bir laboratuvar yapımı Faraday kafesi içine yerleştirilir, Axopatch 200 B Amplifikatör bir toprak bağlantısına topraklı. Istikrarlı bir yalıtım çift katlı lipid oluşumu bu çalışmada önemli bir adımdır. Bu düzenlemede, bir lipit tek katmanlı bir organik çözücü bir banyo içerisine batırılmıştır, sıvı damlacıklarının yağ / su ara yüzeyinde toplanır. Damlacıklar temas halinde yerleştirilir, fazla yağ elendiği, ve bir iki molekül, kalın lipid ikili tabakasına göre karşıt bir lipid mono tabakalar, ince bir. Iki tabakalı karakterizasyonu kullanılan en yaygın tekniktir gerilim kelepçe olduğunu. Mevcut ölçülür ve voltaj-kelepçe ile, çift-tabakanın gerilimi sabit bir değerde muhafaza edilmektedir. Şekil 4 </strong&gt; İlk iki katmanlı oluşumunun tipik bir gerçek zamanlı akım kayıt canlandırıyor. Belirli kapasitans (~ 0.6 jxF / cm 2) DPhPC çift katlı lipid 5 bilen kurdu iki tabakalı alanı hesaplanabilir. Iki tabakalı alan damlacıkları (Şekil 4A) pozisyonunu değiştirerek kontrol edilebilir. Piezoelektrik erişim düzeneğini kullanarak, farklı frekanslarda, amplitüdleri ve görev çevrimlerinde dalga formu (sinüs, kare, üçgen, vb.) Farklı türleri, döner damlacıklar tatbik edilir ve eksenel olarak salınım ve böylece iki tabakalı gerilimi ve alan değişmiş olabilir olabilir (Şekil 4B). DIB mekanik olarak uyarıldığında zaman zarından sabit DC potansiyeli korurken, MsCl düşük eşik (kazanç fonksiyon-) V23T mutant ağırlıklı alt iletken devletleri ve bazen tam açılış etkinlikleri de dahil olmak üzere güvenilir faaliyetleri oluşturur (Şekil 5) . Bu evhastalar saflaştırılmış V23T MsCl ile yeniden sağlam iç E.coli membran ve lipozomlardan patch-clamp tekniği kullanılarak kaydedilen özdeştir. Şekil 5&#39;te sonuçlar mevcut tüm sivri tepe sıkıştırma gözlenmiştir, çünkü bu geçitleme, geriliminde bir artış tepki olarak ortaya çıkar kanıtlamaktadır. Pik sıkıştırma da damlacıkların göre alansal genişlemesi maksimumdur ve bu nedenle, ara yüzeyde gerilimi gözlenir. Bir DC gerilimi zar 36 boyunca uygulandığında Alamethicin bir voltaj kapılı iyon kanalı ve en çok çalışılan peptidlerin biri zar geçirgenliğini artırır. Transmembran proteinlerin ve peptidlerin barındırmak için lipid iki katmanlı arayüzünün becerisi aynı zamanda peptid alamethicin ile voltaj-akım kayıtları yolluk performans ile test edilir. Alamethicin 100 ng / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar fosfolipid çözeltisi ile karıştırılır. 6 kapsamında akım ölçümleri göstermektedir<html> gerilim kelepçe (115 mV). Bu deneyde, küçük damlacıklar iki katmanlı arayüzü ve böylece daha yüksek bir direnç ve daha küçük kapasitans elde etmek için ayrı çekilir. Alamethicin peptid yolluk davranışı akımı (Şekil 6) ayrık adımlarda gösterilir. Arsa sağ tarafındaki histogram temelde kanalın kendisinin birinci iletkenlik seviyesi taban seviyesine (0,0962 nS) &#39;dan iletkenlikteki değişiklik gösterir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Şekil 1:. Ana bölümden ve yağ haznesi boyutları anlatan şematik yağ haznesi Virginia Tech makine dükkanında imal edilir. Bu akrilik levhanın yüzeyine yapıştırılmış bir işlenmiş silindirik akrilik tüptür. Boyutları ve tasarımı, farklı uygulamalar ve ikiden fazla mikropipetler uyum için değiştirilebilir./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Şekil 2:. Deneysel kurulum ve mikropipetler hazırlanması (A) mekanik şekillendirme uyarıcı ve arayüz bilayers tanımlamak için standart iş istasyonu bir mikroskop, 3-eksenli manipülatörler, bir dijital kamera, piezoelektrik osilatör, titreşim izolasyonu tablo ve Faraday kafesi içerir (gösterilmemiş). (B) Deney düzeneği yatay heksadekan bir yağ banyosu içine yerleştirilmiş iki karşılıklı PEG-DMA hidrojel dolu mikropipetler oluşur. Mikropipetler her elektrik bağlantısı sağlamak için bir Ag / AgCI elektrot içerir. Proteoliposome çözeltisi ile doldurulmuş bir üçüncü mikropipet diğer mikropipetler ucundaki damlacıkların meydana getirilmesi için kullanılır. (C) DIB geçerli yanıt ölçülebiliryama amplifikatörü ve düşük gürültü veri toplama sisteminin bir arada kullanarak. (D) A mikropipetlerin ucunda oluşan sulu damlacıklarını gösteren resmi kapattı. (E) Ag / AgCİ elektrotlar ağartıcı iki 250 | im&#39;lik gümüş tel ucu daldırma ile yapılır. Elektrodlar katılaşmaya UV ışığı ile sertleştirilir PEG-DMA hidrojel, dolu iki borosilikat cam kılcal damarlar yoluyla beslenir. Erkek konnektörü ile düz bir mikroelektrod tutucu yama amplifikatör headstage için mikropipetlerin biri bağlamak için kullanılır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Şekil 3:. Damlacık arayüz iki katmanlı oluşumunu gösteren resim (A) proteoliposomes dolu bir 10 um mikropipet mikropipet uçları yakınına mikroskop altında konumlandırılır. Mikropipet bağlı bir şırınga kullanarak, küçük hacimli dağıtımproteoliposomes istenen hacme misket şeklinde olan damlaların oluşturulması için. Damlacıklar on dakika oturmak için izin vererek tek tabakalı formu edelim. Temas damlacıkları getirin; arayüzde tüm petrol elimine edilir sonra iki tabakalı oluşturacaktır. Iki tabakalı oluşturulduğu birlikte, arayüz her iki kimyasal bileşimi, bir mikro-boyutlu mikropipet kullanılarak arzu edilen kimyasal enjekte edilmesiyle kontrol edilebilir (B). (C) ilk temas anında damlacıkları. (D) lipid iki katmanlı oluşturulur damlacıkları. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Şekil 4: Gerçek zamanlı ölçümleri ilk incelme ve arayüz sonraki genişleme hem de gösteren bir üçgen elektrik potansiyelin uygulanması yoluyla iki tabakalı oluşumu sırasında ölçülen (A) Akım.. Ölçülen akımın büyüklüğü Capaci ile doğru orantılıdırmesafe, ve iki katmanlı arayüzü böylece alanı. Arayüzü ve tersi alanı daha büyük damlacıklar bir araya getirilir yakın. Mekanik uyarma uygulanması üzerine (B), iki tabakalı bir arayüz artar alanı ve uyarıcı sinyali ile aynı frekansta azalır. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Şekil 5:. Gerçek zaman ölçümleri, mekanik uyarma ile iki katmanlı bir yanıt olarak MsCl bir V23T mutantı yolluk göstermektedir mevcut yanıt şekli sonucunda iki tabakalı kapasitans bir sinüzoidal bir değişiklik ile de ilgilidir sinüzoidaldır iki tabakalı alan değişikliği. Geçerli sivri, her döngünün zirvesinde ortaya çıkan, V23T mutant alt iletkenlik yolluk gösterir. Diğer bir kutupsal yolluk iki tabakalı arayüzünde geriliminde bir artışı yansıtır pik sıkıştırma meydana gösterir. Şekil 6:. Voltaj kelepçe ve anonim Alamethicin kanallarının yolluk aktivitesi için iletkenlik seviyeleri gelen histogram altında Akım ölçümleri Alamethicin peptid yolluk davranışı akımında ayrı aşamalı bir artış ile gösterilir. Iletkenlik seviyeleri Virginia Tech 7 bizim araştırma grubu tarafından yapılan daha önceki ölçümlerle çok iyi maç.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb&#39;leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb&#39;leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem göstermektedir.

Çok fonksiyonlu, Damlacık Arayüz Bilayers Bakteriyel Mechanosensitive İyon Kanallarının Kuruluş Ve Uyarım için Yöntemi Mikropipet tabanlı

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Görüntüleme.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Bakteriyel mechanosensitive kanallar biyomoleküler cihazlarda mekanoelektriksel dönüştürücüler olarak kullanılabilir. Damlacık arayüz bilayers (Dıb'leri), bu tür cihazlara hücre ilham yapı blokları, birleştirmek ve mechanosensitive kanallar teşvik etmek, yeni platformlar temsil etmektedir. Burada, biz, Dıb'leri oluşturan mekanik stimülasyonu altında mechanosensitive kanalların çalışma izin yeni bir mikropipet tabanlı bir yöntem gösterm...

Video: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Elektrofizyoloji Deneyler Yapay Bilayers hazırlanması

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Hava Sıvı Arayüz İnsan Burun Epitel Hücrelerinin ekimi

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...