The authors would like to acknowledge the "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comit&#233; du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Rapha&#235;lle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.

<ol>
	<li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, &. #. 2. 1. 6. ;., Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+past,+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li><li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+characteristics+of+free+C1498+(granulocytic+leukemia)+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice.">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li><li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+(C57BL)+and+resistant+(B10.D2)+mice.">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li><li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice.">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li><li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498.">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li><li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8++T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia.">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li><li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia.">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li><li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents.">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), 375-390 (1966).</li><li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside.">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li><li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Flow Cytometry Methods. , (1993).</li><li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation.">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li><li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features.">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li><li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+normal+murine+hematopoiesis+by+leukemic+cells.">Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells.</a> N.Engl.J. Med. 299 (2), 71-75 (1978).</li><li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice.">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li><li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals.">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li><li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C(high)+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions.">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Daha önce yapılan çalışmalarda, C1498 hücre çizgisi, akut granülositik 5, 6 ya da miyelomonositik NKT 7 hücre lösemi bir teşvik edici olarak tanımlanmıştır. Ancak literatürde demonstrasyon veri yok veya eksik ya idi. Burada sunulan protokol gibi flow sitometri, immünofloresans, MGG boyama ve sitokimyasal tahlilleri gibi farklı teknikler, kültürlü C1498 hücreleri karakterize etmek ve onlar enjekte edildikten sonra farelerde olduğu lösemi doğasını belirlemek için kullanır. Bu immün sonra in vitro kültür C1498 hücrelerinde fenotiplenir ve sitometrisi analizi yapıldı akışındaki Bu hücreler daha önce literatürde 6,7 tarif edilmiştir birkaç hücre yüzeyi hematopoietik belirteçleri olmasından ötürü, bazı sınırlamalar görülmektedir. Bizim sonuçları ile uyum içinde, Labelle ve ark. Akış cytomet kullanarak C1498 hücreleri üzerinde olgun TCR hücre yüzey ekspresyonunu dikkat etmediry boyama. Onlar CD3ε ve TCRVβ8.2 mRNA 7 algılandı sonra ancak, bir NKT hücre hattı olmalarını kabul. Ayrıca hücreler (&gt;% 70) çoğu TCRVβ zincirleri ve CD3ε moleküllerin hücre içi ekspresyonunu görülmektedir, ancak Mac-3 molekülünün birlikte hücre içi ekspresyonu, aynı zamanda orada dolayı hematopoietik soyların belirlenemedi. Myeloperoksidaz, MGG boyama ve sitokimya kullanılarak fonksiyonel esterazları analiz değerlendirmeler C1498 hücre hattının bir miyeloid kökeni vardı ve monoblastlardan ve miyeloblast oluştuğunu göstermiştir. Bu sonuçlar boyama flow sitometri analizi elde edilmiştir, Mac-3 + hücrelerinin yüzdesi ile uyumlu idi. Bu adımlar önemli deneyler temsil nicel olmamasına rağmen yapılacak. Aslında, hiç ya da F ifade eden hematopoietik hücrelerin soyu ile farklılaşma aşamasında karakterize etmek için en iyi, mevcut yöntem, şimdiye kadar, devamew spesifik fenotipik belirteçler. boyanma Flow sitometri C1498 hücreleri damardan enjekte edildikten sonra congenic farelerde akut lösemi gelişimini göstermek için yardımcı oldu. Periferik kan ve çeşitli organlarda sızmış CD45.2 + C1498 hücreleri izole edildi ve bunların frekansları belirlenmiştir. Niceleme da immünofenotiplendirme sonra doğal medüller ve dalak hücreleri analiz etmek için yapılmıştır. Onlar birkaç hematopoetik belirteçler ifade edilen C1498 hücre fenotipi organlarda incelendiğinde zaman Sınırlamalar rastlanmıştır (bunlardan sadece bir kaç B220 + idi). gözlenen akut lösemi doğasını, Mayıs-Grünwald Giemsa boyama ve monositik faaliyetlerinin analizini tanımlamak ve granülositik esterazlar kemik iliği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar C1498 hücreleri miyelomonositik lösemi başlangıcı açığa onların miyeloblastik ve monoblastik morfolojisi ve fonksiyonu korunmuş olduğunu göstermiştir. <p claspH hatalar sonuçların yanlış yorumlamalar yol açabilir, çünkü sitokimyasal reaksiyonlar ve MGG boyama yaparken bu protokolü açıklanan kritik adımlar için göz önüne alındığında s = &quot;jove_content&quot;&gt;, özel dikkat pH verilmelidir. granülosit ve lenfositler, yüksek pH değerlerinde, bu test için pozitif leke çünkü Örneğin, α-naftil butirat esteraz etkinliği sadece 6.0 pH&#39;da monositik hücreler için geçerlidir. Hücreleri oturtulması MGG boyama yapmadan önce tavsiye ve biz C1498 hücreleri kullanarak esteraz sitokimyasal reaksiyonları yaparken sadece CAF tespit tatminkar sonuçlar sağladığı gösterdi değildir. Sitometrisi numuneleri (örneğin, kan, kemik iliği, dalak hücreleri) her prosedür sırasında buz üzerinde tutulmalıdır CD115 molekülünün ekspresyonunu ve akış tarafından algılama korumak için. Hiçbir boyama flow sitometri ve / veya immünofloresan deneyleri, antikorların referans kendi depolama yeniden gözlenmesi durumundacommendations ve seyreltme kontrol edilmelidir. malzemeler / ekipman tablosunda belirtilen referanslar akış sitometri veya immünofloresan uygulamaları için seçilmiştir. Birincil / ikincil antikorlar veya konjuge fluorophores nedeniyle uygunsuz depolama faaliyetlerini kaybetmiş olabilir (örneğin, ışığa veya ısıya maruz kalma), yanlış seyreltme, geniş donma / çözülme veya kontamine tamponlar kullanılması. Onlar düzgün çalıştığından emin olmak için pozitif kontrol çalıştırın. Fare kemik iliği ya da proteinleri eksprese ettiği bilinen dalağından alınan hücreler kullanın. yüksek arka plan ve non-spesifik boyama önlemek için, hücrelerin düzgün yıkanmış ve (Immünofloresan için) yüksek nemde tutulması ve talimat olarak antikorlar seyreltilmiş olduğunu emin olun. doğru örnek arka plan seviyesini belirlemek için izotip kontrol antikoru ve primer antikor için aynı konsantrasyon ve seyreltme kullanın. esteraz sitokimya deneyler için,reaktifler saflaştırılmış fare dalak granülositik (Ly6G +) ve monositik (CD115 +) hücreleri içeren pozitif ve negatif kontrol slaytlar kullanılarak test edilebilir. Bu çalışmada açıklanan prosedür C1498 hücrelerin enjeksiyonundan sonra farelerde gözlemlenen lösemik özellikleri birçok insan akut miyelomonositik lösemi 11,12 ortak ayırt edici ortak gösterdi. işgal lösemik hücrelerin olgun ve olgun olmayan (progenitör ve öncüler) medüller hematopoietik hücrelerin bir azalma ile sonuçlandı. monositik hücreler gibi C1498 hücreleri, periferik kandaki yüksek frekans (&gt;% 20) bulunmaktadır. Hepatomegali, splenomegali lösemik hücrelerin infiltrasyonu sonuçlandığı gözlenmiştir, ve B lenfositleri ve miyeloid hücrelerde önemli artışlar splenomegali birlikte gözlenmiştir. kan platelet sayıları hematoloji analiz cihazı kullanılarak tahmin edildiğinde trombositopeni gözlenmiştir. Bu gösteri olduN, in vitro deneyler kullanarak, C1498 hücreleri, çözünebilir faktörleri 13 salgılayan normal murin hematopoez inhibe. Birkaç tümörlü fare modellerinde, (monositik ve granülositik hücreleri dahil olmak üzere), olgun myeloid hücreleri, anti-tümör spesifik T hücresi aktivasyonunu ve çoğalmasını 14 inhibe eden dalak, kemik iliğinden geçirmek için gösterilmiştir. Bu durumda, kemik iliği gözlendi hematopoietik hücrelerin azalma hematopoez ve / veya bunların göç bir eksiklik ya da meydana gelmiş olabilir. Bu ikinci bir mekanizma, periferik kandaki monositoz varlığının veya dalakta büyütülmüş miyeloid fraksiyonların gözlem açıklayabilir. Hücreler geliştirilmiş dalak hematopoez türemiş olabileceğini de düşünülebilir. Olgun B ön-maddeleri 15 lenfositler gibi Gerçekten de, sabit durum koşulları altında, dalak B hücrelerinin, bazı alt-gruplar tespit edilmiştir. Ayrıca, inflamatuar koşullar altında, medullary kök ve progenitorlar hücreler olgun monositler 16 üretimini uyarmak için dalak taşınmaya gösterilmiştir. Bu protokol bize lösemi gelişiminde katılan ve ek fonksiyonel yanı sıra moleküler deneyleri bunu yapmak için istihdam edilmelidir mekanizmaları ile ilgili sonuçlara varmak için izin vermez. Ancak bu veriler akut miyelomonositik lösemi klinik özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi içermektedir ve değerlendirmek ve yeni terapötik ajanların etkilerini anlamak için araştırmacılara yardımcı olacaktır.

Akut miyeloid lösemi (AML) olgunlaşma farklı aşamalarında engellenir hematopoietik miyeloid hücrelerin kontrolsüz çoğalma ile karakterize edilir. Bu düzensizliği granülositik, monositik, eritrosit veya megaryocytic farklılaşma yolları 1 etkileyebilir. AML hücreleri trombositopeni, lenfopeni ve anemi ile sonuçlanır engelli hematopoez, yol, kemik iliğinde birikir. lösemi hücreleri, kan ve Lenfoid olmayan organları istila. C1498 fare modeli literatür kana işgali tarif kanser hücreleri 1941 bir lösemi 10 aylık bir C57BL / 6 (H-2b) dişi fare izole çünkü akut lösemi için bir model olarak yıllardır kullanılmaktadır hematopoietik organları (örneğin, dalak ve lenf düğümleri) ve non-hematopoetik organların (örneğin, karaciğer, akciğer, yumurtalık ve böbrek) yüksek proliferatif C1498 hücreleri tarafından da bir IN ile enjekte edildikten sonratravenous, duyarlı farelere 2-4 içine deri altı veya intra-peritoneal rota. Ancak, bu fare modeli ya granülositik 2,5 veya miyelomonositik 6 lösemi uyardığı bildirildi. Daha yakın zamanlarda, 2002 yılında yayınlanan bir çalışmada, kemirgen NKT hücreli lösemi 7 olarak bu kanser türü tanımladı. Bu durumda, literatür, bu C1498 hücre hattının yapısı ve farelerde indükler ilişkili lösemi ile ilgili değişiklik gösterir. 70 - Bu tutarsızlıklar detaylı eksikliği ve hücrelerin hakkında güncel yayımlanan bilgilerin ve birçok çalışma 1950 yılında yapılmıştır çünkü genel olarak lösemi hastalığına başlıca nedeni vardır. Burada C1498 hücreleri tanımlama ve farelere damar içine enjekte edilmesiyle uyandırılır lösemi hastalığın doğasını analiz açıklamak için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu protokolün birinci bölüm, in vitro olarak kültür edilmiş C1498 hücre açıklama ayrılmıştır. floresan antiyüzey ve hücre içi hematopoietik belirteçler karşı organları akış sitometrisi kullanılarak fenotipi belirlemek için kullanıldı. miyeloperoksidaz varlığı immünofloresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi, onların hematopoetik soy ve farklılaşma sahne esterazların aktivitesini değerlendirmek için sitokimya kullanılarak değerlendirildi ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama yapıldı. C1498 Hücreler daha sonra farelere enjekte edildi ve indüklenen akut lösemi hastalığı Bu yazının ikinci bölümünde tarif edilmektedir. Aynı teknikler frekansları ve kemik iliğindeki lösemi ve içsel hücre, periferal kan, dalak ve non-hematopoetik organ (karaciğer, akciğer) fenotipleri belirlemek için kullanıldı. Bu protokol yüksek tekrarlanabilir ve burada sunulan veriler araştırmacılar yeni tedavi stratejilerinin etkilerini değerlendirmek için yardımcı olacaktır. Bu lösemi fare modeli zaten immünoterapi yaklaşımları test etmek için kullanılmıştırnd farklı kanser kemoterapötik ilaçları 8,9. Onların etkinliği tümör yükü ve sağkalım oranları evrimini belirlenerek değerlendirildi. Bu protokol tedavi sırasında lösemili ve diğer hematopoetik hücre popülasyonlarının dağılımı ve geçim hakkında ek bilgi sağlamak için kullanılabilir.

a detailed protocol for characterizing the murine c1498 cell line and its associated leukemia mouse model

1941 Bu enjeksiyonlar, akut lösemi gelişme olmasına neden olduğundan, genetik olarak özdeş ya konjenik farelere C1498 hücrelerinin damar içi enjeksiyon yapılmıştır. Bununla birlikte, bu hastalığın doğasına, literatürde iyi belgelenmiştir edilmemiştir. Burada, in vitro C1498 hücreleri karakterize etmek için in vivo olarak uyarılan lösemi doğasını belirlemek için bir teknik protokol sağlar. Bu prosedürün ilk bölümü hematopoietik soy ve kültür C1498 hücrelerin farklılaşma aşamasının belirlenmesinde odaklanmıştır. Bunu elde etmek için, çok parametre akış sitometrik boyama hematopoietik hücre markörleri tespit etmek için kullanılır. İmmünofloresan mikroskopi, sitokimyasal ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama sonra sırasıyla, miyeloperoksidaz ifadesini, esteraz ve hücresel morfoloji aktivitesini değerlendirmek için yapılır. Bu protokolün ikinci bölümü indüklenir lösemi hastalığını anlatan adamıştırin vivo. Ikinci kan lösemik ve içsel hücre frekansları saptanmasıyla elde edilebilir sitometrisi belirli bir lekeleme kullanılarak ve akış hematopoietik organların (örneğin, kemik iliği ve dalak) ve non-lenfoid dokular (örneğin, karaciğer ve akciğer) analiz eder. lösemi doğası sonra kemik iliğindeki özel esteraz için Mayıs-Grünwald Giemsa boyama ve boyama kullanılarak teyit edilmiştir. Burada, aynı yaştaki C1498- ve PBS ile enjekte edilmiş farelerde, bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları sunulmaktadır.

C1498 fare modeli karakterize etmek için, iki büyük adımlarla ilerledi. İlk olarak, C1498 hücreleri in vitro olarak bunların hematopoietik kökenli ve olgunlaşma aşamasına (Şekil 1) belirlenmesi için karakterize edildi. Bu hücreler daha sonra konjenik farelere enjekte edildi ve indüklenen lösemik hastalığın niteliği, farklı özellikleri belirlemek için değerlendirilmiştir: lösemik hücre infiltrasyonu, bunların fenotip, kemik iliğinde hematopoietik hücrelerin bir miktarının (olgun ve progenitorlar / ön), frekans C1498 hücreleri ve kan olgun hematopoietik hücrelerin ve organ şişme değerlendirilmesi (dalak, karaciğer ve akciğer) ve hücresel bileşimin. In vitro C1498 hücresi fenotipleri karakterize etmek için, hücreler, hematopoietik öncüler ve olgun hücreleri (Tablo 1) ile ifade edilir moleküllerine karşı yöneltilen antikorlar ile etiketlenir ve sonuçlar akış cytomet kullanılarak analiz edilmiştirry. C1498 hücreleri Mac-1 (CD11b / CD18) (~% 7), B220 (&gt;% 25) hücre yüzey ifadesi için pozitiftir ve bunlar CD3ε, T-hücre reseptör (TCR) Vβ zincirleri ve Mac hücre içi ifadesi sergilemiştir 3 (Şekil 2A ve B). hücreler, hücre yüzey markörlerinin Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, pan-NK molekülleri için negatif ve CD4 ve CD8 hücre içi ifadesi için (veriler gösterilmemiştir) . Daha sonra hematopoietik kök hücreler ve progenitorlar (Tablo 1) işaretleri için incelenmiştir. Ayrıca, CD117, CD34, Sca-1, CD150 ve CD16 / 32 hücre yüzey ifadesi için negatif idi (veriler gösterilmemiştir). Bu lösemili hücreler daha sonra yapışma, antijen sunumu ve ko-stimülatör moleküllerin ekspresyonunu belirlemek için test edildi. Hücreler yüzey belirteçleri LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), ve H-2D B ifade, CD80, CD86 ve CD274 (veriler gösterilmemiştir) MHC sınıf II negatif idi. C1498 hücreleri, Therefore miyeloid (Mac-1, Mac-3) ve lenfoid işaretleri (B220, CD3, TCR) ifade edilmektedir. daha iyi hematopoetik soy karakterize etmek için myeloperoksidaz ifade immünofloresan mikroskopi kullanılarak değerlendirildi. Tüm hücreleri onların miyeloid kökeni (Şekil 3A) doğrulandı miyeloperoksidaz, pozitif idi. Hücrelerin büyük bir kısmı, aynı zamanda α-naftil butirat esteraz (Şekil 3B, sol panel) için pozitif boyandı, ve bazıları naftol AS-D kloroasetat esteraz (siyah oklar) (Şekil 3B, sağ panel) için boyandı. Sonuçlar hücrelerin monositik ve granülositik hücrelerin karışımları ihtiva göstermektedir. Mayıs-Grünwald Giemsa boyama yapıldıktan sonra, C1498 hücreleri, yüksek Nucleo-sitoplazmik oranı ile çekirdeğinde 3 ila 5 nükleol, perinükleer halo, çok sayıda vakuoller ve bazofilik sitoplazma (Şekil 3C bir patlama şeklinde bir yapıya görüntülemek için gözlendi ). thUS, C1498 hücre çizgisi monoblastlardan ve miyeloblast oluşmaktadır. C1498 hücreleri (CD45.2 +), daha sonra damar içine CD45.1 + farelere enjekte edildi. fareler hücreleri enjekte edildi 17 ila 19 gün sonra yenik düştü. hastalığın öldü önce lösemi türü analiz edilebilir, böylece bu fareler kurban edildi. PBS enjekte edildi Kontrol fareleri, karşılaştırma için, aynı zaman noktalarında analiz edilmiştir. C1498 hücre enjekte edilen fareler May-Grünwald Giemsa lekeleme (Şekil 4A) yapıldı sonra hücrelerin yüksek benzeri bir görünüm ile gösterildiği gibi, kemik iliği içine C1498 hücrelerinin yoğun infiltrasyonu gösterilir. Onlar da akut miyelomonositik lösemi özelliğidir monoblastik ve miyeloblastik hücrelerin birikimini gösteren, onların monosit ve granülositik fenotipleri (Şekil 4B ve C) korudu. dmedüller hematopoetik hücreler sayılar, lösemik hücreler işgali, CD45.2 + C1498 hücreleri, B lenfositik, monositik ve (ataları, öncüleri ve olgun hücreler dahil) granülositik nüfus aşağıdaki düşüktü immunofluorescent boyama ve sitometri analizi çok parametrik akışını kullanarak ölçüldü olmadığını etermine. Lösemili hücrelerin hematopoietik hücrelerin% 36 16 temsil (veriler gösterilmemiştir). diğer hücre tipi tüm granülositik hücrelerin ortalama 3 kat ortalama olarak 4 kat, B hücresi alt-gruplar için ortalama 5-kat (PBS enjekte edilmiş farelerde daha C1498-enjekte edilmiş farelerde önemli ölçüde daha düşük sayıda mevcuttu C monositik alt-gruplar için) (Şekil 5A). Lösemi ve kontrol fare kan örneklerinde tek çekirdekli hücrelerin frekanslarının bir araştırma da lenfositler (Şekil 6A) arasında benzer bir yüzdesi, ancak monositik daha yüksek bir frekans ihtiva ettiğini gösterdive lösemi hücreleri. Bu özellikler, akut miyelomonositik lösemi 11 (Şekil 6B) temsil etmektedir. Akut miyelomonositik lösemi 12 diğer özellikleri arasında, C1498-enjekte edilen fareler şişmiş karaciğerleri (hepatomegali), akciğer ve dalak (splenomegali) (Şekil 7A) ile sunulmaktadır. CD45.2 + C1498 hücrelerin çeşitli frekanslar immünofloresan boyama ile bu organlarda tespit ve analiz (Şekil 7B) akış sitometrisi edildi. Splenomegali sızmış monositlerin yüksek sayıda kaynaklanabilir, biz de dalak nüfus oranlarını tahmin. B lenfosit, monositik hücreler ve granülositik hücre fraksiyonlarının sayılar 2 kat ortalama, önemli ölçüde daha büyük olan, 2.5 kat, 3 kat, sırasıyla kontrol dalak (Şekil 7C) göre lösemi dalaklarında. İnce sayfa = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" /> In vitro kültürlü C1498 Cep Hatları ve Akut Lösemi in vivo Tanımlar Karakterizasyonu için Kurma Protokolün. Hematopoetik soy ve doku kültüre C1498 hücrelerinin farklılaşma aşamasında Şekil 1. şematik Temsil ilk belirlendi. C1498 Hücreler daha sonra, akut lösemi gelişiminin uyarılması için konjenik farelere enjekte edildi. kemik iliği, periferik kan, dalak, karaciğer ve akciğer dokularında izolasyonu C1498 hücreleri infiltrasyonu sonra frekansları, fenotipleri ve morfolojik değişikliklerini saptamak amacıyla yapılmıştır. IV: Damar MGG:. Mayıs-Grünwald Giemsa <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> reklam / 54270 / 54270fig2.jpg &quot;/&gt; In vitro kültür. Nokta diyagramları ve hücre yüzeyi (A), ve hücre içi (B) histogramları sitometrisi Örnek akış sonra C1498 Hücreler Şekil 2. fenotipik analizi hematopoetik olgun hücre farklılaşması ile ilişkili moleküller gösterilmiştir C1498 eksprese. C1498 hücreler, hücre yüzeyi CD11b, CD18 ve B220 işaretleri ya da bunların izotip kontrolleri için spesifik olan floresan antikorlar kullanılarak kültürler hasat yıkandı ve etiketlenmiştir. hücre içi boyama için, hücreler, sabit geçirgenleştirildi ve Mac-3, CD3ε karşı antikorlar ve TCR (T hücre reseptörü) Vβ zincirli ya da izotip kontrolleri ortak bir epitop ile etiketlenmiştir. Analizler, canlı hücreleri ile yolluk kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html> ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" /> Şekil 3. Fonksiyonel ve Kültür C1498 Hücrelerinin Morfolojik Karakterizasyonu. C1498 hücre kültürlerinden hasat edilir ve mikroskopi için slaytlar üzerinde santrifüjlenmiştir. (A), miyeloperoksidaz ifadesi için boyama immünofloresan kullanılarak gerçekleştirildi. (B) Sitokimyasal reaksiyonlar α-naftil butirat esteraz (BOU) ve naftol AS-D kloroasetat esteraz analiz etmek için kullanıldı (CAE) C1498 hücreleri faaliyetleri. Hücreler, kahverengi, kırmızı, mor-geniş, sitoplazmik granüller sırasıyla gözlenmiştir her etiket için pozitif olarak kabul edilmiştir. C1498 hücrelerinin (C) May-Grünwald Giemsa (MGG) boyama. Her boyama deney için, mikroskop objektif büyütme gösterilir. Her bir görüntü, üç ayrı deneyi temsil etmektedir.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" /> Şekil 4. PBS ve Kemik İliği morfolojileri Fare C1498 enjekte. Kemik iliği hücreleri PBS ve C1498 hücre enjekte edilen farelerin izole ve mikroskopi için slaytlar üzerine santrifüj edildi. (A) Mayıs-Grünwald Giemsa (MGG) boyama. (B ) α-naftil bütirat esteraz (NBE) ve kloroasetat esteraz (CAE) işlevleri sitokimya kullanılarak değerlendirildi AS-D (C) naftol. Panel A&#39;da, bant (olgunlaşmamış) veya bölümlenmiş (olgun) nötrofiller PBS enjekte edilmiş farelerde daha C1498-enjekte edilen farelerin kemik iliği daha az görünür. Panel B, ve C kontrol kemik iliğinde görülen sayılar göre lösemi kemik iliği monositik ve granülositik hücrelerin birikimi olduğunu gösterir. Herşeymikroskopik analizler 100X büyütme objektif kullanılarak gerçekleştirilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" /> Şekil 5. PBS ve Medüller Populasyonlarının Kantitatif Analiz Fare C1498 enjekte. Kemik iliği hücreleri PBS ve C1498 hücre enjekte edilen farelerin izole ve hücre sayımı yapıldı sonra tahmin edilmiştir. Farklı hücre popülasyonlarının frekansları immün ve sitometri analizi canlı hücre kapı akış sonra belirlenmiştir. (A), B hücresi alt-gruplar B lenfositler (B), granülositik hücrelerin olgun pro-B hücreleri kademeli olarak CD19 + B220 + hücrelerinin dahil öncüleri bir yer ve CD11b + Ly6G + soy, - CD3. CD115 + ve monosit aşamalarını olgun atası hücreleri dahil - nd olgunlaşmamış ve olgun granülositler (C) monositik alt kümeleri CD3 olarak tanımlanmıştır. n = 7 fare / grup, ve veri = ortalama ± SEM gösteren histogramlar olarak sunulmaktadır. *** P &lt;0.0001 ve ** p &lt;0.01, PBS ve C1498 enjekte fareler karşılaştıran Student en t testi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" /> PBS ve Mononükleer Hücre Alt Grupları Şekil 6. Kan Analiz fareler C1498 enjekte. Sırasıyla, PBS ve C1498 CD3 + ve B220 + hücrelerinin olarak tanımlanan (a) T ve B limfosit yüzdeleri, dot sitometrisi lekeleri Örnek akış hücresi enjekte. ve CD115 + LY6C yüksek hücre - fareler (B) C1498 lösemik ve kontrol monositik hücre frekansları (PBS) farenin CD115 + LY6C analiz edilmesi ile belirlenmiştir. Analiz canlı hücreleri yolluk gerçekleştirildi. Lösemi ve kontrol fareleri karşılaştırmak için, C1498 hücreleri hariç tutulmuştur + CD45.2. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" /> Lösemi ve Kontrol Farelerde Dalak Populasyonlarının Şekil 7. tahmini. (A), lösemi farelerde şişen, karaciğer, akciğer ve dalak Örnek fotoğraf kontrol fareleri ile karşılaştırıldığında. Dalaklar, doku bozulması, aşağıdaki toplanır ve tartılır ve splenositler sayıldı. (B) Histogram fark lösemik hücre frekansları temsil edenerent organları immün CD45.2 + hücreleri için yapıldı ve sonuçlar flow sitometri kullanılarak analiz edildikten sonra. (C) dalak B, immün sonra granülositik ve monositik hücre sayıları tahminleri ve analiz yolluk akım sitometri canlı CD19 + B220 belirlemek için yapılmıştır + CD3 - CD11b + Ly6G + CD3 - CD11b + Ly6C - ve CD3 - CD11 b + Ly6C yüksek hücreler. akciğerler, dalak ve karaciğerleri için gösterilen ölçek çubukları 1 cm göstermektedir. .. 5 = - 8 fare / grup, ve veri ortalama ± SEM olarak histogramlar temsil edilir * p &lt;0.05; ** p = 0.0033, PBS ve karşılaştırma Student t testi en C1498-enjekte edilen fareler <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">, lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody&gt; <tr><td> hücre Tipi </td><td> Zar veya hücre içi moleküller </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Öncüleri ve Olgun hücreleri </td><td></td></tr><tr><td> NK hücreleri </td><td> NK1.1 + pan-NK + </td></tr><tr><td> NKT hücreleri </td><td> NK1.1 + pan-NK + TCR Vbeta + (8.2), CD3 + </td></tr><tr><td> T lenfositleri </td><td> TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 + </td></tr><tr><td> B hücreleri öncüleri ve B lenfositleri </td><td> B220 + CD19 +, CD21 / + 35 </td></tr><tr><td> granülositik öncüleri ve granülositler </td><td> Ly6G + Mac-1 + CD11b + </td></tr><tr><td> monositik ön-maddeleri ve monosit / makrofajlar </td><td> CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / + 35, CD115 + Ly6Chi </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> atalarıdır </td><td></td></tr><tr><td> multipotent atalarıdır </td><td> CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin CD150-) </td></tr><tr><td> lenfoid hazırlanmış multipotent progenitörler </td><td> CD117hi Sca-1hi CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> ortak lenfoid atalarıdır </td><td> CD117lo Sca-1LO CD127 + (Lin-) </td></tr><tr><td> Ortak miyeloid atalarıdır </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td> granülosit-makrofaj progenitörler </td><td> CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td> megakaryosit-eritroid atalarıdır </td><td> CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin Sca-1-) </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td> Hematopoetik kök hücreler </td><td> CD117 + Sca-1 + CD150 + (Lin CD34) </td></tr></tbody></table> Tablo Hematopoetik hücre soylarının ve Farklılaşma 1. İşaretleyiciler. CD: farklılaşma küme; Lin: Olgun hücrelerin belirteçleri; lo:Düşük ifadesi; hi: yüksek ifade; int: ara ifade; NK: doğal öldürücü hücreler; TCR: T-hücresi reseptörü.

Watch this Scientific Journal Video about A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model at JoVE.com

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Bu yazıda, in vitro ve enjeksiyondan sonra farelerde akut lösemide C1498 hücre kültürlerinin karakterize etmek için kullanılabilen bir teknik prosedürü sağlar. Fenotipik ve fonksiyonel analizler flow sitometri, immünofloresan mikroskopi, histokimya ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama kullanılarak gerçekleştirilir.

Fare C1498 Cep Hattı ve İlişkili Lösemi Fare Modeli Karakterizasyonu için Detaylı Protokolü

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

a-detailed-protocol-for-characterizing-murine-c1498-cell-line-its

Research

JoVE Journal

Cancer Research

19.8K Görüntüleme.  INSERM, UMR-S-1172, Centre de Recherche Jean-Pierre Aubert (JPARC).  Bu yazıda, in vitro ve enjeksiyondan sonra farelerde akut lösemide C1498 hücre kültürlerinin karakterize etmek için kullanılabilen bir teknik prosedürü sağlar. Fenotipik ve fonksiyonel analizler flow sitometri, immünofloresan mikroskopi, histokimya ve Mayıs-Grünwald Giemsa boyama kullanılarak gerçekleştirilir. 

Video: A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Kanser Araştırmaları

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Pre-clinical models evaluating adjuvant therapy targeting breast cancer metastasis are lacking. To address this, we developed a murine model of de novo pulmonary mammary adenocarcinoma metastasis, wherein therapies administered in the adjuvant setting (post surgical resection of primary tumors) can be evaluated for efficacy in impacting previously seeded pulmonary metastases.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

Periferik Radyasyonla Bağlı Yorgunluk A Fare Modeli

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from healthy mice as well as mice with AML driven by MLL-AF9. Specifically, we describe a two-step cell staining process, whereby healthy or leukemia BM cells are first stained with a fluorogenic dye that detects mitochondrial superoxides, followed by staining with fluorochrome-linked monoclonal antibodies that are used to distinguish various healthy and malignant hematopoietic progenitor populations. We also provide a strategy for acquiring and analyzing the samples by flow cytometry. The entire protocol can be carried out in a timeframe as short as 3-4 h. We also highlight the key variables to consider as well as the advantages and limitations of monitoring ROS production in the mitochondrial compartment of live hematopoietic and leukemia stem and progenitor subpopulations using fluorogenic dyes by flow cytometry. Furthermore, we present data that mitochondrial ROS abundance varies among distinct healthy HSPC sub-populations and leukemia progenitors and discuss the possible applications of this technique in hematologic research.

We describe a method for using multiparameter flow cytometry to detect mitochondrial reactive oxygen species (ROS) in murine healthy hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and leukemia cells from a mouse model of acute myeloid leukemia (AML) driven by MLL-AF9.

Murine Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerde Mitokondriyal Reaktif Oksijen Türlerinin Akış Sitometrik Analizi ve MLL-AF9 Tahrikli Lösemi

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by introducing specific mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, using clustered regulatory interspaced short palindromic repeat (CRISPR)-based genome editing technology in mice. This technology allows us to accurately mimic the genetic changes that occur in human cancers using mice. By genetically transforming murine primary cells, we can better study cancer development, progression, treatment, and diagnosis. In this study, we used Cre-inducible Cas9 mouse tongue epithelial cells to enable genome editing using adeno-associated virus (AAV) in vitro. Specifically, by altering KRAS, p53, and APC in normal tongue epithelial cells, we generated a murine head and neck cancer (HNC) cell line in vitro,which is tumorigenic in syngeneic mice. The method presented here describes in detail how to generate HNC cell lines with specific genomic alterations and explains their suitability for predicting tumor progression in syngeneic mice. We envision that this promising method will be informative and useful to study tumor biology and therapy of HNC.

Development of murine models with specific genes mutated in head and neck cancer patients is required for understanding of neoplasia. Here, we present a protocol for in vitro transformation of primary murine tongue cells using an adeno-associated virus-Cas9 system to generate murine HNC cell lines with specific genomic alterations.

Adeno-Associated Virus-Cas9 Sistemi Kullanılarak Genetiği Değiştirilmiş Bir Murine Baş ve Boyun Kanseri Hücre Hattı In Vitro Kurulması

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role of CAFs in the tumor microenvironment can be helpful for understanding the functional importance of fibroblasts, fibroblasts from different tissues, and specific genetic factors in fibroblasts. Mouse models are essential for understanding the contributors to tumor growth and progression in an in vivo context. Here, a protocol in which cancer cells are mixed with fibroblasts and introduced into mice to develop tumors is provided. Tumor sizes over time and final tumor weights are determined and compared among groups. The protocol described can provide more insight into the functional role of CAFs in tumor growth and progression.

A protocol to co-inject cancer cells and fibroblasts and monitor tumor growth over time is provided. This protocol can be used to understand the molecular basis for the role of fibroblasts as regulators of tumor growth.

Kanserle İlişkili Fibroblastların Tümör Büyümesindeki Rolünü Araştırmak İçin Bir Fare Modeli

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, particularly CAR-NK cell, is one of the most promising 'off-the-shelf' development without severe life-threatening toxicity. However, the bottleneck for developing a successful CAR-NK therapy is achieving sufficient numbers of non-exhaustive, long-lived, 'off-the-shelf' CAR-NK cells from a third party. Here, we developed a new CAR-NK expansion method using an Epstein-Barr virus- (EBV) transformed B cell line expressing a genetically modified membrane form of interleukin-21 (IL-21). In this protocol, step-by-step procedures are provided to expand NK and CAR-NK cells from cord blood and peripheral blood, as well as solid organ tissues. This work will significantly enhance the clinical development of CAR-NK immunotherapy.

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Here, we present a method to expand peripheral blood natural killer (PBNK), NK cells from liver tissues, and chimeric antigen receptor (CAR)-NK cells derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or cord blood (CB). This protocol demonstrates the expansion of NK and CAR-NK cells using 221-mIL-21 feeder cells in addition to the optimized purity of expanded NK cells.

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...