This work was supported by National Science Foundation grant MCB-0951199, and in part by the NIH grant EY01910, California Institute of Regenerative Medicine grants RB1-01417 and by the Funda&#231;&#227;o para a Ci&#234;ncia e Tecnologia (FCT) grant SFRH/BD/87256/2012.

1. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Hazırlık <ol><li> Iyon seçici mikroelektrot hazırlanması <ol><li> Isı, bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak filamanın (1.5 mm dış çaplı, 1.12 mm iç çap) olmadan, ince duvarlı borosilikat kılcal çekin. Not: Bu, ipuçları çapı 3-4 mikron verir. Daha küçük ipuçları elektronik gürültüye Mikroelektronlar daha duyarlı hale getirir ve aynı zamanda iyon konsantrasyonunda bir değişikliğe daha yavaş bir tepki ile ilişkili yüksek dirence sahiptir. Faydalı bilgiler Smith ve ark., 26 tarafından yayınlanan yazıda bulunabilir. </li><li> Lipofilik iyonofor kokteyl tutulmasını yardımcı olmak için iç yüzeyini hidrofobik hale getirmek için elektrotlar Silanize. Bunları kurutmak için&gt; 100 ° C &#39;de, bir fırın içinde bir metal raf ve ısı O / N mikroelektrot yerleştirin. raf 2 mm çapında delikleri olan bir metal plaka ile yol parçası delinir. Ml gr delik elektrotlar 250 ile yukarı ucu yerleştirinbunların üzerine kız beher. </li><li> Sabah, fırın kapatın ve yalıtımlı eldiven giyerek, dikkatle yerine elektrotlar ve beher metal raf çıkarın. Isıyı korumak için fırın kapağını kapatın. </li><li> Lateks veya nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük takın. Plastik Pasteur pipeti ile, her elektrodun dibinde silanizasyon çözeltisinin ben bir damla koyun (yerinde beher tutmak, pipet erişimi için dökme dudak kullanın). silanizasyon çözüm sıcak plaka ile buharlaşmış ve elektrotların içini silanizes edilir. Bu aşamada bir kimyasal çıkarıcı davlumbaz kullanın. Birkaç saat kalan silanizasyon çözümü buharlaşmasına izin sıcak fırında raf / beher / elektrotların geri yerleştirin. Not: Güvenlik nedeniyle, tekrar fırını açmayın. Zararlı ve yanıcı buhar içerebilir gibi açık olmamalıdır gösteren fırın bir etiket yerleştirin. </li><li> Soğutulduktan sonra, bir mikroelektrot kavanozlar insi mikroelektrot depolamakkurutucu 400 g cam bir desikatörde de. Mikroelektronlar haftalarca bu şekilde saklanabilir. Not: alternatif bir silanizasyon yöntemi Smith ve diğerleri tarafından tarif edilmektedir: 26. </li><li> Ölçülecek olan iyon, 100 mM ihtiva eden bir çözelti 50-100 ul (yaklaşık 1 cm uzunluğu) (bakınız Tablo 1 ve Şekil 1B) mikroelektrot geri-dolgu. Ince bir filamanın bir Bunsen beki çekti atılabilir plastik Pasteur pipeti ısı kullanın. Tıkanmayı önlemek için daha sonra DH 2 O pipet durulayın. Not: Alternatif olarak, dış solüsyon 27 iyon konsantrasyonunu maç dolgu çözeltisinin iyon konsantrasyonunu ayarlayın. </li><li> Hava kabarcıkları olmaması sağlamak için bir tahlil mikroskobu altında mikroelektrot dikkate alınmalıdır. <ol><li> Dikey elektrot tutarken kabarcıklar tırnağınızla hafifçe mikroelektrot mevcut musluk varsa (aşağı ucu) ve / veya kabarcık itinİğneyi yerine bir silikon tüp ile modifiye bir şırınga kullanarak geri basınç uygulayarak ucu dışarı s. </li></ol></li><li> Iyon spesifik iyonofor kokteyl 15 ila 20 nl (30-50 mikron uzunluğunda) ile mikroelektrot ucu doldurmak (bakınız Tablo 1). Bir mikroskop lamı kısa kenarında iyonofor kokteyl küçük bir damlacık yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu altında mikroelektrot ucu gözlemleyin ve mikroelektrod ucu sadece yaklaşık yarım saniye iyonofor kokteyl temas edene kadar mikroskop lamı doğru hareket ettirin. Kılcal basınç ile mikroelektrot içine iyonofor kokteyl çizin. Not: Bu elektronik parazit (gürültü) ile bu duyarlı yapabilirsiniz sondanın elektrik direncini artırır ve aynı zamanda yanıt süresini yavaşlatır olarak iyonofor kokteyl uzun bir sütun kaçının. </li><li> Altın, 1 mm erkek konektör ve AgCİ (Ag +), tel (Şekil 1B) düz bir mikroelektrot tutucu mikroelektrot monte edin. &lt;/ Li&gt; <li> Üç boyutlu bilgisayar kontrollü elektronik micropositioner (Şekil 1A) üzerine monte kafa aşamasına mikroelektrot yuvasını takın. </li><li> Örnek ölçülebilir için çözelti, uygun ölçme bölgesi mikroelektrot ucu yerleştirin (fizyolojik tuzlu su, kültür ortamı, vs.) mikroelektrot bir saat ya da iki ya da gece boyunca stabilize etmek için izin vermek. </li></ol></li><li> Referans elektrotunun hazırlanması <ol><li> Referans elektrot (Şekil 1C), yukarıdaki ile aynı kılcal bulunmaktadır. 5 cm uzunluklarda bir elmas kalemle kılcal kesin ve Bunsen alev 1-2 saniye boyunca her iki ucunda yangın cilalı. </li><li> NaCI, 3 M çözelti, ~ 200 ul, bu elektrotlar dolgu,% 2 agaroz ile CH3 CO2 K (potasyum asetat) ya da KCI. Iyon bağlı olarak çözelti, ölçülecek seç (referans elektrotu ölçülecek iyon içermemelidir; bakınız Tablo 1). Karıştırmakagaroz ve neredeyse bir mikrodalga kaynar çözümü ve ısı. Agaroz çözmek için karıştırın (çözelti berrak gider). </li><li> Bir plastik Pasteur pipeti referans elektrodu takın ve kılcal içine sıcak çözüm çizin. </li><li> Kullanmadan önce mühürlü tüplerde bu 3 M çözelti soğuk 3 M NaCI, CH 3 CO 2 K veya KCl çözeltisi ve mağaza içine elektrod bırakın. Hava kabarcıkları ile herhangi bir referans elektrotlar atın. </li><li> Düz bir mikroelektrot tutucu bir referans elektrot içindeki (önceden doldurulmuş 3 M çözelti) ile bir AgCI (Ag +) ile pelet ve altın 2 mm erkek konektör (Şekil 1C) monte edin ve bir manuel mikro konumlayıcı üzerine elektrotu ve tutucuyu manyetik bir stand üzerine monte edilmiş. </li></ol></li></ol> 2. İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Kalibrasyon <ol><li> Referans çözelti olarak ilgi iyonu içeren kalibre çözümleri hazırlanması; Tablo 1 bakınız </str&gt; ong. Çözelti örnek olacak (örneğin kültür ortamı, serum fizyolojik) olan konsantrasyonu ayraç. Yani, bir kalibrasyon çözeltisi ölçüm çözeltisi içinde daha iyonunun daha düşük bir konsantrasyonda içerir ve daha yüksek bir zorunluluktur. <ol><li> Örneğin, K + 1 mM içeren tuzlu su kullanın. Bu konsantrasyon braketine, seri seyreltiler halinde 10, 1 ve 0.1 mM bir konsantrasyona kadar iyonu giderilmiş su içinde KCI toz çözülür. Bu kalibrasyon çözümlerini kullanın. Seçenek olarak ise, bu çözümlerin en az iki kullanın. </li></ol></li><li> Iyon seçici mikroelektrot ve her kalibrasyon çözeltisi içinde referans elektrot daldırın ve voltaj değeri özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize izin (Tablo 1). </li><li> Yazılım bir txt dosyası olarak veri (amplifikatör çıkışı) olarak kaydeder, bir elektronik tablo dosyasına veri kopyalama. Logaritması karşı Mikroelektrot çıkışı (mV) Plotmol iyon konsantrasyonu (Şekil 2A). </li><li> Doğrusal regresyon uygulayın ve Nernst eğim, kesişme ve R2 değerini hesaplamak. Nernst eğim tek değerli iyonlar için 58 ± 11 mV / on ve iki değerlikli iyonlar için 29 ± 11 mV / on ise mikroelektrot Kabul (katyonlar için, Nernst eğim anyonlar için negatiftir, pozitiftir). Ayrıca, iyi Mikroelektronlar güçlü bir doğrusal ilişki (Şekil 2B R 2&gt; 0.9) olması gerekir. Not: Burada kullanılan amplifikatörün mV çıkış mV on kat kazanç okuma verir. Değerler on kat bölünmesi gerekir. </li><li> Gerçek iyon konsantrasyonu (Şekil 2B) içine mikroelektrot ham mV çıkış dönüştürmek için lineer regresyon formülü kullanın. </li></ol> İyon seçici Mikroelektrod Tekniği 3. Doğrulama <ol><li> Yapay kaynak hazırlanması <ol><li> Yapay kaynak kılcal aynı kılcal damarlar gibidirYukarıda. Isı adım 1.1.1 deki gibi bir mikroelektrot çektirmenin kullanarak kılcal çekin. </li><li> NaCI, KCI, 1 M çözelti, 200 ul, CaCI2 2H 2, O ya da pH 4 tamponu, bu kılcal Dolgu. Seçin iyon bağlı yapay kaynak çözüm (Tablo 1) ölçülecek. Not: Alternatif olarak, büyük uç çapı (~ 20 mm) ile elektrotlar çekin aynı çözümleri ile ucu doldurun ama% 0.5-1 agaroz içeren (agaroz çözüm herhangi bir toplu akışını önleyecektir). </li><li> Bir mikromanipülatör yapay kaynaklı kapiler monte edin ve örneklerde iyon akışını ölçmek için kullanılan çözelti içinde bırakın. Gradyan stabilizasyonunu sağlamak için 1 saat kadar 30 dakika boyunca çözelti içinde yapay kaynak bırakın. </li></ol></li><li> Iyon seçici mikroelektrot Doğrulama <ol><li> İki ölçme işlemi için kullanılan çözeltide yapay kaynaklı kılcal ila yaklaşık bir santimetre uzaklıkta iyon seçici mikroelektrot daldırınörnekler üzerinde iyon akı yeniden ve daha önce olduğu gibi referans elektrodu ile devreyi kapatın. Gerilim değeri 1 ila 2 dakika süreyle özel bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kaydetmeden önce 1 dk 3 için stabilize edelim. Bu değer, (aynı zamanda bir referans, arka plan veya boş değer olarak ifade literatürde) tamponu değerine karşılık gelir. </li><li> Yapay kaynaktan yaklaşık 5 um iyon seçici mikroelektrot getirin ve 1-2 dakika için bir yazılım kullanılarak ilgili gerilim kayıt işleminden önce voltaj değeri 1 dakika ila 3 için stabilize sağlar. </li><li> Yapay kaynak kılcal uzak 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 ve 1280 mikron de iyon seçici mikroelektrot koyarak yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li><li> Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın. </li></ol></li><li> Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir. Hayırte: bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder. Yapay kaynaklı çözeltisi daha ölçülen türlerin daha fazla iyon içeriyorsa, konsantrasyon doğru (bu durumda, bir iyon akışının yönünü tespit etmek için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulamak uzakta, daha kaynağına daha yakın olmalıdır akış; yapay lavabo için, orta ölçme daha düşük spesifik iyon konsantrasyonu ile bu) akını olması gerekir. <ol><li> Difüzyon Fick yasasını kullanarak iyon akışını hesaplayın: J = c μ c çözeltide iyon konsantrasyonunu (mol cm -3) ise, μ iyon hareketlilik olduğunu (DC / dx) (mol cm N -1 sn -1) ve DC mesafesi dx (cm) (Şekil 2C) üzerine konsantrasyonu farktır. İyon akı veriler genellikle pmol cm -2 s sunulmuştur-1 Veya nmol cm -2 sn -1. Not:.. Smith ve arkadaşları 26 tarafından tarif edilen iyon akışı hesaplama için alternatif bir yöntem de kullanılabilir. Ana farklılıklar difüzyon katsayısı kullanımı yerine iyon hareketlilik ve numune olmadan tuzlu su çözeltisi içinde iyon akışının ölçümü hesaplanan arka plan iyon akı (ayrıca sürüklenme veya düzeltme faktörü voltaj) çıkarma sayılabilir. </li><li> Kaynak (Şekil 2D) uzaklaştıkça karşı her bir aşama, iyon tozlar ortalamasını çizilir. Kaynağından uzaklaşan, iyon akı farklı büyüklüğünü algılamak için iyon seçici mikroelektrot yeteneğini doğrulama akı değeri üstel azalma gözlemlemek. </li><li> Büyük bir sinyal-n onun doğru yönü ve büyüklüğü ölçümleri doğrulamak için kaydedilen amaçlanan her bir spesifik iyon kez yapay kaynak doğrulama yapınOise oranı. Not: numune olmadan tampon iyon akışı ölçümü arka plan düzeyi veya gürültü gösterir. Tipik olarak, tampon ölçümü değişken yön gösterir çok küçük akı giden iyon konsantrasyonunun net dalgalanma gösterir. </li></ol></li></ol> Odası&#39;nı Ölçme 4. hazırlanması Not: deneyler öncesinde, örnek ölçülecek düşünün ve örnek nasıl monte edilir ve mikroelektrot ölçümleri için hareketsiz hale getirilecek. <ol><li> Xenopus oosit ölçümleri 800 um naylon örgü (Nitex örgü) içindeki bir 1 cm&#39;lik bir karenin kesilmiş ve plastik Petri kabı (Şekil 1E) içine tutkal laevis için. </li></ol> 5. iyon akışı ölçüm <ol><li> Kalibrasyon çözeltisi ile aynı şekilde örnek ölçümler yapmak için kullanılan tampon içinde mevcut iyon konsantrasyonu ölçümü. X. laevis oositleri Mark&#39;ın Modifiye Zil (MMR) gerektirir. D100 NaCl, 2 KCI, 2 CaCl, 1 MgCl ve 5 HEPES: issolve NaCI, KCI, CaC, MgCİ ve deiyonize su içine HEPES (mM) bir son konsantrasyon elde etmek. NaOH kullanılarak 7.5&#39;e tampon pH ayarlayın. </li><li> Ölçüm odasına örnek yerleştirin ve mikroelektrot (Şekil 3A) yakın konumunu tanımlamak için micropositioner kullanarak (yaklaşık 10 mikron uzaklıkta) numune yakın iyon seçici mikroelektrot getir. </li><li> Özel yazılımı kullanarak yakın pozisyonda ve uzak (uzak) örnek bir pozisyon arasında mikroelektrot düşük frekanslı (0.3 Hz) gezi (100 mikron) başlatın. Mikroelektrot hareketi örneğinin yüzeyine dik olduğundan emin olun. Not: mikroelektrot gezi yazılımına ayarlanabilir. Büyük gezi ölçüm süre boyunca küçük tozlar daha kolay bir algılama sağlayan okuma degrade örnekleme aralığı uzatır ve zamansal çözünürlüğe azalır artar. Görmek <stRong&gt; bir örnek için Şekil 3A. </li><li> Yazılımını kullanarak kayıt başlatın. mikroelektrot her pozisyonda duraklar ve mV elektrik potansiyeli bilgisayarda kaydedilir. Sinyal stabilizasyon sağlayan, en az 2 dakika süreyle ölçümleri elde edilir. Kısa zaman atlamalı deneyler, bütün zaman elbette ilgi pozisyonunda rekor potansiyel varyasyonlar için. </li><li> Bir txt dosyası olarak verileri ayıklayın ve bir elektronik tablo dosyasına değerleri kopyalayın. </li><li> Kalibrasyon değerleri için olduğu gibi aynı şekilde mV değerlerine karşılık gelen iyon konsantrasyonu hesaplanır. Değeri çizilir. Not: Bir iyon akışı varsa, mikroelektrot iki konum (Şekil 3B) arasındaki iyon konsantrasyonu bir fark tespit eder. </li><li> (Adım 3.3.1) daha önce olduğu gibi difüzyon Fick&#39;in yasasını kullanarak iyon akı hesaplayın. </li><li> Yeni bir örnek ölçümünden önce tampon ölçümü tekrarlayın ve her yeni için akı ölçüm ve hesaplama prosedürü tekrarlayınörneği. </li></ol> 6. İstatistiksel Analiz ve Veri Sunumu <ol><li> Ve / veya karışık etkileri 28 ile ANCOVA modelini kullanarak kontrol koşulu altında iyon akıları zaman konumunun bağımsız etkilerini test edin. Not: kovaryans analizi (ANCOVA) kategorik ve sürekli hem tedbirlerin bağımsız değişkenler olarak kullanılmasına izin düzenli ANOVA ve regresyon karıştırır genel lineer model. Buna ek olarak, bireysel ve nihai iç içe etkilerine göre tekrarlanan tedbirlerle uyarılan ilişkili hataların varlığında, karma etki modelleri hem sabit hem de rastgele etkilerin doğru tahminler modellemek için kullanılır. </li><li> Çoklu test 28 için Bonferroni düzeltmesi ile grup düzeyleri arasında Student t-testi kullanılarak ikili karşılaştırmalar hesaplayın. </li><li> Kutudiyagramlar pozisyonu ve zamana göre iyon akı ölçümlerini özetlemek oluşturun. Açıklanan ikili Öğrenci t p değerleri içerir(Şekil 3D), yukarıda ve aşağıda p değerleri anlamlılık düzeyini göstermektedir: *: p &lt;0.05; **: P &lt;0.01; ***: P &lt;0.001 29 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

in vivo olarak, hücre dışı, iyon akıları başarılı ölçümü için en kritik adımlar şunlardır: gürültüsünün azaltılması, iyon seçici Mikroelektronlar ve referans elektrotunun doğru imalatı, ve örnek ve her iki elektrot arasında konumlandırılması. Gürültüyü en aza indirmek için, kayıt sistemi, tercihen de topraklı bir metal tepesinde (titreşim izolasyon) tablosu ile topraklı (topraklı) Faraday kafesi olmalıdır. Buna ek olarak, mikroskop şasi d...

<html> Tüm hayvan hücreleri dış çevreden sitoplazma ayıran bir lipid iki katmanlı zar ile çevrelenmiştir. Hücre iyonlarının 1 aktif taşıma ile, içinde bir elektrik membran potansiyelini negatif tutar. membran potansiyeli hücre zarında 2 çeşitli moleküler cihazları çalıştırmak için kullanabileceği bir depolanmış enerji kaynağıdır. Nöronlar ve diğer heyecanlı hücrelerin büyük zar potansiyelleri var. Sodyum kanallarının hızlı açılış membran potansiyeli (depolarizasyon) çöker ve nöron 2 uzunluğu boyunca taşınır aksiyon potansiyeli oluşturur. Bunların yanı sıra hızlı elektrikli değişikliklerden birçok doku ve organları oluşturmak ve uzun vadede önemli elektrik potansiyellerini korumak. Örneğin, deri ve kornea epitel oluşturmak ve iyonların yönlü pompalama (özellikle, sodyum ve klorid) 3 trans-epitel potansiyelleri ve hücre dışı elektrik akımı muhafaza. endojen hücre dışı elektrik akımı ölçümleri titreşimli prob 4-6 ve hücre zarlarının ve epitel hücre katmanlarının elektrik parametrelerinin ölçümünü sağlayan mikroelektrod sistemini 7-10 kullanarak membran veya trans-epitel potansiyellerin ölçümleri kullanırken çadır &quot;&gt;, onlar vermek katılan iyon türlerinin göstergesi. Seçici iyonofor ile Mikroelektronlar çözelti içinde spesifik iyon konsantrasyonunu ölçebilirsiniz. İyon gradyanları ya da akışkan farklı konumlarda iki veya daha fazla elektrot ile ölçülebilir. Ancak, her sonda içsel gerilim sürüklenme, farklı olabilir yanlış ölçüm ya da mevcut olmayan bir degrade bile tespit sebep olacaktır. İki nokta arasındaki düşük frekansta hareket sayede &quot;self-referans&quot; modunda kullanılan tek bir elektrot bu sorunu çözer. Şimdi iyon akışı nispeten yavaş ve istikrarlı sinyal sürüklenme arka planı görülebilir (Şekil 3B). </p&gt; iyona duyarlı bir ölçüm sistemi doku veya tek hücre yakın iyonlarının küçük bir hücre-dışı akıları tespit etmek için iyon seçici kendinden referans Mikroelektronlar kullanır. Sistem mikroelektrot hareketini kontrol etmek mikroelektrot ve mikro step motor ve sürücü sinyali işleyen bir amplifikatör oluşur. devresini kapatmak iyon seçici mikroelektrot ve ayrıca referans elektrotu bir headstage pre-amplifikatör (Şekil 1A) ile amplifikatöre bağlanır. Bilgisayar yazılımı Mikroelektrot hareketi (frekans, mesafe) parametrelerini belirler ve ayrıca amplifikatör çıkışını kaydeder. adım motoru, üç boyutlu bir micropositioner ile mikroelektrot hareketini kontrol eder. Iyon seçici mikroelektrot titreşimli düşük frekanslı ilk belirli kalsiyum akı 11 ölçmek için 1990 yılında geliştirilmiştir. Yanı sıra kalsiyum gibi, ticari erişilebilir iyonofor kokteyller şimdi MICR yapmak için kullanılabiliroelectrodes sodyum, klorür, potasyum, hidrojen, magnezyum, nitrat, amonyum, florür, lityum ya da cıva duyarlı. Temel olarak, kendi kendine referans iyon seçici mikroelektrot tekniği, bir voltmetre ile ölçülebilir bir elektrik potansiyel bir çözelti içinde çözündürüldü, belirli bir iyon aktivitesini dönüştürür. iyonofor kokteyli karışmayan sıvı iyon-değişim özelliklerine sahip (organik, lipofilik) aşamasıdır. iyonofor seçici (bağlar) belirli bir iyonlar, tersine çevrilebilir şekilde ve mikroelektrot (elektrolit) içerdiği, sulu çözeltisi ve mikroelektrot daldırılmış olduğu bir sulu çözelti (Şekil 1D) arasındaki aktarma çalışmalarının kompleksleri. Bu, iyon aktarımı, bir elektro-kimyasal denge yol açar ve mikroelektrot ve referans elektrot arasında elektrik potansiyeli değişimi voltmetre ile ölçülür. Gerilim Nernst e göre özel iyonu aktivitesinin logaritması ile orantılı olduğuiyon konsantrasyonu (Şekil 2A ve B) hesaplanmasını sağlayan quation. Şu anda, birkaç sistemler benzer bir kavram ya da ilke kullanarak iyon akışının ölçümü sağlar. Örneğin, Newman ve Shabala 14-16 tarafından geliştirilen tarama İyon seçici elektrot Tekniği (SIET) 12,13 veya Mikroelektrod Ion Akı Tahmini (MIFE) tekniği piyasada mevcut ve yaygın belirli iyonu belirlemek amacıyla araştırma topluluğu tarafından kullanılmaktadır hayvan, bitki ve tek canlı hücre modelleri çeşitli genelinde hücre zarı ve doku meydana gelen akıları. İyon seçici Mikroelektronlar serebral arter farede 18 ve polen tüpleri 19, paten retina hücreleri 20 hidrojen akı, fare kemik 21, çeşitli iyon kalsiyum akışının hidrojen, potasyum ve kalsiyum akısını bitki köklerine 17 arasında, klorür akının ölçülmesi için kullanılmıştır mantar hif 22 ve r akılarıTek hücreli yara sırasında kornea 23 ve son olarak kalsiyum akı ile 12,24 şifa. Ayrıca iyon seçici kendinden referanslı Mikroelektronlar 25 hakkında detaylı bilgi için aşağıdaki gözden bakın. aşağıdaki makale hazırlamak ve tek hücre düzeyinde iyon seçici self-referencing mikroelektrod tekniği kullanılarak endojen hücre dışı iyon akıları ölçümünü nasıl gerçekleştirileceği detaylı olarak anlatılmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>IonAmp&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>amplifier created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IonAmp32&#160;</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>software created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage pre-amplifier</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>INA116</td>
			<td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroStep Driver</td>
			<td>&#160;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td>
			<td>none</td>
			<td>three MicroStep drivers are required for X, Y and Z-positioning; created by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; Similar system can be purchased from &#8220;XBL function matters&#8221; (http://www.xuyue.org/) or from &#8220;YoungerUSA&#8221; (http://www.youngerusa.com/) or from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micropositioner&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>Model KITE-R</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>Model M10</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table&#160;&#160;</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model VW-3036-OPT-023040</td>
			<td>Similar system can be purchased from Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: angle bracket, 90&#176;, slotted faces</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Model 360-90</td>
			<td>Assemblage of the three dimantionnal micropositionner requires also Three electric rotary motors for X, Y, Z control, MPH-1 mounting arm with MCA-2 adjustable-angle post and Various Newport connectors and screws to bolt onto vibration table</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Peg-Joining Dovetail Stage 0.5 inch X Travel</td>
			<td>Newport Inc.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>460PD-X</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Part of three dimentional micropositioner: Quick-Mount Linear Stage, 0.5 inch XY Travel</td>
			<td>Newport Inc.</td>
			<td>460A-XY</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-Fil thin walled borosilicate glass capillaries without filament&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>TW150-4</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode puller&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>&#160;PC-10</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal rack</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>none</td>
			<td>Metal electrode holder made in-house by drilling 2 mm wide holes half centimeter spaced in a 10cm by 15cm rectangular base of steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>QL</td>
			<td>Model 10 Lab Oven</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silanization solution I&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85126</td>
			<td>Hazardous, handle as recommended by provider&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish; Pyrex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode/micropipette storage jar</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>E215</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dessicator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-595E</td>
			<td>Contains Drierite dessicant (W.A. Hammond Drierite Co. Ltd, Xenia, OH, USA). Place petroleum jelly on the seal to make it airtight.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pasteur pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11597722</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S97329</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8902</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>QSW-A15P</td>
			<td>with a gold 1 mm male connector and Ag/AgCl wire</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight microelectrode holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH3S</td>
			<td>with a AgCl(Ag+)pellet inside and a gold 2 mm male connector&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60872-306</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitex mesh</td>
			<td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td>
			<td>NTX750</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue; Loctite epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>500043-451</td>
			<td>Mix glue and hardener in equal parts in a plastic weighing boat and mix thoroughly. Sets quickly but leave at RT for 24 h for full curing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>99053</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1190</td>
			<td>none</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td>none</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode technique

Hayvan, bitki ve tek hücre hücreler dışarıdan sitoplazma ayıran hücre zarı olarak adlandırılan bir bariyer ile kapatılmıştır. Örneğin epitelde gibi hücre tabakaları da dış ya da çok hücreli organizmaların farklı kompartmanların iç ayıran bir bariyer oluşturur. Bu engellerin önemli bir özelliği, hücre membranları veya hücre tabakaları iyonların ayırıcı dağılımıdır. İki özellikleri bu dağılımı sağlar: 1) membranlar ve epitel belirli iyonların seçici geçirgenliğini gösterir; 2) iyonları hücre zarları ve hücre katmanları arasında pompa aracılığıyla taşınmaktadır. Bu özellikler, doku fizyolojisini korunmasında önemli rol oynarlar ve tamir sırasında, hasar sonrası ipuçlarını sinyal olarak hareket ya da patolojik koşullarda. iyon seçici kendi kendine referans mikroelektrot bu tip bir tekli hücre ve doku seviyelerinde kalsiyum, potasyum veya sodyum gibi iyonların özel tozlar ölçümleri sağlar. mikroelektrot bir iyonofor kokteyl içerirBelirli bir iyon seçici olarak geçiren. İç dolgu çözüm ilgi iyon bir dizi konsantrasyonunu içerir. mikroelektrot elektrik potansiyeli iyonunun dışında konsantrasyonu ile belirlenir. Iyon konsantrasyonu değişir, mikroelektrot potansiyeli iyon aktivitesinin günlüğünün bir fonksiyonu olarak değişir. (Nedeniyle iyon akı bir konsantrasyon gradyanı yani) ileri ve geri iyonu kaynağı veya lavabonun yanında taşındığında mikroelektrod potansiyeli iyon akışı / degrade orantılı bir genlikte dalgalanır. amplifikatör mikroelektrot sinyalini güçlendirir ve çıkış bilgisayarda kaydedilir. iyon akışı daha sonra spesifik iyon hareketliliği olarak elektrot potansiyel dalgalanma, mikroelektrot gezi ve diğer parametreleri kullanarak difüzyon Fick&#39;in yasayla hesaplanabilir. Bu yazıda iyon seçici self-referencing mikroelektrod An kullanarak dışı iyon akıları ölçmek için metodoloji detaylı tarifbazı temsilcisi sonuçlarını sunmak d.

Biz daha önce kalsiyum akını tek hücre 24 yaralama sonra görünür olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, diğer iyon akıları tek hücre yaralama üzerine ortaya olup olmadığını sordu. Biz X&#39;i kullanılan oosit, tek bir hücre yara iyileşmesi 30-34 ve elektrofizyolojik kayıt 24,35-39 için köklü bir model laevis. İlginçtir, potasyum iyonları X içinde daha konsantre olan laevis oosit (yaklaşık 110 mM) (MMR 1x: 1 mM) kullanılan h...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique at JoVE.com

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

İyon seçici Kendinden referans Mikroelektrod Tekniği Ekstraselüler Ion eriticiler Ölçümü

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

measurement-extracellular-ion-fluxes-using-ion-selective-self

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Görüntüleme.  University of California, Davis. Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Video: Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Recapitulation of an Ion Channel IV Curve Using Frequency Components

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into portions attributable to each channel type. This study demonstrates how impedance spectroscopy may be used to identify specific frequencies that highly correlate with the steady state current amplitude measured during voltage clamp experiments. The method involves inserting a noise function containing specific frequencies into the voltage step protocol. In the work presented, a model cell is used to demonstrate that no high correlations are introduced by the voltage clamp circuitry, and also that the noise function itself does not introduce any high correlations when no ion channels are present. This validation is necessary before the technique can be applied to preparations containing ion channels. The purpose of the protocol presented is to demonstrate how to characterize the frequency response of a single ion channel type to a noise function. Once specific frequencies have been identified in an individual channel type, they can be used to reproduce the steady state current voltage (IV) curve. Frequencies that highly correlate with one channel type and minimally correlate with other channel types may then be used to estimate the current contribution of multiple channel types measured simultaneously.
METHODS: Voltage clamp measurements were performed on a model cell using a standard voltage step protocol (-150 to +50 mV, 5mV steps). Noise functions containing equal magnitudes of 1-15 kHz frequencies (zero to peak amplitudes: 50 or 100mV) were inserted into each voltage step. The real component of the Fast Fourier transform (FFT) of the output signal was calculated with and without noise for each step potential. The magnitude of each frequency as a function of voltage step was correlated with the current amplitude at the corresponding voltages.
RESULTS AND CONCLUSIONS: In the absence of noise (control), magnitudes of all frequencies except the DC component correlated poorly (|R|&lt;0.5) with the IV curve, whereas the DC component had a correlation coefficient greater than 0.999 in all measurements. The quality of correlation between individual frequencies and the IV curve did not change when a noise function was added to the voltage step protocol. Likewise, increasing the amplitude of the noise function also did not increase the correlation. Control measurements demonstrate that the voltage clamp circuitry by itself does not cause any frequencies above 0 Hz to highly correlate with the steady-state IV curve. Likewise, measurements in the presence of the noise function demonstrate that the noise function does not cause any frequencies above 0 Hz to correlate with the steady-state IV curve when no ion channels are present. Based on this verification, the method can now be applied to preparations containing a single ion channel type with the intent of identifying frequencies whose amplitudes correlate specifically with that channel type.

There are technical obstacles to measuring current flux through multiple ion channels simultaneously, and later discerning what portion of the transmembrane current is due to each channel type. To address this need, this method presents a way to generate the IV curve of individual channel types using specific frequency components.

Frekans Bileşenleri kullanarak bir İyon Kanal IV Eğrisi, Rekapitülasyon

INTRODUCTION: Presently, there are no established methods to measure multiple ion channel types simultaneously and decompose the measured current into ...

Measuring Fast Calcium Fluxes in Cardiomyocytes

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to extracellular agents is predominantly regulated by the phospholipase C&beta;- G&alpha;q pathway localized on the plasma membrane which is stimulated by agents such as acetylcholine 3,4. We have recently found that plasma membrane protein domains called caveolae5,6 can entrap activated G&alpha;q 7. This entrapment has the effect of stabilizing the activated state of G&alpha;q and resulting in prolonged Ca2+ signals in cardiomyocytes and other cell types8. We uncovered this surprising result by measuring dynamic calcium responses on a fast scale in living cardiomyocytes. Briefly, cells are loaded with a fluorescent Ca2+ indicator. In our studies, we used Ca2+ Green (Invitrogen, Inc.) which exhibits an increase in fluorescence emission intensity upon binding of calcium ions. The fluorescence intensity is then recorded for using a line-scan mode of a laser scanning confocal microscope. This method allows rapid acquisition of the time course of fluorescence intensity in pixels along a selected line, producing several hundreds of time traces on the microsecond time scale. These very fast traces are transferred into excel and then into Sigmaplot for analysis, and are compared to traces obtained for electronic noise, free dye, and other controls. To dissect Ca2+ responses of different flux rates, we performed a histogram analysis that binned pixel intensities with time. Binning allows us to group over 500 traces of scans and visualize the compiled results spatially and temporally on a single plot. Thus, the slow Ca2+ waves that are difficult to discern when the scans are overlaid due to different peak placement and noise, can be readily seen in the binned histograms. Very fast fluxes in the time scale of the measurement show a narrow distribution of intensities in the very short time bins whereas longer Ca2+ waves show binned data with a broad distribution over longer time bins. These different time distributions allow us to dissect the timing of Ca2+fluxes in the cells, and to determine their impact on various cellular events.

We present a method to isolate rapid (microsecond) calcium events from slower fluxes in living cells using laser scanning confocal microscopy. The method measures fluorescence intensity fluctuations of calcium indicators by recording line scans of several hundred pixels in a cell. Histogram analysis allows us to isolate the time scales of different calcium fluxes.

Hızlı Kalsiyum Dekapanları kardiyomiyositlerde Ölçme

Cardiomyocytes have multiple Ca2+ fluxes of varying duration that work together to optimize function 1,2. Changes in Ca2+ activity in response to ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and neurotransmitter loading in synaptic vesicles. This acidification is described to be mediated by proton ATPases, coupled to ClC chloride transporters. Highly-conserved electroneutral protons transporters, the Na+/H+ exchangers (NHE) 6, 7 and 9 are also expressed in these compartments. Mutations in their genes have been linked with human cognitive and neurodegenerative diseases. Paradoxically, their roles remain elusive, as their intracellular localization has prevented detailed functional characterization. This manuscript shows a method to solve this problem. This consists of the selection of mutant cell lines, capable of surviving acute cytosolic acidification by retaining intracellular NHEs at the plasma membrane. It then depicts two complementary protocols to measure the ion selectivity and activity of these exchangers: (i) one based on intracellular pH measurements using fluorescence video microscopy, and (ii) one based on the fast kinetics of lithium uptake. Such protocols can be extrapolated to measure other non-electrogenic transporters. Furthermore, the selection procedure presented here generates cells with an intracellular retention defective phenotype. Therefore these cells will also express other vesicular membrane proteins at the plasma membrane. The experimental strategy depicted here may therefore constitute a potentially powerful tool to study other intracellular proteins that will be then expressed at the plasma membrane together with the vesicular Na+/H+ exchangers used for the selection.

Functional Characterization of Na+/H+ Exchangers of Intracellular Compartments Using Proton-killing Selection to Express Them at the Plasma Membrane

The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Endosomal acidification is critical for a wide range of processes, such as protein recycling and degradation, receptor desensitization, and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Ekstraselüler Asit Üretim Ölçüm ve Analiz Glikolitik Hızı belirleme

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the role of acidic extracellular pH in tumor aggressiveness and its underlying mechanism has not been extensively studied compared to hypoxic or nutrient starvation conditions. In addition, a well-defined culture method to mimic the acidic extracellular tumor microenvironment has not been fully reported.
Here we present a simple in vitro culture method to maintain acidic extracellular pH using reduced bicarbonate and increased lactate or HCl concentrations in the culture medium. The medium pH was sustained for at least 24 h and gradually decreased by 72 h following culture of PANC-1 and AsPC-1 pancreatic cancer cells. Three distinct acidic media conditions in this study highly upregulated pH-responsive genes such as MSMO1, INSIG1, and IDI1 compared to hypoxia or nutrient starvation. The upregulation of these genes can be used as a marker of acidic pH. These simple techniques are beneficial to elucidate underlying mechanisms of tumor malignancy under acidic tumor microenvironment. Therefore, our extracellular acidic pH culture system enables discovery of cellular acidic pH responses not only in cancer cells but also in primary cells, such as renal tubular cells, in relation to the other acidic disorders including, diabetic ketoacidosis, lactic acidosis, renal tubular acidosis, and respiratory acidosis.

The acidic tumor microenvironment plays critical roles in tumor progression. To assess the effects of acidic extracellular pH on cancer cells in vitro, we established simple acidic culture systems.

Bir hücre dışı asidik pH kültür sistemi kurulması

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...