Boston Çocuk Hastanesi'nden Dr. Caroline Burns'e transgenik zebra balığını cömertçe paylaştığı için minnettarlığımızı ifade ediyoruz. UT Dallas'ta zebra balığı yetiştiriciliğindeki yardımları için Bayan Elizabeth Ibanez'e teşekkür ederiz. UT Dallas'taki D-incubator üyeleri tarafından sağlanan tüm yapıcı yorumları da takdir ediyoruz. Bu çalışma NIH R00HL148493 (YD), R01HL162635 (YD) ve UT Dallas STARS programı (YD) tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışma için onay, Dallas'taki Texas Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından #20-07 protokol numarası altında verilmiştir. Bu çalışmada Tg(myl7:nucGFP) transgenik zebra balığılarvaları 12 kullanıldı. Tüm veri toplama ve görüntü işleme sonrası, açık kaynaklı yazılımlar veya araştırma veya eğitim lisanslarına sahip platformlar kullanılarak gerçekleştirildi. Kaynaklar, makul talep üzerine yazarlardan temin edilebilir.
1. Zebra balığı yetiştiriciliği ve embriyo mikroenjeksiyonu
Süre: 2 gün
<ol><li>Yetişkin zebra balıklarını standart bakım ve yetiştirme prosedürleriyle koruyun ve yetiştirin. Ayrıntılı yöntemler için önceki rapor13'e bakın.</li>
	<li>Belirlenen protokole göre mikroenjeksiyon yapın14. Bu çalışmada mikroenjeksiyon 1-2 hücreli (zigot) evrede uygulandı. NOT: Etkili mikroenjeksiyon için bu aşamanın doğru tanımlanması ve gelişimsel tutarlılığın sağlanması çok önemlidir. Tek hücreli aşamada, yumurta sarısının üzerinde küçük bir kubbe oluşur ve bu aşama tipik olarak yaklaşık 12 dakika sürer. İki hücreli aşamaya ilerledikten sonra, iki bitişik kubbe görünür hale gelir ve bu aşama döllenmeden yaklaşık 45 dakika sonra sürer15. Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerdebulunabilir 12,16,17.</li>
</ol>2. Zebra balığı embriyoları/larvaları hazırlama ve montajı
Süre: 7 gün
<ol><li>Pigment oluşumunu önlemek için döllenmeden 1 gün sonra (dpf) embriyoları 0.2 mM 1-Fenil-2-tiyoüre (PTU) ile E3 suyuna aktarın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Ortamı, LSM görüntülemeye kadar her gün PTU'lu taze E3 suyuyla değiştirin.</li>
	<li>Gelişimlerini 0 ile 7 dpf arasında istenen zaman noktalarında kaydetmek için embriyoları veya larvaları stereo mikroskopla görüntüleyin.</li>
	<li>Zebra balığı larvalarını LSM sistemi12 altına gömmek için 2 mm iç çapa sahip segmentli florlu etilen propilen (FEP) tüpleri hazırlayın. NOT: FEP tüpü, numuneyi su gibi çevredeki ortama çok benzeyen kırılma indisi eşleşen malzemelerle sabitlemek için kullanılır.</li>
	<li>3 dpf'den başlayarak, görüntülemeden önce balıkları hareketsiz hale getirmek için balıkları 150 mg / L trikain (MS-222) çözeltisine aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>150 mg/L trikain ile %0,8 düşük erime noktalı agaroz hazırlayın ve anestezi uygulanmış balığı oda sıcaklığına18 soğuduktan sonra agaroza taşımak için bir transfer pipeti kullanın.</li>
	<li>Balığı agarozlu FEP tüplerine monte etmek için başka bir transfer pipeti kullanın (Şekil 1). NOT: Gelişmekte olan embriyolardaki minimum stresi belirlemek için, kalp atış hızı gibi kardiyak aktivitenin fiksasyon öncesi ve sonrası incelemeleri mikroskobik gözlem altında yapıldı. Bu değerlendirmeler, trikin anestezisi öncesi ve sonrası önemli farklılıkları belirlemeyi amaçladı. Ödem gibi kardiyak yapıdaki düzensizlikler için cilt ve kas sisteminin ek bir muayenesi de fiksasyon sonrası yapılabilir. Trikama konsantrasyonu kardiyak görüntülemede de çok önemli bir rol oynamaktadır19 ve bu nedenle bu projede zebra balığı larvalarında kasılmanın görüntülenmesi için 150 mg/L konsantrasyonlu trikain çözeltisi kullanılmıştır. Mevcut retrospektif senkronizasyon, düzensiz kalp atışlarını20 ele almamıza izin verirken, zebra balıklarında kardiyak aritmilerin 4D görüntülenmesi ve uzun süreli görüntüleme için kapsamlı bir çözüm hala geliştirilme aşamasındadır.</li>
</ol>3. Hafif sayfa görüntüleme sistemi kurulumu ve yapılandırması
Süre: 3-14 gün
<ol><li>Aydınlatma kaynakları olarak 473 nm ve 532 nm gibi belirli dalga boylarında sürekli dalga diyot pompalı katı hal (DPSS) lazer sistemleri kullanarak silindirik bir merceğe dayalı bir şirket içi LSM sistemi oluşturun (Şekil 2A).</li>
	<li>Görüntü dizilerini yakalamak için translasyonel numune aşamasının, ışık tabakası aydınlatmasının ve sCMOS kameranın pozlamasının senkronizasyonu için LabVIEW ( Malzeme Tablosuna bakın) kontrol kodlarını özelleştirin. NOT: Sistem yapısı hakkında daha ayrıntılı bilgi diğer raporlarda veya protokollerdebulunabilir 12,16,17. Araştırma gruplarını, sistem yapımı sırasında optik görüntüleme konusunda yerleşik uzmanlığa sahip laboratuvarlarla işbirliği fırsatları aramaya teşvik ediyoruz.</li>
</ol>4. Zebra balığı görüntüleme hazırlığı ve veri toplama
Süre: 1 gün
<ol><li>Floresan boncuklarını ölçerek LSM sisteminin uzamsal çözünürlüğünü kalibre edin ve değişen derinliklerde opaklık değişimini en aza indirin.<ol><li>İlk olarak, 0,53 μm çapındaki floresan boncukları ( Malzeme Tablosuna bakınız) %0,8 düşük erime noktalı agaroz kullanarak 1: 1,5 x 105 konsantrasyona seyreltin ve çözeltiyi segmentli FEP tüpüne aktarın.</li>
		<li>İkinci olarak, boncukları görüntülemek için LSM sistemini kullanın ve tüm numune boyunca nokta yayılma fonksiyonunu (PSF) ölçün, uzamsal çözünürlüğü ve sistem hizalamasınıdoğrulayın 12. NOT: Bu sistemde, yarı maksimumda (FWHM) tam genişlik için temsili sonuçların analizi, sırasıyla 1,26 ± 0,15 ve 2,48 ± 0,15 μm (n = 60 boncuk) yanal ve eksenel çözünürlükleri gösterir. Bu, görüntüleme derinliği boyunca tutarlı bir uzamsal çözünürlük önerir.</li>
	</ol></li>
	<li>Monte edilmiş zebra balığı larvalı FEP tüpünü 6 eksenli (x, y, z, eğim, sapma ve yuvarlanma) motorlu numune tablasına güvenli bir şekilde takın ve tüpleri E3 suyla dolu numune haznesine daldırın. Yumurta sarısı kesesinin ışık saçmasını önlemek ve kalbin konumunu daha iyi bulmak için, zebra balığı larvalarını döndürerek ventral taraftan görüntü alın (Şekil 2B). Bu durumda, yakalanan görüntülerin çoğu hem ventrikülü hem de atriyumu içerecektir (Şekil 2C). NOT: Mevcut görüntüleme prosedürlerinin tipik olarak balık başına bir saatten az sürdüğü ve kontrollü bir oda sıcaklığı ortamında gerçekleştirildiği göz önüne alındığında, oda sıcaklığı kontrolü ve oksijen seviyesi düzenlemesi bu proje için isteğe bağlı olarak kabul edilir. Bununla birlikte, özellikle gelişimsel süreçlere odaklanan daha uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme çalışmaları için, zebra balığının fizyolojik ortamını sağlamak ve olası gelişimsel anormallikleri önlemek için numune odası içinde 27 ° C'de sürekli sıcaklık izleme ve düzenleme önerilmektedir.</li>
	<li>Motorlu numune tablasını iş istasyonuna bağlayın ve istenen hareket modu da dahil olmak üzere gerekli tüm parametreleri yapılandırın.</li>
	<li>sCMOS kamera ile iş istasyonu arasında bir bağlantı kurun. 5 ms'lik pozlama süresi ve istenen ilgi alanı gibi tüm temel ayarları yapın.</li>
	<li>Özelleştirilmiş LabVIEW kontrol programı içindeki görüntü dizilerinin ve karelerin sayısını yapılandırın.</li>
	<li>Lazeri açın ve numunenin LSM görüntülemesini başlatın. Tüm görüntü dizileri başarıyla kaydedilene kadar işlemi sürdürün.</li>
	<li>Larvaların 3-5 kardiyak döngüsünü 200 kare/saniye kare hızıyla kapsayacak şekilde 2D görüntü dizisi olarak 300 kare kaydedin. Kayıt, ışık tabakası tarafından aydınlatılan seçici düzlemde kardiyak kasılmayı yakalar.</li>
	<li>Numuneyi sanal olarak dilimlemek için larvayı ışık tabakası aydınlatması boyunca 1 μm'lik adım boyutunda hareket ettirin. NOT: Numune aşamasının adım boyutu, Nyquist-Shannon örnekleme teoremi12 izlenerek hafif tabaka sisteminin eksenel çözünürlüğüne göre ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Tüm kalp kaplanana kadar yeni örnek dilimin başka bir görüntü dizisini kaydetmek için 7. adımı tekrarlayın. Genel olarak, 1 μm adım boyutuna sahip 100-200 görüntü dizisi, bir zebra balığı larvasının tüm kalbinin kapsanmasını sağlar (Şekil 2D). NOT: Adım 4.7-4.9, LabVIEW programı tarafından kontrol edilir ve LSM sistemi tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir (Şekil 3). Üretilen görüntü verilerinin büyük hacmi göz önüne alındığında, görüntü dizileri için standartlaştırılmış bir adlandırma kuralı önerilir. Örneğin, çeşitli görüntü dizileri arasında verileri kategorilere ayırmak için "z-1", "z-2" vb. adlara sahip klasörler atayın. Her dizide, görüntüler farklı zaman noktalarını belirtmek için sırayla adlandırılmalıdır (örneğin, "1", "2", ...). Bir zebra balığı larvası için balıkların montajı, görüntüleme açısının ayarlanması ve tüm verilerin toplanması için toplam süre yaklaşık 1 saattir.</li>
</ol>5. Paralel hesaplama ile 4D görüntü rekonstrüksiyonu
Süre: 1 gün NOT: Grubumuz tarafından geliştirilen 4D rekonstrüksiyon algoritması ve örnek veriler kamuya açıktır21. Bu yöntem, önceki adımlarda toplanan görüntü dizilerinden 4D kalp görüntüsünün yeniden oluşturulmasına olanak tanır (Tablo 1).
<ol><li>test_Parallel.m dosyasını MATLAB'da açın (Malzeme Tablosu'na bakın). Ham görüntü dizilerinin saklandığı klasör konumunu "baseDir" değişkeninde belirtin.</li>
	<li>"numOfSlice" değişkenini toplam görüntü dizisi sayısıyla (genellikle 100-150) ve "numOfImage" değişkenini her dizideki görüntü sayısıyla (genellikle 300-500) atayın.</li>
	<li>Zebra balığı kalbinin orta düzlemini gösteren görüntü dizisini inceleyin (örneğin, toplam 101 diziden 51. dizi). Bu dizideki birinci ve dördüncü sistollerin çerçeve numaralarını belirleyin ve bunları systolicPoint_1st ve systolicPoint_4th değişkenlerine atayın.</li>
	<li>İşlemi başlatmak için Çalıştır'a tıklayın. NOT: Her bir görüntü dizisindeki kardiyak siklusun uzunluğu, ilk olarak MATLAB programı tarafından farklı zaman noktalarındaki görüntüler arasındaki benzerliğin (kare farkların toplamı) karşılaştırılmasıyla tanımlanacaktır. Daha sonra, kardiyak döngü, tüm görüntü dizilerinden döngü uzunluklarının ortalaması kullanılarak tahmin edilecektir. Daha sonra, farklı eksenel konumlardaki görüntü dizilerinin başlangıç noktaları, ilk görüntü dizisinden son görüntü dizisine görüntü benzerliğinin yinelemeli bir karşılaştırması yoluyla program tarafından hizalanacaktır.</li>
	<li>Çıktı klasöründeki sonuçları kontrol edin. Program, görüntüleri zaman damgalı ".tif" dosyaları olarak kaydedecektir. Her ".tif" dosyası, belirli bir zaman noktasında bir 3D kalp görüntüsüdür. İki 3D görüntü arasındaki zaman aralığı, ayarlanan pozlama süresine eşittir. NOT: 4D (3D uzamsal + 1D zamansal) kardiyak kasılmaları tasvir etmek için önceki adımlardan elde edilen görüntüleri yeniden oluşturun. Geriye dönük eşitleme sırasında yüksek verimli araştırmalarda yeterliliği artırmak için bu yaklaşım, MATLAB paralel bilgi işlem araç kutusu aracılığıyla birden çok CPU çekirdeğinden yararlanarak ve görüntüleri gpuArray biçimine dönüştürerek bir GPU üzerinde eşzamanlı hesaplama işlemlerine olanak tanır.</li>
</ol>6. 3D hücre segmentasyonu ve hücre takibi
Süre: 1 gün
<ol><li>3DeeCellTracker paketini indirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve Python ortamını kurun22.</li>
	<li>ITK-SNAP açıklama yazılımını23 indirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve eğitim ve doğrulama veri kümelerini oluşturmak için 3D kalp görüntüsünü biri ventriküler diyastolde ve diğeri ventriküler sistolde olmak üzere seçilen iki zaman noktasında manuel olarak etiketlemek için kullanın. NOT: Diğer etiketleme yazılımları da geçerli olabilir.</li>
	<li>Python'da, 3DeeCellTracker eğitim programını çalıştırın ve önceden tanımlanmış 3D U-Net modelini ayarlamak için TrainingUNet3D işlevinde noise_level(bu durumda 100), folder_path ve model parametrelerini başlatın.</li>
	<li>MATLAB'da, eğitim ve doğrulama veri kümesini yükleme için uygun biçime dönüştürmek ve yeniden adlandırmak için imageDimConverter.m programını kullanın.</li>
	<li>Python'da trainer.load_dataset() ve trainer.draw_dataset() işlevlerini kullanarak eğitim ve doğrulama veri kümelerini yükleyin.</li>
	<li>Python'da, 3DeeCellTracker izleme programının ilk bölümünü çalıştırın ve parametreleri başlatın. NOT: Bu, görüntü boyutlarını karakterize etmek için görüntü parametrelerini, hücre segmentasyonu için uygulanan makine öğrenimi modelini seçmek için segmentasyon parametrelerini ve hücre kaydı için kullanılan önceden eğitilmiş derin sinir ağı modellerini seçmek için izleme parametrelerini tanımlamayı içerir. İlk kullanımda, hücre segmentasyonu için U-Net modelinin ve hücre kaydı için FFN+ PR-GLS'nin kullanılması önerilir. Verilerin, modellerin ve sonuçların bu adımda otomatik olarak oluşturulacak klasörlerde saklanması gerekir.</li>
	<li>MATLAB'da, tüm 3B kalp görüntülerini uygun formata dönüştürmek ve yeniden adlandırmak ve bunları son adımda oluşturulan veri klasörüne aktarmak için imageDimConverter.m programını kullanın.</li>
	<li>Python'da, segmentasyonu başlatmak için 3DeeCellTracker programının ikinci bölümünü çalıştırın.</li>
	<li>İlk 3D görüntü bölümlere ayrıldıktan sonra, segmentasyon sonucunu ham görüntüyle karşılaştırın ve herhangi bir yanlış segmentasyon bulunursa manuel düzeltme yapın. Düzeltilmiş segmentasyonu oluşturulan "/manual_vol1" klasörüne taşıyın.</li>
	<li>Python'da, tüm görüntüleri bölümlere ayırmak için 3DeeCellTracker programının üçüncü bölümünü çalıştırın.</li>
	<li>İzlenen hücrelerin konumlarını karşılık gelen ham görüntülerle karşılaştırarak izleme sonuçlarının görsel bir değerlendirmesini yapmak için Amira'yı kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Test sonuçları tatmin edici değilse, yordamı adım 6.6'dan yeniden başlatın, segmentasyon veya hücre kaydı için alternatif bir makine öğrenimi modeli kullanın ve ardından izleme işlemini yeniden başlatın. NOT: Segmentasyondan sonra, hücre etiketlerinin verileri varsayılan olarak 8 bitlik bir görüntü (0 - 255) olarak depolanır, bu da hücre sınıflandırması için etiket olarak yalnızca 256 ölçek sağlandığı anlamına gelir. Ek sınıflara ihtiyaç duyulduğunda bu sorunu çözmek için iki çözüm vardır. Çözümlerden biri, hücre etiketlerinin veri formatını izleme programında 16 bitlik bir görüntü olarak ayarlamaktır, bu da mevcut durumda işlem süresinde iki günden fazla üstel bir artışa neden olacaktır. Diğer çözüm, aynı etiketlere sahip hücreleri fiziksel konumlarına göre ayıracak ve her hücreye farklı bir etiket atayacak olan hücre etiketlerini sonradan işlemek için "separateTrackingResults.py" programını kullanmaktır. Bu durumda bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer.</li>
</ol>7. Sanal gerçeklik modunda kardiyak kasılma analizi
Süre: 1 gün
<ol><li>Önceki adımlardan hücre izleme sonucunu alın.</li>
	<li>Verileri manuel olarak doğrulayın ve tüm birimlerde tutarlı görüntü yoğunluğuna sahip hücreleri seçin (yaklaşık 600 hücreden yaklaşık 500'ü).</li>
	<li>3B Dilimleyici yazılımı 24 aracılığıyla her bir hücre için bir yüzey ağı oluşturmak ve her hücreye benzersiz bir renk kodu atamak için cellLabelsToObj.ipynb komut dosyası21'i kullanın. </li>
	<li>Tek bir zaman noktasındaki tüm hücrelerden oluşan her 3B modeli, hücre etiketini açıklamak için bir .mtl dosyasıyla birlikte birden çok alt nesneden oluşan tek bir .obj dosyası olarak dışa aktarın.</li>
	<li>Genişletilmiş gerçeklik için kullanılan bir geliştirme altyapısı olan eğitim lisansını kullanarak modelleri Unity'ye aktarın.</li>
	<li>4B görselleştirme ve etkileşimli analize izin vermek için C# ile yazılmış işlevlerden oluşan özelleştirilmiş komut dosyalarını modellere ve kullanıcı arabirimi öğelerine uygulayın. Adım 7.7'yi izleyerek VR etkileşimi gerçekleştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki işlevleri kullanarak sanal gerçeklikteki (VR) modellerle etkileşim kurun (Şekil 4):<ol><li>Hücre seçimi: Bir seferde en fazla iki hücre seçin ve yörüngelerini, hızlarını, hacimlerini, yüzey alanlarını ve göreli mesafelerini görüntüleyin.</li>
		<li>Zaman noktası seçimi: Seçilen hücrelerin çıktılarını analiz etmek için verilerde belirli bir zaman noktası seçin, örneğin diyastol sırasında t = 0 ms veya sistol sırasında t = 200 ms.</li>
		<li>Zaman duraklatma: Seçili hücrelere ve çıktılarına odaklanmak için dinamik modeli dondurun.</li>
		<li>Kontrast: Modeldeki seçili hücreler ve çevresindeki hücreler arasındaki kontrastı modüle edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının Sanal Gerçeklik Etkileşimi ile Analizi

<ol>
	<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Liu, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+in+the+study+of+early+cardiac+development.">Zebrafish in the study of early cardiac development.</a> Circ. Res. 110 (6), 870 (2012).</li><li>Ding, Y., Bu, H., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+inherited+cardiomyopathies+in+adult+zebrafish+for+precision+medicine.">Modeling inherited cardiomyopathies in adult zebrafish for precision medicine.</a> Front. Physiol. 11, 599244 (2020).</li><li>Giardoglou, P., Beis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+zebrafish+disease+models+and+matters+of+the+heart.">On zebrafish disease models and matters of the heart.</a> Biomedicines. 7 (1), 15 (2019).</li><li>Zhang, X., Alexander, R. V., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+cardiac+contractile+function.">Computational analysis of cardiac contractile function.</a> Curr. Cardiol. Rep. 24 (12), 1983-1994 (2022).</li><li>Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cardiac+development+and+function+in+zebrafish+using+light+sheet+microscopy.">In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy.</a> Swiss Med. Wkly. 145 (51), w14227 (2015).</li><li>Vedula, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+quantify+mechanobiologic+forces+during+zebrafish+cardiac+development+using+4-D+light+sheet+imaging+and+computational+modeling.">A method to quantify mechanobiologic forces during zebrafish cardiac development using 4-D light sheet imaging and computational modeling.</a> PLOS Comput. Biol. 13 (10), e1005828 (2017).</li><li>Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+function+and+hemodynamic+analysis+for+zebrafish+embryos.">Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos.</a> Dev. Dyn. 246 (11), 868-880 (2017).</li><li>Baek, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscopy+to+elucidate+cardiovascular+injury+and+regeneration:+4D+light-sheet+imaging.">Advanced microscopy to elucidate cardiovascular injury and regeneration: 4D light-sheet imaging.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 138, 105-115 (2018).</li><li>Salman, H. E., Yalcin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+blood+flow+assessment+in+Zebrafish+via+experimental+digital+particle+image+velocimetry+and+computational+fluid+dynamics+modeling.">Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling.</a> Micron. 130, 102801 (2020).</li><li>Sodimu, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+the+cardiac+structure+in+neonatal+mice.">Light sheet imaging and interactive analysis of the cardiac structure in neonatal mice.</a> J. Biophotonics. 16 (5), e202200278 (2023).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+zebrafish+larvae.">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in zebrafish larvae.</a> APL Bioeng. 7 (2), 026112 (2023).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book.">The Zebrafish Book.</a> Eugene. , (2000).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. 25, e1115 (2009).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light-sheet+microscopy+revolution.">The light-sheet microscopy revolution.</a> J. Opt. 20 (5), 053002 (2018).</li><li>Gualda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OpenSpinMicroscopy:+an+open-source+integrated+microscopy+platform.">OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform.</a> Nat. Methods. 10 (7), 599-600 (2013).</li><li>Messerschmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sheet+fluorescence+microscopy+to+capture+4-dimensional+images+of+the+effects+of+modulating+shear+stress+on+the+developing+zebrafish+heart.">Light-sheet fluorescence microscopy to capture 4-dimensional images of the effects of modulating shear stress on the developing zebrafish heart.</a> J Vis Exp. 138, e57763 (2018).</li><li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope.">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J Clin Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+light-sheet+imaging+and+interactive+analysis+of+cardiac+contractility+in+Zebrafish+larvae.">4D light-sheet imaging and interactive analysis of cardiac contractility in Zebrafish larvae.</a> Zenodo. , (2023).</li><li>Wen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3deecelltracker,+a+deep+learning-based+pipeline+for+segmenting+and+tracking+cells+in+3d+time+lapse+images.">3deecelltracker, a deep learning-based pipeline for segmenting and tracking cells in 3d time lapse images.</a> Elife. 10, e59187 (2021).</li><li>Yushkevich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=User-guided+3D+active+contour+segmentation+of+anatomical+structures:+significantly+improved+efficiency+and+reliability.">User-guided 3D active contour segmentation of anatomical structures: significantly improved efficiency and reliability.</a> Neuroimage. 31 (3), 1116-1128 (2006).</li><li>Fedorov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Slicer+as+an+image+computing+platform+for+the+quantitative+imaging+network.">3D Slicer as an image computing platform for the quantitative imaging network.</a> Magn. Reson. Imaging. 30 (9), 1323-1341 (2012).</li><li>Naderi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+learning-based+framework+for+cardiac+function+assessment+in+embryonic+zebrafish+from+heart+beating+videos.">Deep learning-based framework for cardiac function assessment in embryonic zebrafish from heart beating videos.</a> Comput. Biol. Med. 135, 104565 (2021).</li><li>Mickoleit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+reconstruction+of+the+beating+zebrafish+heart.">High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart.</a> Nat. Methods. 11 (9), 919-922 (2014).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation.">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> J. Clin. Invest. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiscale+light-sheet+for+rapid+imaging+of+cardiopulmonary+system.">Multiscale light-sheet for rapid imaging of cardiopulmonary system.</a> JCI Insight. 3 (16), e121396 (2018).</li><li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research.">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab. Anim. Res. 37 (1), 1-29 (2021).</li><li>Coelho-Filho, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+cardiomyocyte+hypertrophy+by+cardiac+magnetic+resonance:+implications+on+early+cardiac+remodeling.">Quantification of cardiomyocyte hypertrophy by cardiac magnetic resonance: implications on early cardiac remodeling.</a> Circulation. 128 (11), 1225 (2013).</li><li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+segmentation+and+cardiac+mechanics+analysis+of+evolving+zebrafish+using+deep+learning.">Automatic segmentation and cardiac mechanics analysis of evolving zebrafish using deep learning.</a> Front. Cardiovasc. Med. 8, 675291 (2021).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics.">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), e97180 (2017).</li><li>Koger, C. R., Hassan, S. S., Yuan, J., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+reality+for+interactive+medical+analysis.">Virtual reality for interactive medical analysis.</a> Front. Virtual Real. 3, 782854 (2022).</li><li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+reality+for+biomedicine.">Extended reality for biomedicine.</a> Nat. Rev. Methods Prim. 3 (1), 1-1 (2023).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Zebra balığı modelinin mühendislik yöntemleriyle entegrasyonu, miyokard enfarktüsü, aritmiler ve konjenital kalp kusurlarının in vivo araştırılması için büyük bir potansiyele sahiptir. Optik şeffaflığından, rejeneratif kapasitesinden ve insanlarla genetik ve fizyolojik benzerliklerinden yararlanarak, zebra balığı embriyoları ve larvaları araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır 1,2,4<sup class="xr...

Zebra balığı (Danio rerio), optik şeffaflığı, genetik izlenebilirliği ve rejeneratif kapasitesi 1,2,3,4 nedeniyle kardiyak gelişim, fizyoloji ve onarımı incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model organizmadır. Miyokard infarktüsü sonrası, yapısal ve fonksiyonel değişiklikler kardiyak ejeksiyonu ve hemodinamiği etkilerken, teknik kısıtlılıklar yüksek uzay-zamansal rezolüsyon ile kardiyak rejenerasyon sırasındaki dinamik sürecin araştırılmasını engellemeye devam etmektedir. Örneğin, konfokal mikroskopi gibi geleneksel görüntüleme yöntemlerinin, dinamik değişiklikleri yakalamak ve çoklu kardiyak sikluslar sırasında kardiyak kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için görüntüleme derinliği, zamansal çözünürlük veya fototoksisite açısından sınırlamaları vardır5.
Işık tabakası mikroskobu, lazeri kalbin ventrikülü ve atriyumu boyunca hızlı bir şekilde süpürerek, gelişmiş uzay-zamansal çözünürlük ve ihmal edilebilir foto-ağartma ve foto-toksik etkilere sahip ayrıntılı görüntüler elde ederek bu sorunları başarıyla ele alan son teknoloji bir görüntüleme yöntemini temsil eder 6,7,8,9,10,11.
Bu protokol, çoklu kardiyak döngüler sırasında tüm kalp boyunca kardiyomiyositlerin dinamiklerini yakalamak ve analiz etmek için LSM sistem yapımı, 4D görüntü rekonstrüksiyonu, 3D hücre takibi ve etkileşimli analizi içeren kapsamlı bir görüntüleme stratejisi sunar12. Özelleştirilmiş görüntüleme sistemi ve hesaplama metodolojisi, transgenik Tg (myl7: nucGFP) zebra balığı larvalarında miyokardiyal mikro yapının ve kasılma fonksiyonunun tek hücre düzeyinde izlenmesine izin verir. Ayrıca, ilaca bağlı kardiyak hasarı ve müteakip rejenerasyonu değerlendirmek için mikroenjeksiyon kullanılarak embriyolara küçük moleküllü bileşikler verildi. Bu bütünsel strateji, kardiyak gelişim ve rejenerasyon sırasında miyokardın yapısal, fonksiyonel ve mekanik özelliklerini tek hücre düzeyinde in vivo olarak araştırmak için bir giriş noktası sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RESOURCE</td>
			<td>SOURCE/Reference</td>
			<td>IDENTIFIER</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal models</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish</td>
			<td>Burns Lab in Boston Children&#39;s Hospital</td>
			<td>ZDB-TGCONSTRCT-070117-49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>The MathWorks Inc.</td>
			<td>R2023a</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>2017 SP1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCImage Live</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>4.6.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>The Python Software Foundation</td>
			<td>3.9.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji-ImageJ</td>
			<td>Schneider et al.18</td>
			<td>1.54f</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3DeeCellTracker</td>
			<td>Chentao Wen et al.15</td>
			<td>v0.5.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unity</td>
			<td>Unity Software Inc.</td>
			<td>2020.3.2f1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2021.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Slicer</td>
			<td>Andriy Fedorov et al.17</td>
			<td>5.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITK SNAP</td>
			<td>Paul A Yushkevich et al.16</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet system</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACY254-050-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4X Illumination objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MRH00045</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Detection objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>1-U2M585</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C13440-20CU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized XYZ stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PT3/M-Z8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-axis tilt stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotation stepper motor</td>
			<td>Pololu</td>
			<td>1474</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>FP-0556-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473nm DPSS Laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>R471003GX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>532nm DPSS laser</td>
			<td>Laserglow</td>
			<td>R531003FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector and vacuum pump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjector</td>
			<td>WPI</td>
			<td>PV850</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2522B-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Pulled Glass Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>TIP10LT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tip for gel loading</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>2239912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virtual reality hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VR headset</td>
			<td>Meta</td>
			<td>Quest 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30mg/L PTU solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X E3 working solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Agarose</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>16520050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10g/L Tricaine stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>SYNC-M-GR-US02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mg/L Tricaine working solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10g/L Tricaine stock solution</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X E3 stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>-</td>
			<td>KCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>-</td>
			<td>CaCL2 x 2H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>-</td>
			<td>MgSO4 x 7H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X E3 working solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X E3 stock solution</td>
			<td>Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO Water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Methylene Blue (optional)&#160;</td>
			<td>-</td>
			<td>C16H18ClN3S</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d light-sheet imaging of zebrafish cardiac contraction

Zebra balığı, olağanüstü kardiyak rejenerasyon kapasitesi ile bilinen ilgi çekici bir model organizmadır. Kasılan kalbi in vivo olarak incelemek, yaralanmalara yanıt olarak yapısal ve fonksiyonel değişiklikler hakkında bilgi edinmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, kardiyak mimariyi ve kontraktiliteyi değerlendirmek için zebra balığı kalbinin yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı 4 boyutlu (4D, 3D uzamsal + 1D zamansal) görüntülerini elde etmek zor olmaya devam etmektedir. Bu bağlamda, bu teknik sınırlamaların üstesinden gelmek için kurum içi bir ışık tabakası mikroskobu (LSM) ve özelleştirilmiş hesaplamalı analiz kullanılmaktadır. LSM sistem yapısı, retrospektif senkronizasyon, tek hücre takibi ve kullanıcı yönelimli analizi içeren bu strateji, transgenik Tg(myl7:nucGFP) zebra balığı larvalarında tek hücreli çözünürlükte tüm kalp boyunca mikro yapı ve kasılma fonksiyonunun araştırılmasını sağlar. Ek olarak, hassas ve kontrollü bir şekilde kalp hasarını indüklemek için küçük moleküllü bileşiklerin mikroenjeksiyonunu daha da dahil edebiliyoruz. Genel olarak, bu çerçeve, kardiyak morfogenez ve rejenerasyon sırasında fizyolojik ve patofizyolojik değişikliklerin yanı sıra tek hücre düzeyinde bölgesel mekaniğin izlenmesine izin verir.

The zebrafish (Danio rerio) is a widely used model organism for studying cardiac development, physiology, and repair due to its optical transparency, genetic tractability, and regenerative capacity1,2,3,4. Upon myocardial infarction, while structural and functional changes impact the cardiac ejection and hemodynamics, technical limitations continue to hinder the ability to investigate the dynamic process during cardiac regeneration with the high spatiotemporal resolution. For example, conventional imaging methods, such as confocal microscopy, have limitations in terms of imaging depth, temporal resolution, or phototoxicity for capturing the dynamic changes and assessing cardiac contractile function during multiple cardiac cycles5.
Light-sheet microscopy represents a state-of-the-art imaging method that successfully addresses these issues by quickly sweeping the laser across the heart&#39;s ventricle and atrium, achieving detailed images with enhanced spatiotemporal resolution and negligible photo-bleaching and photo-toxic effects6,7,8,9,10,11.
This protocol introduces a comprehensive imaging strategy that includes LSM system construction, 4D image reconstruction, 3D cell tracking, and interactive analysis to capture and analyze the dynamics of cardiomyocytes across the entire heart during multiple cardiac cycles12. The customized imaging system and computational methodology allow&#160;one to track the myocardial microstructure and contractile function at the single-cell level in transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Furthermore, small molecule compounds were delivered into the embryos using microinjection to assess drug-induced cardiac injury and subsequent regeneration. This holistic strategy provides an entry point to in vivo investigate structural, functional, and mechanical properties of myocardium at the single-cell level during cardiac development and regeneration.

Yazar Spotlight: Kalp Fonksiyonunun Tek Hücreli Analizi için Zebra Balığında Yüksek Çözünürlüklü 4D Işık Sayfası Görüntüleme ve Sanal Gerçeklik

Zebra Balığı Kardiyak Kasılmasının 4D Işık Sayfası Görüntüleme

Our research uses 4D light-sheet imaging to explore cardiac contractile function in zebrafish, aiming to understand the dynamics of cardiac contraction at the single-cell level. One of the foremost experimental challenges is achieving high spatial terminal resolution, dynamic imaging of cardiac function while observing natural heart rhythms. Our study fills the gap in analyzing intricate 4D cardiac dynamic at single-cell resolution.We utilize GPU-based parallel computation, virtual reality, and advance cell tracking to interpret light-sheet imaging data. Our novel virtual reality platform offers an interactive approach to assess regional cardiac contractions, providing manipulative functionalities for more in-depth analysis. By facilitating user-directed analysis of cardiac contraction, our protocol could lead to an enhanced understanding of cardiac development and disease.

Mevcut protokol üç ana adımdan oluşmaktadır: zebra balığı hazırlama ve mikroenjeksiyon, ışık tabakası görüntüleme ve 4D görüntü rekonstrüksiyonu ve hücre izleme ve VR etkileşimi. Yetişkin zebra balıklarının çiftleşmesine izin verildi, döllenmiş yumurtalar toplandı ve önerilen deneyler için gerektiğinde mikroenjeksiyon yapıldı (Şekil 1). Bu adım, kardiyak gelişim ve rejenerasyonun araştırılmasında zebra balığı uygulamalarını keşfetmek için bir...

Watch this Scientific Journal Video about 4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction at JoVE.com

Bu protokol, zebra balığı larvalarında kardiyak kasılma fonksiyonunu araştırmak ve hücre izleme ve etkileşimli analiz yoluyla kalp mekaniği hakkında bilgi edinmek için ışık tabakası görüntülemeyi kullanır.

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for ...

Araştırmamız, zebra balıklarında kardiyak kasılma fonksiyonunu keşfetmek için 4D ışık tabakası görüntüleme kullanıyor ve tek hücre düzeyinde kardiyak kasılma dinamiklerini anlamayı amaçlıyor. En önde gelen deneysel zorluklardan biri, doğal kalp ritimlerini gözlemlerken yüksek uzamsal terminal çözünürlüğü, kardiyak fonksiyonun dinamik görüntülemesini sağlamaktır. Çalışmamız, tek hücreli çözünürlükte karmaşık 4D kardiyak dinamiği analiz etmedeki boşluğu dolduruyor.Hafif sayfa görüntüleme verilerini yorumlamak için GPU tabanlı paralel hesaplama, sanal gerçeklik ve gelişmiş hücre takibinden yararlanıyoruz. Yeni sanal gerçeklik platformumuz, bölgesel kardiyak kasılmaları değerlendirmek için etkileşimli bir yaklaşım sunarak daha derinlemesine analiz için manipülatif işlevler sağlar. Kardiyak kasılmanın kullanıcı tarafından yönlendirilen analizini kolaylaştırarak, protokolümüz kardiyak gelişim ve hastalığın daha iyi anlaşılmasına yol açabilir.

4d-light-sheet-imaging-of-zebrafish-cardiac-contraction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4D Light-sheet Imaging of Zebrafish Cardiac Contraction

865 Görüntüleme.  The University of Texas at Dallas. Araştırmamız, zebra balıklarında kardiyak kasılma fonksiyonunu keşfetmek için 4D ışık tabakası görüntüleme kullanıyor ve tek hücre düzeyinde kardiyak kasılma dinamiklerini anlamayı amaçlıyor. En önde gelen deneysel zorluklardan biri, doğal kalp ritimlerini gözlemlerken yüksek uzamsal terminal çözünürlüğü, kardiyak fonksiyonun dinamik görüntülemesini sağlamaktır. Çalışmamız, tek hücreli çözünürlükte karmaşık 4D kardiyak dinamiği analiz etmedek...

Video: Yazar Spotlight: Kalp Fonksiyonunun Tek Hücreli Analizi için Zebra Balığında Yüksek Çözünürlüklü 4D Işık Sayfası Görüntüleme ve Sanal Gerçeklik

Zebrafish is an intriguing model organism known for its remarkable cardiac regeneration capacity. Studying the contracting heart in vivo is essential for gaining insights into structural and functional changes in response to injuries. However, obtaining high-resolution and high-speed 4-dimensional (4D, 3D spatial + 1D temporal) images of the zebrafish heart to assess cardiac architecture and contractility remains challenging. In this context, an in-house light-sheet microscope (LSM) and customized computational analysis are&#160;used to overcome these technical limitations. This strategy, involving LSM system construction, retrospective synchronization, single cell tracking, and user-directed analysis, enables one to investigate the micro-structure and contractile function across the entire heart at the single-cell resolution in the transgenic Tg(myl7:nucGFP) zebrafish larvae. Additionally, we are able to further incorporate microinjection of small molecule compounds to induce cardiac injury in a precise and controlled manner. Overall, this framework allows one to track physiological and pathophysiological changes, as well as the regional mechanics at the single-cell level during cardiac morphogenesis and regeneration.

This protocol utilizes light-sheet imaging to investigate cardiac contractile function in zebrafish larvae and gain insights into cardiac mechanics through cell tracking and interactive analysis.