The authors would like to acknowledge the startup fund from SUNY Albany and the access of facilities at the University at Albany Cancer Research Center.

Dikkat: Bu protokolde kullanılan çeşitli kimyasallar tahriş edici ve ciltle temas halinde zararlıdır. Malzeme güvenlik bilgi formlarını (MSDS) başvurun ve bu protokolü uygulamadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Aşama (1.1.1) &#39;da kullanılan pirana çözeltisi yüksek ölçüde aşındırıcı olan ve ajitasyon ile aside yavaş yavaş peroksit eklenmesiyle hazırlanmalıdır. Davlumbaz aşırı dikkatli bu çözüm anlaştım. Uygun göz koruması ve aside dayanıklı eldiven kullanın. Trimetilklorosilan (TMCS) (1.1.6) daha sonra, isteğe bağlı bir aşamada kullanılan aşındırıcı, tutuşabilir bir kimyasaldır. Davlumbaz bu kimyasal Kolu. Not: partiküler madde ile bulaşmayı en aza indirmek için bir temiz oda barkod slayt imalat ve kritik akış desen işlemleri gerçekleştirin. Toz partikülleri portları ve PDMS kalıp mikrokanallar engellemek ve akış-desenlendirme engel olabilir. Tek dimensiona 1. İnşaatl DNA Barkod Slide <ol><li> Barkod akış modelleri için SU-8 master hazırlanması Not: dik akış modelleri için çizimler (Şekil 1A-B), bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak oluşturulur. Bu modeller krom photomask işlenir. Maskenin Saydam alanlar SU-8 master özelliklerine karşılık gelmektedir. <ol><li> 96 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı 1% 30 H2O 2 (pirana çözeltisi): iyice 3 H 2 SO 4 oluşan bir karışım içinde, bir silikon gofret (100 mm çapında) temizleyin. Iyonu giderilmiş su ve izopropil alkol ile gofret yıkayın, bir nitrojen üfleme tabancası ile kurutuldu. </li><li> Gofret SU-8 2025 fotorezist yaklaşık 4 ml dökün. Muntazam 3000 rpm&#39;de 30 saniye daha sonra, 500 rpm&#39;de 10 saniye boyunca gofret photoresist&#39;i yaymak için programlanabilir bir sıkma kaplayıcı kullanın. Bu ~ 25 um bir kalınlığı olan bir fotorezist tabakası meydana getirir. Yavaş yavaş durmadan önce yavaşlaması eğirme izin - Bu mai içinGofret yüzeyinde eşit kaplama ntain. </li><li> Daha sonra 65 ° C &#39;de 1 dakika süre ile bir sıcak plaka üzerinde, kaplanmış gofret, fırında 95 ° C&#39;de 5 dakika daha karıştırıldı. Bu adım kaplama katılaşmaya sağlar. 5 dakika boyunca oda sıcaklığına soğutun. </li><li> Fotorezist ceket krom maskesi (Şekil 1C) yerleştirin. 20 sn için yakın-UV ışığı (350-400 nm, pozlama enerjisi 150-160 mJ / cm2) maske özellikleri Açığa. Not: krom maske tasarımı 50 mikron adımlı 20 mikron genişliğinde her biri 20 kanal içerir. Kanal zıt ucuna şeklinin bir ucundan sarma. Toplamda, 20 kanal 40 mm ~ bir uzunluğa ve yaklaşık 20 mm&#39;lik bir genişliği olan bir dikdörtgen alanı kapsar. Her bir kanal, bir girişi ve bir çıkışı karşılık gelen iki dairesel özellikleri tarafından taarruz altında kalır. Giriş ve çıkışları değiştirilebilir. </li><li> 95 ° C &#39;de 5 dakika süre ile bir sıcak plaka üzerinde ortaya gofret fırında. Yavaş yavaş oda sıcaklığına soğumaya bırakın. </li><li> Ajitasyon ile SU-8 geliştirici gofret daldırın5 dakika karıştırıldı. Izopropil alkol ve ardından taze SU-8 geliştirici küçük bir kısmı ile gofret, yıkayın. Bir azot darbe tabancası kullanarak gofret kurutun. Sabit fırında 30 dakika süreyle 200 ° C bir sıcak plaka üzerindeki bir gofret, gofret oda sıcaklığına yavaş yavaş soğumaya bırakın. Not: beyaz film, bu adımda yıkamadan sonra gözlemlenmesi durumunda geliştirme daha uzun bir süre ile ifa edilebilir. İsteğe bağlı: 10 dakika boyunca kapalı bir Petri kabındaki buhar trimetilklorsilan maruz kaldığında SU-8 ana Silanize. </li></ol></li><li> PDMS barkod kalıbının hazırlanması <ol><li> 4.0 g kür maddesi ile 40.0 gr silikon elastomer tabanı birleştirin. 10 dakika boyunca şiddetli bir şekilde ön-polimer karışımı karıştırın. Vakum altında 20 dakika boyunca gazdan arındırın. Not: 1 (baz: sertleştirici madde) kütle oranı, genel bir kural olarak, 10 kullanır. </li><li> Barkod deseni SU-8 master ile silikon gofret içeren bir Petri kabı içine prepolimerin dökün. PDMS karışımının yüksekliği yaklaşık 7.5 mm veya üzerinde olmalıdır. Petr karışım gaz çıkışınaikinci bir kez daha sonra PDMS tedavisi için izin vermek için 75 ° C&#39;de 1 saat süre ile bir karışım fırında kalan kabarcıklarını çıkarmak için i çanak. Not: adım PDMS kalıp deliklerden pim / tüp sokulması üzerine PDMS-cam bağı çok fazla gerginlik eklemekten kaçının yukarıda ~ 7.5 mm PDMS levhanın yeterli kalınlığının korumak veya önemlidir (1.3.3.1) </li><li> Bir neşter kullanılarak, dikkatli bir barkod kalıp özellikleri içerir ve gofret slab soyma PDMS levhanın alanı çevresinde kesti. </li><li> PDMS barkod kalıbın istenilen şekil elde etmek için döşemenin kenarlarını kırpın. Dalgıç biyopsi yumruk kullanarak kalıp içinden 20 delik (1.0 mm çapında) Punch. Delikler barkod desen dairesel özellikleri ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu delikler giriş ve çıkışları olarak hizmet vermektedir. </li></ol></li><li> Poli-L-lizin tek boyutlu desen (PLL) <ol><li> Bir azot darbe silah kullanarak bir poli-L-lizin kaplı cam slayt yüzeyinde türlü tozdan arındırın. Attach temiz bir cam slayt PDMS kalıp. Kalıp ve slayt kenarlar hizalanmış emin olun. </li><li> PDMS kalıp ve PLL kaplı slayt arasındaki bağı güçlendirmek için 75 ° C&#39;de 1.5 saat fırında. Bu arada, (0,5 mm&#39;lik bir iç çapa ve 1,5 mm&#39;lik bir dış çapa sahip olan 4-inçlik parçalar halinde 3-), esnek, polietilen boru 20 adet hazırlar. Not: boru parçalarının sayısı PDMS barkod kalıpta girişi sayısı karşılık gelir. Boru çift bir basınç regülatörü ile donatılmış bir azot gazı tankına PDMS barkod kalıp kanalları ile hizmet vermektedir. </li><li> Borunun her parçasının bir amaçla, paslanmaz çelikten içi boş pim (1 mm çapında) ekleyin. Aspire steril filtrelenmiş borunun en az 1 cm çözeltisi ile dolana kadar, poli-L-lisin iğne yoluyla çözeltisi. <ol><li> PDMS barkod kalıbın (Şekil 1E) girişlerine (çözelti ile doldurulmuş boru bağlı) işaretçilerini sabitleyin. Borular diğer ucunu iliştirinbir basınç ayarlı azot tankı set-up. Çözelti, en az 6 saat boyunca 0.5-1 psi&#39;lik bir basınç aralığı ile kalıp içinden akmasına izin verir. Not: Tüm akış desen prosedürleri için (1.3.3) adımına bakın. </li></ol></li></ol></li><li> SsDNA 14 Tek boyutlu desen Not: daha sonraki kademelerde kullanım fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 137 mM NaCI, 10 mM Na-2 HPO 4, ve 2 mM KH 2 PO 4 tampon, pH 7.4 hazırlanır. <ol><li> PBS içinde 2 mM bis (sülfosuksinimidil) suberat (BS3) çözeltisi hazırlayın. PBS veya aşırı saf su içinde A, B, ve C ssDNA (5&#39;-amin, 80 nükleotid değiştirilmiş) 300 uM solüsyonları hazırlayın. Not: N-hidroksisukinimid esteri kolayca hidroliz uğrar çünkü hazırlandıktan sonra yaklaşık 30 dakika içinde BS3 solüsyonu kullanın. </li><li> 2 mM bis 2,5 ul (sulfosuccinim 300 uM, B veya C ssDNA 2.5 ul birleştirinHer bir kanal. A, B, ve C, DNA PBS içinde idyl) suberat sırasıyla kanal 1, 2 için belirtilen ve 3 vardır. Bu emir ayrıca 3 kanal (Şekil 2A) kalan setleri uygulanır. </li><li> Gerçekleştirmek adım (1.3.3). Bu kez, paslanmaz çelik pimleri ile ve polietilen boru içine 5-ul BS3 / DNA çözümleri aspire, nitrojen kaynağına daha sonra çift PDMS kalıp. BS3 / DNA solüsyonu yaklaşık 40 dakika süreyle veya kanallar dolu saatlere kadar barkod kalıp akmasına izin verin. </li><li> Bir kez tüm kanallar doldurulur akış durdurma, daha sonra 2 saat boyunca oda sıcaklığında barkod BS3 / DNA çözeltisi inkübe edin. Çözüm kurumasına izin vermeyin. 75 ° C&#39;de 1 saat süre ile bağlanmış barkod slayt PDMS kalıp Bake. Not: sonraki akış desen adımlarla uyumu kolaylaştırmak için, barkod slaytta kanal desen kenarları ana hatlarıyla olabilir. Bu dikkatle elmas Scrib kullanılarak cam yüzeyi çizilmeye yapılıre cam slayt alt hizalama işaretlerini üretmek için. Protokolün sonraki aşamalarında Uyum mikroskop altında kontrol edilebilir. </li><li> Barkod slayt PDMS kalıp çıkarın. Aşırı saf su ile bir kez ve SDS üç kez% 0.01 ile hafifçe slayt yıkayın. <ol><li> Bir mikroskop lamı eğiren kullanarak barkod slayt kurulayın. Daha sonraki kullanım için temiz bir 50-ml santrifüj tüpü içinde barkod slayt saklayın. </li></ol></li></ol></li></ol> Barkod Slide One boyutlu Desen 2. Doğrulama Not: Bu doğrulama protokolü ayrıca müteakip akış desen adımlarla kalitesini değerlendirmek kullanılmak üzere adapte edilebilir. <ol><li> Slayt Engelleme <ol><li> PBS içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın. Kullanımdan önce 0,45 um şırınga filtre ile bu çözüm filtre. Bir jel yükleme ucu kullanarak, barkod sürgünün bir kenarına% 1 BSA çözeltisi 50 ul geçerlidir. </li><li> % 1 BSA solut inkübeoda sıcaklığında 1 saat için ve iyon. </li></ol></li><li> Siyanin 3 (Cy3) ile enkübasyon, tamamlayıcı DNA ile konjüge edilmiş <ol><li> Bir ucunda Cy3 konjüge edilmiş bir A kokteyli &#39;, B&#39; ve C &#39;oligonükleotidleri hazırlayın. &#39;B&#39; ve C &#39;A sekansları, sırasıyla A, B, ve C tamamlayıcı niteliktedir. Cy3-DNA çalışma konsantrasyonu,% 0.1 BSA içinde 0,05 uM&#39;dir. </li><li> Pipetleme slayt BSA çözüm çıkarın, daha sonra slayt aynı kenarında DNA kokteyl solüsyon 30 ul uygulayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında slayt üzerinde Cy3-DNA kokteyl inkübe edin. Photobleaching Cy3 parçasını korumak için karanlıkta bu kuluçka adımı gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Floresans yoğunluğunu analizi <ol><li> PBS- son olarak Cy3-DNA kokteyl üzerinden pipet ve% 1 BSA PBS slayt yıkayın ve (1 p50 parça saf su ile sanat PBS). Bir eğiren kullanarak slayt kurulayın. </li><li> Bir floresan mikroskop veya mikrodizi tarayıcı kullanılarak floresan (Şekil 2B) gözlemleyin. Bir mikrodizi tarayıcı kullanırken, 532 nm, 5 mikron piksel boyutu,% 15 photomultiplier tüp (PMT) 450 de kazanç ve güç lazer emisyon dalga boyu ayarlayın. </li></ol></li></ol> 2-boyutlu (3x3), DNA Dizisi 14 3. Fabrikasyon <ol><li> PDMS barkod kalıbının hazırlanması <ol><li> Başka bir SU-8 ana oluşturmak için prosedür (1.1) gerçekleştirin, ancak bu kez dik ilk tasarım olduğu için bir akış deseni ile krom maske kullanın. Dik deseni ile yeni bir PDMS kalıp oluşturmak için prosedür (1.2) gerçekleştirin. </li></ol></li><li> SsDNA&#39;nın İki boyutlu akış desenlendirme <ol><li> 3 x 3 dizi için, A&#39;-i B&#39;-ii 150 uM stok çözümleri, C&#39;-iii A&#39;-iv, B&#39;-v, C&#39;-vi, vii A&#39;-B hazırlamak% 3 BSA / PBS &#39;-viii ve C&#39;-ix DNA arasında değişir. Bu oligonükleotidler &quot;köprü diziler&quot; (Şekil 2A) olarak hizmet etmektedir. Oligonükleotid çözümleri (Çözümler 1 ila 3) çalışma konsantrasyonu her bir oligonükleotid için 50 uM olacak şekilde birleştirir. Tablo 1&#39;de verilen kılavuzu kullanın. </li><li> 0.5-1 psi 1 saat 20 kanala% 3 BSA / PBS engelleme çözümü Akış. </li><li> Akış Solutions 1 sırasıyla 2 ve kanal 1, 2 içine 3 ve 3,. 3 kanal daha sonraki setleri için bu siparişi izleyin. Akış genelde yaklaşık 40 dakika içinde tamamlandı. DNA hibridize izin vermek için 2 saat süre ile oda sıcaklığında DNA çözümleri inkübe edin. </li><li> Melezleşmemiş DNA kaldırmak için 0.5-1 psi 1 saat 20 kanala% 3 BSA / PBS engelleme çözümü Akış. PDMS kütüğün soyun ve% 3 BSA içinde cam slayt daldırılarak elde edilen DNA mikro-dizi slayt yıkama / PBS kez ve iki kez PBS ile seyreltilmiş PBS (1 kısım PBS ve 50 parça saf su) eklenmiştir. DBir mikroskop lamı eğiren kullanarak slayt ry. </li><li> I Cy3-konjüge edilmiş olduğu &#39;ila ix&#39; bölümü 2. oligonükleotitlerin bölgesindeki benzer ikinci bir doğrulama adımı (Şekil 2C) uygulayın. Daha sonraki kullanım için bir 50-ml santrifüj tüpü içinde 3 x 3 dizisi slayt saklayın. Not: DNA mikrodizi ay için bir kurutucuda oda sıcaklığında saklanabilir. </li></ol></li></ol> Bir Antikor Array içine 3 x 3 DNA Array 4. Dönüşüm <ol><li> Antikor-oligonükleotid (İDEAL) konjugatlarının hazırlanması <ol><li> 200 mM süksinimidil-4-formilbenzoat (S-4FB) ve susuz N, 40 mM süksinimidil-6-hydrazinonicotinamide (S-HyNic), N-dimetilformamid (DMF) oluşan çözeltiler hazırlayın. </li><li> PBS içinde antikorlarla 7 ayrı solüsyonları (1 mg / ml) &#39;ye kadar hazırlayın. Not: Antikor stok solüsyonları sodyum azid bakteriyostatik içeriyorsa, spin tuzsuzlaştırma c kullanarak PBS ile tampon değişimi gerçekleştirmek7 kDa molekül ağırlığı kesmesi (MWCO) ile olumns. </li><li> I, &#39;ii&#39; iii &#39;iv&#39; v &#39;, vi&#39; ve VII &#39;DNA ayrı 400 mcM çözüm hazırlayın. Bir oligonükleotid dizisi, her bir yakalama antikoru atama. Mikrosantrifüj tüpler DMF 12.25 ul 400 mcM DNA 40 ul birleştirin ve iyice karıştırın aşağı doğru döndürün. <ol><li> Her bir DNA / DMF çözeltisine, DMF içinde 200 mM S-4FB 2.3 ul ekle. Yakalama antikor her 100 mikrogram için, DMF 40 mM S-HyNic 2.25 ul ekleyin. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığında 4 saat boyunca antikor / S-HyNic ve DNA / S-4FB çözümler inkübe edin. </li><li> Antikor-DNA birleştirme reaksiyonunun hazırlanmasında, pH 6&#39;da sitrat tamponu ile yıkanarak yeni spin tuz giderme sütunlar (her bir antikor için, her bir DNA solüsyonu için bir tane ve bir) hazırlar. </li><li> İnkübasyondan 4 saat sonra, her antikor / S-HyNic ve DNA / S-4FB çözümü için tampon değişimi. S-4FB-konjuge birleştirin <strong&gt; i &#39;ii &quot;iii&quot;, iv&#39;, v &#39;, vi ve antikor-S-HyNic konjugatları ile VII&#39; oligonükleotidleri. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile inkübe karışımları. </li><li> Reaksiyon O / N 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Antikor-oligonükleotid (İDEAL) Konjügatların saflaştırılması Not: antikor oligonükleotidlerin saflaştırılması Bir Superose 6 10/300 GL kolonu ile donatılmış standart bir FPLC sistemi üzerinde hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) gerçekleştirmek için. <ol><li> 280 nm FPLC sistemi UV detektörü dalga boyu ayarlayın. Aşırı S-4FB-DNA&#39;dan antikor oligonükleotidlerin ayırmak için 0.3 ml / dk&#39;da PBS (pH 7.4) izokratik akışını kullanın. </li><li> Konjugatı içeren fraksiyonlar havuzu ve 10 kDa&#39;lık bir MWCO filtre kullanılarak spin 150 ul bir hacme kadar fraksiyonlar konsantre edilir. </li></ol></li><li> Antikorların İki boyutlu desen <ol><li> Microchambers veya mikro-kuyuları bize başka PDMS kalıp hazırlayınadımda ing fabrikasyon işlemleri (1,2). PDMS kalıp bağışıklık için nanoliter kuyu mikrolitre içerebilir. Not: akışkan numunelerde genel Biyomarker tespiti için birden fazla kuyu ile bir PDMS kalıp dizi slayt ile birleştirilir. PDMS kalıp özellikleri sistem çalışılan bağlıdır. Örneğin, tek bir hücre deneylerden elde edilen proteinlerin tespiti 0,15-nl hacimli microchambers ihtiva eden bir PDMS kalıp ile gerçekleştirilebilir. </li><li> (İsteğe bağlı) desenli yüzey hidrofil kılmak 1.5 dakika plazmaya PDMS kalıp temizleme (18 W) Konu. Önce plazma temizleme, doğrudan 3 x 3 dizi slayt bağlı olan tüm diğer yüzeyleri engellemek için yapışkan bant kullanın. Not: Aşama (4.3.2) isteğe bağlıdır, ancak PDMS kalıp, tek bir hücre deneylerinde kullanılmak için düşünülmüştür, genellikle gerçekleştirilir. </li><li> 3 x 3 dizi slayt PDMS kalıp Mate, daha sonra PBS içinde% 1 BSA ile bloke slayt. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Meanwhile, antikor oligonükleotid konjügatlarının bir kokteyl (200 ul nihai hacim) hazırlar. Her konjügat çalışma konsantrasyonu 1% BSA / PBS içinde 10 ug / ml &#39;dir. </li><li> Daha sonra bu şekilde bir antikor dizisine bir DNA dizisi, dönüştürme konjugatları oligonükleotid parçası 3 x 3 diziler belirli noktalar ile hibridize izin 37 ° C &#39;de 1 saat süreyle inkübe antikor oligonükleotid kokteyl ekleyin. </li><li> Temiz ve slayt kuru adımı tekrarlayın (3.2.4). Antikor dizisi derhal kullanılması durumunda en yüksek hassasiyet elde edilebilir. Uzun süreli depolama hassaslık kaybına neden olabilir. </li></ol></li><li> Proteinlerin tespit edilmesi <ol><li> Rekombinant proteinleri sulandırmak veya filtrelenmiş hücre örneği hazırlamak. </li><li> Özel tasarlanmış yongası ile mikrotertibi Mate ve 1 saat PBS içinde% 3 BSA ile yüzeyi engeller. Daha sonra BSA çözeltisi kaldırmak ve örnekleri uygulamak ve 2 saat süre ile inkübe edilir. </li><li> PBS içinde% 3 BSA kullanarak örnekleri yıkayın üç kez birsonra ürün veri sayfasında tarafından sağlanan bir konsantrasyonda tespit antikorlar ekleyin d. 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> PBS içinde üç kez% 3 BSA ile saptama antikorları yıkayın ve daha sonra 1 saat boyunca inkübasyon takip 1 ug / ml&#39;de -streptavidin siyanin 5 (Cy5) ekleyin. </li><li> Temiz ve tarama için slayt kuru adımı tekrarlayın (3.2.4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Alhamdani, M. S. S., Schroder, C., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncoproteomic+profiling+with+antibody+microarrays.">Oncoproteomic profiling with antibody microarrays.</a> Genome Med. 1 (7), (2009).</li><li>Angenendt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+protein+and+antibody+microarray+technology.">Progress in protein and antibody microarray technology.</a> Drug Discov Today. 10 (7), 503-511 (2005).</li><li>Sun, H. Y., Chen, G. Y. J., Yao, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+microarray+technologies+for+proteomics.">Recent advances in microarray technologies for proteomics.</a> Chem Biol. 20 (5), 685-699 (2013).</li><li>Fan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+barcode+chips+for+rapid,+multiplexed+analysis+of+proteins+in+microliter+quantities+of+blood.">Integrated barcode chips for rapid, multiplexed analysis of proteins in microliter quantities of blood.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1373-1378 (2008).</li><li>Chattopadhyay, P. K., Gierahn, T. M., Roederer, M., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+technologies+for+monitoring+immune+systems.">Single-cell technologies for monitoring immune systems.</a> Nat Immunol. 15 (2), 128-135 (2014).</li><li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8(+)+T+cells+using+microengraving.">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8(+) T cells using microengraving.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (10), 3885-3890 (2012).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation-based+delivery+of+cell-penetrating+peptide+conjugates+of+peptide+nucleic+acids+for+antisense+inhibition+of+intracellular+bacteria.">Electroporation-based delivery of cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids for antisense inhibition of intracellular bacteria.</a> Integr Biol-Uk. 6 (10), 973-978 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitating+cell-cell+interaction+functions+with+applications+to+glioblastoma+multiforme+cancer+cells.">Quantitating cell-cell interaction functions with applications to glioblastoma multiforme cancer cells.</a> Nano Lett. 12 (12), 6101-6106 (2012).</li><li>Kravchenko-Balasha, N., Wang, J., Remacle, F., Levine, R. D., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+cellular+architectures+are+predicted+through+the+characterization+of+two-cell+interactions.">Glioblastoma cellular architectures are predicted through the characterization of two-cell interactions.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6521-6526 (2014).</li><li>Xue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+methods+for+the+simultaneous+quantitation+of+metabolites+and+proteins+from+single+cells.">Chemical methods for the simultaneous quantitation of metabolites and proteins from single cells.</a> J Am Chem Soc. 137 (12), 4066-4069 (2015).</li><li>Shi, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+proteomic+chip+for+profiling+intracellular+signaling+pathways+in+single+tumor+cells.">Single-cell proteomic chip for profiling intracellular signaling pathways in single tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (2), 419-424 (2012).</li><li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells.">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nat Med. 17 (6), 738-743 (2011).</li><li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+microfluidic+chip+system+for+single-cell+secretion+profiling+of+rare+circulating+tumor+cells.">An integrated microfluidic chip system for single-cell secretion profiling of rare circulating tumor cells.</a> Sci Rep. 4, 7499 (2014).</li><li>Vermesh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density,+multiplexed+patterning+of+cells+at+single-cell+resolution+for+tissue+engineering+and+other+applications.">High-density, multiplexed patterning of cells at single-cell resolution for tissue engineering and other applications.</a> Angew Chem Int Ed. 50 (32), 7378-7380 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+single-cell+functional+proteomics+for+fundamental+and+applied+biomedical+applications.">Microfluidics-based single-cell functional proteomics for fundamental and applied biomedical applications.</a> Annu Rev Anal Chem. 7, 275-295 (2014).</li><li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-encoded+antibody+libraries:+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins.">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> J Am Chem Soc. 129, 1959-1967 (2007).</li><li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+protein-protein+cross-linking.">General protein-protein cross-linking.</a> Methods Enzymol. 539, 81-87 (2014).</li><li>Ahmad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotics+platform+for+automated+batch+fabrication+of+high+density,+microfluidics-based+DNA+microarrays,+with+applications+to+single+cell,+multiplex+assays+of+secreted+proteins.">A robotics platform for automated batch fabrication of high density, microfluidics-based DNA microarrays, with applications to single cell, multiplex assays of secreted proteins.</a> Rev Sci Instrum. 82, 094301 (2011).</li></ol>

The authors have no competing interests to disclose.

Akış desen tasarımı 2-D mikrotertibi imalatı ilk kritik adımdır. Bir cam substrat üzerinde iki çakışan DNA desenleri oluşturmak için, ilk tasarım özellikleri, ikinci kanal (Şekil 1A-B) olan dik olmalıdır. Tasarımları da mikrotertibin aşağı uygulamalarını düşünün. Tek bir hücre analizi durumunda, mikro-dizi, bu nedenle kanal boyutları 2-D dizileri aynı hizaya microchambers uyumlu yapılır microchambers içine tek hücre proteinleri tespit etmek için kul...

Antikor mikroarrayleri çok protein biyo-1-3 de dahil olmak üzere hedef proteinler, varlığını incelemek için yıllardır proteomik çalışmalarda kullanılmıştır. Bu alan şu anda böyle kütle spektrometresi (MS) gibi diğer yüksek verimli teknolojilerin büyük zorluklarla karşı karşıya olmasına rağmen, bu cihazlar diğer tahlillerde basit veri yorumlama ve kolay arayüzü göze başlıca nedeni, hala antikor mikrodizilerinin programı için oda bol. Son yıllarda, mikroçip iskelelerinin içine microarrays entegrasyonu antikor mikrodizisini 4-7 gelişmek için yeni bir fırsat sağladı. Örneğin, bir tek hücre mikroçip entegre barkod mikroarray hücre iletişim çalışmaları 8,9 kullanılmıştır. Bu teknoloji mevcut diğer mikroarray teknolojilere kıyasla belirgin avantajları vardır. Geleneksel mikroarray Elemen kullanılan tipik 150 mikron boyutunda çok daha küçük 10-100 um en dizi öğelerine sahipts. Daha küçük dizi elemanlarının yapımında sistematik bir akım-desen yaklaşımlar kullanılarak elde edilir ve bu da tek hücreli salgılanan proteinleri ve hücre içi proteinleri tespit kompakt mikrodiziler yol açmaktadır. Bir başka avantaj, basit bir alet içermeyen kurulum kullanılmasıdır. En laboratuarlar ve küçük şirketler mikrodizin çekirdek tesisleri erişmek mümkün olmayabilir, çünkü bu özellikle önemlidir. Bu barkod antikor mikrodizileri deney hacmi geliştirilmiş özelliği geleneksel sandviç enzim-bağlı immünosorbent deneyi ile karşılaştırılabilir yüksek hassasiyet ve özgüllük (ELISA 8) elde ederken tek hücreler üzerinde oldukça çoğaltılmış çok katlı testleri gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknoloji tümör hücrelerini 13 glioblastoma 9-11 proteinleri, T hücreleri 12 tespit ve dolaşımdaki sayısız uygulamaları bulmuştur. Alternatif olarak, barkod DNA mikrodizileri yalnız taklit eden için nöronların ve astrositlerin hassas konumlandırma kullanılmıştırBeyin dokusunda 14 in vivo montajını ing. Bu protokol, sadece deneysel adımlar ve akışkan numunelerde biyomarkerların tespiti potansiyel uygulamalar vardır, iki boyutlu (2-D) barkod antikor mikroarray birikmesi bloklar ve tek hücre odaklanır. Teknoloji adresli, tek sarmallı tek boyutlu (1-D) DNA mikro-dizisi dayanan cam yüzeylerde mekansal desenli ortogonal oligonükleotidler kullanılarak oluşturulabilir. Paralel akış kanalları akış desen aşamasında kullanılan zaman 1-D desen oluşturulur ve böyle bir model 1-D, Evrensel Ürün Kodu (UPC) barkod görsel olarak benzer ayrı bantlar olarak görünür. 2-D (n x m) antikor dizisinin yapım - 2-B Quick Response (QR) matris kod anımsatan - daha karmaşık desenlendirme stratejilerini gerekiyor, ancak daha yüksek bir yoğunluğa 8,15 olarak antikorların immobilizasyonu sağlar. Uydurmaikinci dik ilk şekil iki DNA model verme adımları gerektirir. Bu iki desen kesişme noktaları dizisi n x m unsurlarıdır. Stratejik akış desen kullanılan tek şeritli DNA (ssDNA) dizileri seçerek belirli bir dizideki her eleman belirli bir adresi atanır. Bu mekansal referans mikrodizi slayt floresan sinyalleri ayırt gereklidir. SsDNA dizisi (İDEAL 16), DNA tarafından kodlanan bir antikor kütüphanesi olarak bir platform oluşturan tamamlayıcı DNA-antikor konjugatları dahil edilmesi yoluyla bir antikor dizisine dönüştürülür. Bu video protokol iki yönlerde hazırlanması dahil nxm antikor dizileri polidimetilsiloksan (PDMS) barkod kalıpları, akış-desen oluşturma ssDNA antikor oligonükleotid İDEAL konjugatlarının hazırlanması ve 3 içine 3 x 3 DNA dizisi dönüştürülmesi önemli adımları açıklamaktadırx 3 antikor dizisi.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td><td>Dow Corning</td><td>3097366-1004</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafers&amp;nbsp;</td><td>University Wafers</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine coated glass slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>C40-5257-M20</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>*Custom-ordered from Integrated DNA Technologies, see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;.</td></tr><tr><td>Poly-L-lysine adhesive stock solution</td><td>Newcomer Supply</td><td>1339</td><td></td></tr><tr><td>Bis (sulfosuccinimidyl) suberate&amp;nbsp; (BS3)</td><td>Thermo Scientific</td><td>21585</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate buffered saline, pH 7.4</td><td>Quality Biological</td><td>114-058-101</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta Explorer 100 Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) System</td><td>GE (Amersham Pharmacia)&amp;nbsp;</td><td>18-1112-41</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Capture antibodies</td><td>various</td><td>various</td><td>*Antibody selection depends on application</td></tr><tr><td>Succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide (S-HyNic)</td><td>Solulink</td><td>S-1002</td><td></td></tr><tr><td>Succinimidyl-4-formylbenzamide (S-4FB)</td><td>Solulink</td><td>S-1004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid, anhydrous</td><td>Acros</td><td>42356</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra spin filter 10 kDa MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-650-MZ</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch with plunger (1.0 mm diameter)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15110-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamond scribe (Style 60)</td><td>SPI supplies</td><td>6004</td><td></td></tr><tr><td>Trimethylchlorosilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92361</td><td></td></tr></tbody></table>

flow-pattern guided fabrication of high-density barcode antibody microarray

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this report, we renovate the antibody microarray technology by using a novel approach for manufacturing and by introducing new features. The fabrication of our high-density antibody microarray is accomplished through perpendicularly oriented flow-patterning of single stranded DNAs and subsequent conversion mediated by DNA-antibody conjugates. This protocol outlines the critical steps in flow-patterning DNA, producing and purifying DNA-antibody conjugates, and assessing the quality of the fabricated microarray. The uniformity and sensitivity are comparable with conventional microarrays, while our microarray fabrication does not require the assistance of an array printer and can be performed in most research laboratories. The other major advantage is that the size of our microarray units is 10 times smaller than that of printed arrays, offering the unique capability of analyzing functional proteins from single cells when interfacing with generic microchip designs. This barcode technology can be widely employed in biomarker detection, cell signaling studies, tissue engineering, and a variety of clinical applications.

PDMS kalıplar (Şekil 1A-1B) için tasarımlar CAD programı (AutoCAD) kullanılarak çizildi. Akış desenlendirme, yatay diğeri dikey için özellik kanalları gösterilen iki tasarımlar. Her tasarımın sol ve sağ parçaları simetriktir; ya onları girişleri veya çıkışları olabilir. 20 kanalın her biri tüm yol diğer ucunda bir ucundan virajlı. Her tasarımın bir krom photomask (Şekil 1C) yazılıdır. Bir gofret fabrikasyon SU-8 ana <...

Watch this Scientific Journal Video about Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray at JoVE.com

Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir.

Antibody microarray as a well-developed technology is currently challenged by a few other established or emerging high-throughput technologies. In this ...

flow-pattern-guided-fabrication-high-density-barcode-antibody

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.4K Görüntüleme.  University at Albany, State University of New York.  Bu protokol hücre sinyal çalışmalar ve biyolojik belirteç tespiti potansiyel uygulamalar ile büyük ölçekli imalat, mültipleksli iki boyutlu DNA veya antikor dizisi, özetlemektedir. 

Video: Flow-pattern Guided Fabrication of High-density Barcode Antibody Microarray

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Kanser Araştırmaları

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has relevant health and economic consequences. Many cyanobacterial strains are toxin producers, and only a few cells are necessary to induce irreparable damage to the environment. Therefore, water-body authorities and administrations require rapid and efficient early-warning systems providing reliable data to support their preventive or curative decisions. This manuscript reports an experimental protocol for the in-field detection of toxin-producing cyanobacterial strains by using an antibody microarray chip with 17 antibodies (Abs) with taxonomic resolution (CYANOCHIP). Here, a multiplex fluorescent sandwich microarray immunoassay (FSMI) for the simultaneous monitoring of 17 cyanobacterial strains frequently found blooming in freshwater ecosystems, some of them toxin producers, is described. A microarray with multiple identical replicates (up to 24) of the CYANOCHIP was printed onto a single microscope slide to simultaneously test a similar number of samples. Liquid samples can be tested either by direct incubation with the antibodies (Abs) or after cell concentration by filtration through a 1- to 3-&#956;m filter. Solid samples, such as sediments and ground rocks, are first homogenized and dispersed by a hand-held ultrasonicator in an incubation buffer. They are then filtered (5 - 20 &#956;m) to remove the coarse material, and the filtrate is incubated with Abs. Immunoreactions are revealed by a final incubation with a mixture of the 17 fluorescence-labeled Abs and are read by a portable fluorescence detector. The whole process takes around 3 h, most of it corresponding to two 1-h periods of incubation. The output is an image, where bright spots correspond to the positive detection of cyanobacterial markers.

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Saptamak için deneysel protokol<em&gt; Siyanobakteri</em&gt; Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

Çevre

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...

Genetik

Multiplexed Barcoding Image Analysis for Immunoprofiling and Spatial Mapping Characterization in the Single-Cell Analysis of Paraffin Tissue Samples

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is an effective methodology for tumor evaluation that improves the understanding of the tumor microenvironment. The visualization of protein expression in formalin-fixed, paraffin-embedded&#160;tissues is achieved when a specific fluorophore is annealed to an antibody-bound barcode via complementary oligonucleotides and then sample imaging is performed; indeed, this method allows for the use of customizable panels of more than 40 antibodies in a single tissue staining reaction. This method is compatible with fresh frozen tissue, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, cultured cells, and peripheral blood mononuclear cells, meaning that researchers can use this technology to view a variety of sample types at single-cell resolution. This method starts with a manual staining and fixing protocol, and all the antibody barcodes are applied using an antibody cocktail. The staining fluidics instrument is fully automated and performs iterative cycles of labeling, imaging, and removing spectrally distinct fluorophores until all the biomarkers have been imaged using a standard fluorescence microscope. The images are then collected and compiled across all the imaging cycles to achieve single-cell resolution for all the markers. The single-step staining and gentle fluorophore removal not only allow for highly multiplexed biomarker analysis but also preserve the sample for additional downstream analysis if desired (e.g., hematoxylin and eosin staining). Furthermore, the image analysis software enables image processing-drift compensation, background subtraction, cell segmentation, and clustering-as well as the visualization and analysis of the images and cell phenotypes for the generation of spatial network maps. In summary, this technology employs a computerized microfluidics system and fluorescence microscope to iteratively hybridize, image, and strip fluorescently labeled DNA probes that are complementary to tissue-bound, oligonucleotide-conjugated antibodies.

Multiplexed barcoding image analysis has recently improved the characterization of the tumor microenvironment, permitting comprehensive studies of cell composition, functional state, and cell-cell interactions. Herein, we describe a staining and imaging protocol using the barcoding of oligonucleotide-conjugated antibodies and cycle imaging, which allows for the use of a high-dimensional image&#160;analysis technique.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Multiplexed imaging technology using antibody barcoding with oligonucleotides, which sequentially detects multiple epitopes in the same tissue section, is ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Biyoloji

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Fabrikasyon ve mikroçevresindeki microarrays Kullanımı (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detecting Circulating Anti-Glycan Antibodies with a Printed Glycan Array

Source: Olivera-Ardid, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57662">Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
This video demonstrates printed glycan array technology for analyzing circulating anti-glycan antibodies in mouse serum. The antibodies in the serum interact with specific glycans on the chip, which is confirmed by immunostaining followed by fluorescence scanning.

Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Glycochips Production

	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

A Peptide Microarray Technology for Specificity Profiling of Antibodies

Source: Cornett, E. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55912">Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates a technique that applies peptide microarray technology to profile the specificity of antibodies recognizing post-translational modifications (PTMs) on histone peptides. A microarray slide containing immobilized fluorophore-conjugated histone peptides with known PTM combinations is treated with target PTM-specific antibodies. This process helps identify the antibody&#39;s specificity for the target and its potential cross-reactivity with non-target PTMs.

Antikorların Özgüllük Profili için Bir Peptit Mikroarray Teknolojisi

1. Designing the Array Slide and Source Plate Layout

	Under the &#39;Plan a slide layout&#39; heading on the ArrayNinja interface, click on the link that ...

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

Yüksek yoğunluklu Barkod Antikor Mikroarray Akışı-desen Rehberli Fabrikasyon

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler