Name: using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].

Bu video-makale yayınlanması Zeiss tarafından desteklenmektedir.

Morphogenesis embriyoyu şekillendiren ve birlikte büyüme ve farklılaşma ile olgun ve çok hücreli organizma içine döllenmiş yumurtadan ontogenezini sürücüler süreçtir. Hayvan gelişimi esnasında morfogenetik işlemler sağlıklı bir canlı örneklerin 1-3 görüntüleme iyi analiz edilebilir. Böyle bütün embriyo görüntüleme sürücü ve sinyal molekülleri degradeler, ekstraselüler matriks, damarsal, innervasyon yanı sıra çevredeki dokuya mekanik özellikleri de dahil olmak üzere gelişimini düzenleyen tüm bileşenleri korur olmasıdır. morphogenesis meydana geldiği terazi, köprü, hızlı hücre içi olaylar saatler ya da günler boyunca tüm doku gelişimi bağlamında bir dakikalık bir zaman ölçeğinde ele gerekir. Bütün bu ihtiyaçları karşılamak için dik düzlem aydınlatma mikroskobu 5 modern bir uygulama 4 geliştirildi. Başlangıçta, bu Seçici Düzlem Aydınlatma Mikroskobu (SPI seçildiE) 4; Şimdi bir all-kucaklayan vadeli Işık Sac Flüoresan Mikroskobu (LSFM) genellikle kullanılır. Lazer tarama veya eğirme disk konfokal mikroskoplar 6,7 daha az fototoksisite uyaran ederken LSFM, yüksek zaman çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. Günümüzde, zaten orada temel ışık levha aydınlatma ilkesinin birçok uygulamaları vardır ve görüntü araştırmacılara 8-11 daha önce erişilemeyen örneklerin ve süreçlerin büyük bir çeşitlilik kullanılmıştır. Biz ilk geleneksel konfokal mikroskopi yaklaşımlar üzerinde LSFM birkaç önemli avantajlar vurgulamak istiyorum: Canlı görüntüleme mikroskobik deneylerden anlamlı sonuçlar elde etmek için, gözlem sadece minimal örneği etkiler önemlidir. Ancak, zebrafish dahil olmak üzere birçok organizmalar fototoksisite ef olmadan yüksek zaman çözünürlüğü ile konfokal mikroskop görüntü için onları zorlu hale lazer ışığına maruz kalınmasına çok duyarlıdırdurmuş veya gecikmiş gelişme 6,7 gibi kusurlarından. LSFM şu anda numune 7 üzerinde en yıkıcı etkilere sahip floresan görüntüleme tekniğidir. ince lazer ışığı levha, belirli bir zaman noktasında görüntülü numunenin sadece bir kısmını aydınlatan bu yana, ışık levha mikroskobu çok verimli fotonları kullanıyor. Sonuç olarak, düşük ışık pozlama sağlıklı örneklerin uzun zaman atlamalı gözlemler, örneğin 12-17 sağlar. Ayrıca, LSFM minimal invaziv sayesinde, elde edilen görüntü sayısı artık değil, işlenmiş ve saklanabilir ne kadar veri numune tahammül ne kadar ışık tarafından belirlenir. yakın fizyolojik koşullarda numune tutmanın aynı çizgide, LSFM canlı embriyoları için uygun bir alternatif örnek montaj stratejileri ile birlikte geliyor. LSFM teknikleri, embriyolar genellikle düşük yüzde agaroz ince bir sütun içinde gömülürler. mountinve aynı anda birden fazla görüşlerinden (LSFM görünümü olarak işaret edilmektedir) agaroz silindirlere g dönme özgürlüğü için sağlar, böylece örnek mükemmel bir açıdan görülmektedir. Multiview görüntüleme ve sonraki bakıslı füzyon büyük, saçılma örnekler için özellikle yararlıdır ve yüksek, izotropik çözünürlük ile yakalamak sağlar. Diğer olası LSFM montaj stratejilerinin bir özeti E. Reynaud ve laboratuvarı tarafından yazılı numune hazırlama bölümünde, resmi mikroskop kullanma kılavuzunda bulunabilir. Burada açıklanan daha gol görüntü farklı örnekler, özellikle önerilen bir okuma olduğunu. LSFM görüntü elde etme lazer tarama konfokal mikroskop karşı, geniş bir alan kamera bazlıdır. Bu daha yüksek bir sinyal-edinilen görüntüler için gürültü oranı (SNR) ile sonuçlanır ve (on saniye başına kare yüzlerce) son derece hızlı olabilir. LSFM yüksek hassasiyet daha zayıf floresan samp görüntülenmesine olanakles yakın gelecekte endojen seviyeleri 18 veya ifade transkripsiyon faktörü gibi, endojen proteinler / Cas9 CRISPR kullanılarak etiketlendi. yüksek SNR de başarılı alt görüntü analizi için önemlidir. yüksek hız yeterince hızlı birden çok kez gelen bütün embriyo sadece hızlı hücre içi süreçleri yakalamak için gerekli olan, ama aynı zamanda görüntü edilir. gözlenen fenomen ayrı görünümlerde gelen bu birkaç z yığınlarının satın alma sırasında değişmez birden çok görüş kusursuz birleşimini sadece elde edilebilir. LSFM avantajları genellikle görüntü kalitesi pahasına gelmiyor. LSFM yanal çözünürlüğü konfokal mikroskop çözünürlüğü biraz daha kötüdür. LSFM kullanılan algılama hedefleri alt sayısal açıklık standart konfokal kurulumları su veya silikon daldırma hedeflerinin 1.2-1.3 göre (genellikle 1.0 veya daha az) var olmasıdır. Buna ek olarak, bağlı LSFM geniş alan algılama (kadar AbsenBir iğne deliğinin ce), bir konfokal mikroskop göre daha out-of-odak ışık yoktur. -dışı odaklanan ışık miktarı, ışık tabaka kalınlığına göre belirlenir. Bununla birlikte, bu dezavantajları LSFM yüksek SNR tarafından telafi edilir. Uygulamada, bu örneğin disk konfokal edinimi 15 iplik ile karşılaştırıldığında benzer kaliteli görüntüler elde edilir. Sonuç olarak, bu hücre soyu 15,19 izlemek için, hücre zarlarının veya çekirdekleri, örneğin gibi özelliklerin güvenilir okunmasını sağlar. LSFM eksenel çözünürlük ışığı tabaka kalınlığı ile, bulgulama hedefi ek olarak belirlenir. Bazı durumlarda LSFM can eksenel çözünürlüklü konfokal mikroskoplar çözünürlüğünü aşacak. Işık tabaka genellikle düşük büyütme amacı ile görüntülenmiş büyük örnekler için meydana algılama hedefi, eksenel çözünürlüğü daha ince olduğunda ilk olarak, çözünürlük iyileştirme geliyor. LSFM ach nasıl ikinci yol,daha eksenel çözünürlük ieve, farklı görünümler yüksek xy çözünürlüklü bilgileri bir görüntü yığını haline kombine edildiği Multiview füzyon vardır. Elde edilen birleştirilmiş yığın yanal yönde 20,21 çözünürlük değerlerini yaklaşan bir izotropik çözünürlüğe sahiptir. Bu makalede açıklanan birbirinin üzerine birden çok kez kayıt için strateji numunesinin 20,21 civarında agaroz gömülü mutemet belirteç olarak floresan polistiren boncuklar kullanarak dayanmaktadır. LSFM ticarileştirme bir sonucu olarak, bu teknik, bilim adamları 22 geniş bir topluluğa kullanılabilir. Bu nedenle, bu protokolü yazma motivasyon LSFM pratik deneyim eksik gelişimsel biyologlar için bu teknoloji erişilebilir hale getirmek ve bu bilim adamlarının örnekleri ile bu teknolojiyi kullanmaya başladı elde etmektir. Bizim protokol kavramsal olarak basit mikroskop t oluşturan hafif ticari levha mikroskobu kullanırşapka kullanımı kolaydır. Biz ayrıca, belirli sorulara 23-25 ​​cevaplamak için uygun olabilir ev inşa LSFM kurulumları ile zebrafish görüntülenmesi için diğer son protokolleri bahsetmek istiyorum. LSFM başka giriş seçeneği daha geniş bir topluluğa ışık sac mikroskobu getirmek için açık erişim ilkeleri kullanmak açık platformlar 26,27 vardır. donanım ve yazılım yönlerini hem dokümantasyon http://openspim.org ve https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/ bulunabilir. Bu protokol, biz LSFM ile gelişim süreçlerini incelemek için bir model sistem olarak teleost zebrafish kullanın. zebra balığı göz morfojenezini LSFM yararlarının çoğu altını bir örnektir. LSFM zaten Medaka 28 ve Zebra balığı 29,30 göz gelişimini araştırmak için geçmişte kullanılan olmuştur. Göz gelişiminin erken aşamada geleneksel mikroskopi için doğru embriyo yönlendirmek için karmaşık,hantal sarısı olarak embriyonun göz hedefini bakacak şekilde yan yatmak izin vermez. Bununla birlikte, LSFM bir agaroz kolonuna montaj, örnek yeniden üretilebilir konumlandırılabilir. Ayrıca, optik fincan sahneye optik vezikül geçiş sırasında, göz, büyük z yığını ve bakış büyük bir alanı yakalama gerektirir büyüme ile birlikte önemli morfogenetik düzenlenmeleri uğrar. Ayrıca bu sorunlar için LSFM geleneksel konfokal görüntüleme üstündür. optik fincan oluşumu süreci nedenle anlamak ve bir görünümden görüntüleme ile sadece görselleştirmek için zor, üç boyutludur. Bu izotropik çözünürlük ile çok bakıslı görüntüleme yararlı hale getirir. optik fincan oluşumundan sonra, retina lazer maruz giderek duyarlı hale gelir. Bu nedenle, LSFM ile bağlantılı düşük fototoksisite uzun süreli görüntüleme için önemli bir avantajdır. Burada eski Zebra balığı bir embriyolar bir ila üç gün görüntüleme için optimize edilmiş bir protokol mevcutgöz gelişimi odaklı nd larva. Bizim yöntem yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip 12-14 saat kadar kapsayan time-lapse video kaydı yapabilirsiniz. Bu teknik kaçınılmaz sık terabayt aralığında, büyük veri kümelerini oluşturur da önemlisi, biz de LSFM önemli bir adımdır veri işleme için bir boru hattı göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>Lightsheet Z.1 microscope</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Roth</td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Sigma</td><td>A4018 or A9414</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>500 nm red fluorescent beads F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;l (1&amp;nbsp;mm inner diameter, marked black) capilllaries</td><td>Brand</td><td>701904</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Teflon tip plungers for 20&amp;nbsp;&amp;mu;l capillaries</td><td>Brand</td><td>701932</td><td>sold as spare part for transferpettor</td></tr><tr><td>Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17&amp;nbsp;mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-rings for chamber windows 17&amp;times;1.5 mm</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers, style 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes</td><td>Becton Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Links&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Link 1 Multiview reconstruction application</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration&lt;/a&gt;&lt;br /&gt;&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&quot;&gt;http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataViewer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataViewer&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 4 Multiview reconstruction application-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&quot;&gt;https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Link 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/BigDataServer&quot;&gt;http://fiji.sc/BigDataServer&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

using light sheet fluorescence microscopy to image zebrafish eye development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

LSFM ölçekler arasında gelişimsel süreçleri görüntülenmesi için ideal bir yöntemdir. Çeşitli uygulamalar, hücre içi yapılarda, hem de hücre ve tüm dokuların hem kısa hem de uzun dönem görüntü elde etmeyi gösteren Burada derlenmektedir. Bu örnekler aynı zamanda LSFM retina nöron optik fincan oluşumu göz gelişiminin çeşitli aşamalarında yararlı bir araç olduğunu göstermektedir. Film 1 ilk sağlam bir embriyonun bir uzaklaştırdınız görünümünü gösteren, genel LSFM yaklaşımının bir örneği olarak hizmet vermektedir aydınlık agaroz silindir gömme ve daha sonra floresan kanal retinanın ayrıntılı bir görünüm gösteren. <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. Zebra balığı retina LSFM LSFM yaklaşım göstermek için, bu film embriyo a içinde bozulmadan görüntülü aydınlık ilk gösteriyorfloresan geçmeden önce silindiri garose. Daha sonra görüş büyük bir alan bütün retinanın gözlem sağlayan gösterilmiştir. Sonraki film iyi hücre içi çözünürlük vurgulamak için retinanın büyütülmüş küçük bölgesini gösterir. Bir Ath5 GAP-GFP 37 transgenik zebrabalıkları embriyo görüntüleme için kullanılmıştır. Bu transgen retina (özellikle ganglion hücrelerinin ve fotoreseptör öncüleri) farklı nöronlar etiketler. Filmin floresan kısmı 5 dk aralıklarla 40X / 1.0 W objektif kullanarak çift taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak ele geçirildi. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Film 2 çok hızlı hücre içi olaylar yüksek çözünürlüklü yakalanabilir nasıl gösteriyor; Mikrotübüllerin büyümesi bu durumdaonların artı retina nöronal progenitör hücrelerin biter. Filmde yer alan bilgiler mikrotübül artı uç büyüme takibi ve ölçümü için izin verir. <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Film 2:. Tek bir hücrede Mikrotubul dinamikler Bu film artı uç işaretleyici protein EB3-GFP 38 etiketli mikrotübül artı ipuçları büyüyen yakalar. proteinin tek retina projenitör hücrede ifade edilir. mikrotübül bazal apikal yönden ağırlıklı olarak büyüyen (yukarıdan aşağıya). EB3 kuyruklu ortalama hızı 0.28 ± 0.05 mm / sn olarak ölçüldü. yüksek mikrotübül çekirdeklenme etkinliği arzeden hücrenin apikal tarafında parlak nokta sentrozom olduğunu. vahşi tip embriyo hsp70 enjekte edildi: EB3-GFP plazmid DNA. Film, yaklaşık 28 hrpost fertiliz ısı şoku (37 ° C&#39;de 15 dakika) sonra, 4 saat satın alındıtirme 63X / 1.0 W objektif ve 1 sn zaman aralıkları kullanılarak tek taraflı aydınlatma ile kayıt tek bir görünümde olarak (hpf). Tek hücre retinanın çoğunluğu kapsayan bir görüş alanından kırpılmış. İki dilim projeksiyon gösterilmiştir maksimum yoğunluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a> Şekil 3, ne hücre içi yapıların uzun saatler boyunca takip edilebilir. Burada, retina ganglion hücrelerinin (RGCs) translocating içinde sentrozom yakalanır. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Şekil 3:. Retina ganglion hücre translokasyonu sırasında Sentrozom yerelleştirme time-lapse deney Bu montaj retina ganglion hücre (RGC) olgunlaşma boyunca sentrozom konumunu gösterir.nöronal atalarıdır içinde sentrozom apikal süreci (1:00) en ucunda lokalize olur. hücre bölünmesi sırasında, iki sentrozomlar mitotik (2:25) için kutuplar olarak hizmet vermektedir. Bu bölünme, bir RGC ve fotoreseptör hücre öncülü olan bir ikinci kızı hücre içine ayıran bir kızı hücrede sonuçlanır. apikal süreç apikal tarafında bağlı kaldığı sürece ikiye ayrılmasından sonra, RGC hücre gövdesi, retinanın bazal tarafına translocates. RGC bazal tarafı ulaştığında, onun apikal süreç ayırır ve sentrozom o (06:15) ile hareket eder. kademeli apikal işlem (06:50, 07:20, 08:10) ile birlikte geri çekme sırasında sentrozom takip edilebilir. sentrozom hala apikal lokalize iken son karede yer (08:55) ganglion hücre, kendi bazal taraftan bir akson büyüyor. mozaik ifadesi, bir hücre aşamasında vahşi tip embriyo plazmid DNA enjeksiyonu yoluyla elde edilmiştir. Hücreler Ath5 tarafından görüntülenmiştir: GFP CAAX (yeşil) constRGCs ve diğer nöronlar etiketler dürme. Sentrozomlar (ok başları) fotoseli-tdTomato 29 ifadesi (kırmızı) ile etiketli. retinanın apikal yan altındaki görüntünün üst ve bazal tarafında yer almaktadır. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 saat sonra döllenme (hpf) başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 10 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 4&#39;te görüntülendiğinde, bu tür Movie 1 deki gibi tüm doku yakalama veri elde edilebilir nasıl tek bir hücre davranışı. Bir RGC Translokasyon kolaylıkla takip ve apikal ve bazal süreç olabilires izledi. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Şekil 4:., Şekil 3&#39;te açıklandığı gibi, tek bir retinal ganglion hücre Translokasyon retina taban tarafına apikal arasında RGC translokasyon terminali mitoz sonra ortaya RGC Ath5 sentezlenmesiyle etiketlenmiştir. Boşluk GFP 37 transgen. 30 mikron kalınlığında hacminin maksimum intensite projeksiyon gösterilmiştir. görüntüler tüm retina kapsayan bir filmden kırpılmış edildi. Film yaklaşık 34 hpf başlar. Bir z yığını 40X / 1.0 W amacı ile her 5 dakikada bir satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 5 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 5 doku sc yakalamak için Multiview LSFM yeteneğini gösteriroptik vezikül bir optik fincan dönüşür sırasında optik fincan morfolojilerinden örnek hücresel çözünürlük ile bira morfogenetik süreçler. Görüntü kalitesi büyük ölçüde son görüntüyü izotropik çözünürlükte bir z yığını içine (bu durumda) 5 farklı görüşlerin dışında bilgilerden birleştirilir çok bakıslı görüntüleme, geliştirilebilir. Bu rakam Multiview Dekonvolüsyonun sonrası ağırlıklı ortalama füzyon ve görüntü aksine daha fazla kazanç ve çözünürlük sonra görüntü kalitesinde iyileşme göstermektedir. Şekil veri kümesi aracılığıyla farklı yönlerde iki optik dilimleri gösterir. Ayrıca, deconvolved veri kümesinden bir montaj zamanla optik fincan morfolojilerinden gösterir. Tüm zaman noktaları daha sonra Film 3&#39;de gösterilmiştir. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Şekil 5: tek bir görünümde ve multiv iki yöntem arasındaki görüntü kalitesi karşılaştırılmasıiew füzyon. (A) yan görünümü ve (B) dorsal görünümünden gösterilen tek görünüm verilerinin Bir adet optik dilim. Şerit eserler ve örnek içindeki derin sinyal bozulması belirgindir. Ayrıca kaynaşık verileri (CF) görünür resmin bir bölümü bu farklı görünüşünde yakalanan değildi. (C) aynı optik dilim, Multiview kaynaşmış veriler Lateral görünümde ve (D) dorsal görünümünde gösterilen şimdi. şerit eserler bastırılmış ve numune derin yapıların daha iyi çözülmesi olduğunu unutmayın. (E) aynı optik dilim şimdi Multiview Lateral görünümde ve (F) dorsal görünümünden gösterilen veriler deconvolved olarak. Bireysel hücre zarları ve çekirdekleri de ayırt edilebilir, böylece artan kontrast ve çözünürlük unutmayın. çözünürlük numune içinde özellikle derin bozulmaz. veri kümesi yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ile elde edildi. ab z yığınları1.5 mikron adım boyutu ile 100 mikron 20X / 1.0 W amacı ile 10 saat boyunca 10 dakika aralıklarla her bakışta elde edildi dışarı. Multiview füzyon ve Dekonvolüsyonun için giriş görüntüleri aşağı görüntü işleme hızlandırmak için 2 × örneklenmiştir. Multiview Dekonvolüsyonun 15 tekrarlamalar çalıştırmak. (G) montaj optik fincan aşamasına optik vezikül erken göz gelişimi sırasında morfogenetik olayları vurgulamak için deconvolved verilerden dorsal görünümü kırpılmış bir alanı göstermektedir. Başlangıçta içindeki kolon epitel olan optik vezikül iki kat, ayrı hücre popülasyonlarının farklılaşırlar. epidermis yakın uzak tabaka retina neuroepithelium (RN) ve nöral tüp yakın proksimal tabakası retina pigment epiteli (RP) dönüşür. RN uzatılmış ve invagine hücreler optik fincan (5:00 ile 1:40) oluşturmak için; Aynı anda RP hücreleri dümdüz. Yüzey ektoderm, WH bir lens (01:40) oluşturmak için indüklenirich invaginates sonra (05:00). Film 17 hpf başlar. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Tüm hücresel membranlar β-aktin ile etiketli: ras-GFP transgen ve tüm çekirdekler hsp70 tarafından etiketli: H2B-RFP transgen. Ölçek çubuğu 30 mikron temsil eder. FB ön beyin, LE objektif, OP koku plakod, RN retina neuroepithelium, RP retina pigment epiteli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Film 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Optik fincan morfogenezisi tek bir görünümde ve Multiview füzyon iki yöntem ile gösterilen time-lapse film optik fincan aşamasına optik vezikül gelen optik fincan morfolojilerinden tam sürecini göstermektedir.. Lateral görünümde (üst) ve dorsal görüntüsü tek bir optik dilim (alt) tek bir optik dilim gösterir. Gelişmekte olan optik vezikül hücreleri nihayet iç retina neuroepithelium ve dış retina pigment epiteli ile yarım küre optik fincan oluşturmak için karmaşık düzenlenmeleri tabi. Bir lens yüzeyi ektoderm oluşturulmaktadır. Bu neuroepithelium birlikte invaginates ve optik fincan oturur. Tüm hücre zarının β-aktin ekspresyonu ile etiketlenmiştir: ras-GFP (yeşil), transgen ve çekirdekler HSP70 ile etiketlenmiştir: H2B RFP (kırmızı). Film yaklaşık 17 hpf başlar. Veri kümesi 20X / 1.0 W amacı ile her 10 dakikada elde edildi, yaklaşık 20 derece dışında 5 görüşlerinden çift taraflı aydınlatma ve yaklaşık 100 um yığınlarının az satın alındı. Zaman ss gösterilmiştir: mm. Ölçek çubuğu 50 mikron temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development at JoVE.com

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

using-light-sheet-fluorescence-microscopy-to-image-zebrafish-eye

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

33.8K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Video: Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, proliferation, and differentiation. Time-lapse imagining offers unique insight to the behavior of cells during eye development because it allows us to visualize oculogenesis in vivo. Zebrafish are an excellent model to visualize this process due to their highly conserved vertebrate eye and their ability to develop rapidly and externally while remaining optically transparent. Time-lapse imaging studies of zebrafish eye development are greatly facilitated by use of the transgenic zebrafish line Tg(rx3:GFP). In the developing forebrain, rx3:GFP expression marks the cells of the single eye field, and GFP continues to be expressed as the eye field evaginates to form an optic vesicle, which then invaginates to form an optic cup. High resolution time lapse imaging of rx3:GFP expression, therefore, allows us to track the eye primordium through time as it develops into the retina. Lightsheet microscopy is an ideal method to image ocular morphogenesis over time due to its ability to penetrate thicker samples for fluorescent imaging, minimize photobleaching and phototoxicity, and image at a high speed. Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software. The resulting dataset can provide valuable insights into the process of ocular morphogenesis, as well as perturbations to this process as a result of genetic mutation, exposure to pharmacological agents, or other experimental manipulations.

Here, a&#160;protocol is&#160;provided&#160;for time-lapse imaging of ocular morphogenesis using a commercially available lightsheet microscope and an image processing workstation to analyze the resulting data. This protocol details the procedures for embryo anesthesia, embedding in low melting temperature agarose, suspension in the imaging chamber, setting up the imaging parameters, and finally analyzing the imaging data using image analysis software.&#160;

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...

Biyomühendislik

<meta charset="utf8"></head><body>Zebra Balığı Embriyoları için Rafine Multiview Işık Tabakası Mikroskobu Protokolü

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Yüksek Çözünürlüklü Çoklu Görüntülü Işık Tabakası Mikroskobu için Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etme Stratejileri - Görüntüleme ve Görüntü Yeni

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının Sanal Gerçeklik Etkileşimi ile Analizi

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

Yazar Spotlight: Kalp Fonksiyonunun Tek Hücreli Analizi için Zebra Balığında Yüksek Çözünürlüklü 4D Işık Sayfası Görüntüleme ve Sanal Gerçeklik

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

Oküler Morfogenezi Lightsheet Microscopy ile rx3:GFP Transgenik Zebra Balığı Kullanarak Görselleştirme

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme