The authors thank Ms.Alisha Knudson for the editorial help. They would also like to acknowledge the financial support from the NIH/NCI (3R01CA115483, to K.S.L.), the DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, to K.S.L.), the NIH/NCI (1R01CA199668, to Y.L.), and the NIH/NICHD (1R01HD086195, to Y.L.).

Etik ifadesi: Dişi atimik çıplak fareler (Nu / Nu suşu), 6-8 haftalık, satın alınan ve AAALAC yönergelerine göre patojensiz şartlar altında tutulur ve herhangi bir deney öncesinde en az 4 gün boyunca ortama alışmaları sağlandı edildi. Tüm hayvan deneyleri kurumsal kurallarına uygun olarak gerçekleştirilir ve California, Davis Üniversitesi&#39;nde Hayvan Kullanım ve Bakım Yönetim Danışma Kurulu tarafından onaylanan protokol sayılı 07-13119 ve sayılı 09-15584 göre edildi. TD PEG 5K Cys 1. sentezi 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol><li> Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, buz üzerinde, susuz dimetilformamid (DMF) ve soğuk 10-20 ml MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0.4 mmol) çözülür. </li><li> Bir cam kabın içinde, 3 eşdeğer çözülür. 1-hidroksi-6-kloro-benzotriazol (HOBt), 3 eşd. N, N &#39;diizopropilkarbodiimid (DIC) ve 3 eşdeğer. Susuz D içinde (Fmoc) 2 Lys-OH,MF (10-15 mi). Manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 15-20 dakika karıştırılır. </li><li> MeO-PEG 5K -NH 2. buz banyosu alınır ve oda sıcaklığında gece boyunca, reaksiyon karışımı karıştırıldı içeren reaksiyon balonuna karışımı ekleyin. </li><li> Ince tabaka kromatografisi (TLC) 16 ve Kaiser testi 17, reaksiyonun tamamlandığını teyit (san renkli serbest NH2 olmadığını gösterir). Reaksiyon şişesine buz soğukluğunda eter 200 ml ekleyerek polimer ürün 1 (MeO-PEG 5K -Lys (nH-Fmoc) 2) çökelmesi. santrifüj yoluyla çöktürülmüş polimer (6 6,000 xg&#39;de dk ve 4 ° C) ayırın. <ol><li> TLC gerçekleştirmek için, silika jel ile kaplanmış TLC plakaları ile ilgili örnekleri nokta. diklorometan / metanol kullanarak (9: 1) mobil faz olarak. TLC plakaları gelişmekte sonra UV lamba altında noktalar dikkate alınmalıdır. Bir de sıcak bir plaka üzerinde amin noktalar görselleştirmek için boyama reaktif ninhidrin kullanabilirsiniz. </li><li> Kaiser test, Kaiser reaktifi içeren cam tüp numune biraz yerleştirin. 5 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısı ve renk değişimi (çözeltinin rengi san kalırsa, daha sonra reaksiyon tamamlandı) arayın. </li></ol></li><li> Susuz DMF (10-20 mL) içinde bir ürün yeniden çözülür ve çöktürme ve santrifüjleme (adım 1.4) tekrar edin. </li><li> daha sonra tekrar adım 1.5 ve buz soğukluğunda eter ile polimerin çökeltilmesi üç kez yıkayın. </li><li> Temiz bir tepkime şişesine, polimer çökelti 1 transferi ve kalıntı eter uzaklaştırılmış yüksek vakum kaynağına şişesi bağlayın. </li><li> Hazırlama ve% 20, yaklaşık 20-30 ml ekleyin (h / h) DMF içinde 4-metil-piperidin 1 ara polimer için. Tam çözünme gerçekleşene kadar karıştırılır. 3 saat reaksiyondan. </li><li> TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar) 17 (adım 1.4) completio onaylamak içinReaksiyonun n. Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış geçin. </li><li> Polimer ürünü 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2), bir vakum altında kurutulur. </li><li> (1.1-1.7 adımlar) ürünü 3 oluşturmak için ara 2 üzerine (Fmoc) 2 Lys-OH-kavrama bir tur daha yürütmek (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). (1.8-1.10 adım) Fmoc grupları (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) ve bir çift (Fmoc) Lys (Boc) (1.1-1.7 adım) -OH de korumak üçüncü nesil dendritik polilisin oluşturur (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) PEG zincirinin bir ucunda dört Boc ve Fmoc grubu ile sona erdirildi. </li><li> Bir reaksiyon şişesine, ara elde edilen polimeri 5 aktarın. olarakdiklorometan (DCM), 1 (h / h) trifloroasetik asit (TFA): eparate Reaksiyon şişesi, 1 hazırlayın. Polimer 5, ara 1 TFA / DCM (h / h) karışımı bir 1: 15-20 ml ilave edilir. Polimer tamamen eriyene kadar karışım karıştırılır. ilave bir 3 saat daha karıştırılır. </li><li> TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi reaksiyonun tamamlandığını teyit etmek için 17 (adım 1.4) (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar). Reaksiyon tamamlandıktan Bir zor akışlı bir çözelti elde edilene kadar hava ile polimerin in TFA / DCM karışımı buharlaşır. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış devam edin. Vakum altında - (((Fmoc) Lys (NH2)) 4 -Lys-Lys 2 MeO-PEG 5k) polimerik ürünün 6 kurutun. </li><li> Bir tepkime şişesi içine 6 ara transfer polimeri. 8 eşdeğer ihtiva eden susuz DMF yaklaşık 40 ml kullanın. N, N--diisopropylethylamiNE (DIEA) polimeri 6 ara madde çözülmesi için. Bir cam kabın içinde, 12 eşdeğer çözülür. HOBt, 12 eşd. DIC, 12 eşd. susuz DMF 20-25 ml arasında (Fmoc) Cys (Trt) -OH. 10-15 dakika boyunca sallayın ve 6 içeren reaksiyon balonuna Reaksiyon karışımı ekleyin. Gecede reaksiyonu çalıştırın. </li><li> TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. ((Fmoc) Lys - - ((Fmoc) Cys Reaksiyon tamamlandıktan halinde ürün 1 (adım 1.4-1.6) için tarif edilen şekilde, ürün 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 izole etmek için, eter çökelmeye devam (Trt))) 4. </li><li> Ürünü 8 elde etmek için, adım 1.8&#39;de de belirtildiği gibi, on 7 Fmoc de-koruma gerçekleştirin (- (Lys (NH 2) - PEG 5K Lys-Lys 2 (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Çift (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( &quot;Ebes&quot; bağlayıcı, 24 eşi.), Bir HOBt için yukarıda belirtilen prosedür kullanılarak ara polimer / DIC aracılı bağlanma ile ilgili ara madde 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys-Lys 2 4 elde etmek için - (Cys (trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Ara 10 almak için Fmoc de koruma bir tur daha (1.6-1.8 adımlar) gerçekleştirin (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li> Bir tepkime şişesi içine polimerin ara madde 10 aktarılır ve çözünmesi susuz DMF (yaklaşık 30-40 mi) ilave edin. Başka bir reaksiyon şişesine ise 24 eşdeğer çözülür. Susuz DMF (daha önce yayınlanmış prosedüre göre hazırlandı) CAOSu (20-30 mi), 18. 48 eşdeğer ekleyin. ve N, N-diizopropiletilamin ve 10-15 dakika boyunca karışmaya bırakıldı. 10 içeren reaksiyon balonuna içine içeriğini aktarın ve reaksiyon çalıştırmak o izinvernight. </li><li> TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. (Cys (Trt)) 4 -Ebes - Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) ürünü 11 izole etmek (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 belirtildiği gibi, eter yağış devam 8 -CA 8). de-iyonize su içinde diyaliz ve beyaz bir toz elde etmek için örnek liyofilize. </li><li> Bir tepkime şişesi içine, ara polimerin 11 yerleştirin. Hazırlama ve polimer çözeltisi içine, TFA / 1,2-etanditiol (EDT) / trietilsilan (TIS) 20 ml / H2O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v) karışımı ekleyin. Tam çözünme gerçekleşene kadar karışım karıştırılır. 4 saat reaksiyondan. TLC 16 ile reaksiyonun tamamlandığını onaylayın. </li><li> Davlumbaz altında, içine hava üflemek polimer-TFA / EDT / TIS / H 2çözelti kadar Ç karışımı viskoz hale gelir. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için tarif edilen şekilde nihai ürün, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8) izole etmek için, eter çökeltme geçin. asetonitril içinde çözülür ve beyaz bir toz elde etmek için bu liyofilize edin. </li></ol> PTX-yüklü misellerin 2. Hazırlık <ol><li> Standart buharlaştırma yöntemi kullanılarak bir PTX yüklü PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 misel hazırlayın. <ol><li> Kloroform, 1 ml (CHCI3) &#39;de PTX farklı bir miktarda (1-9 mg) ile TD 20 mg eritin. Homojen kuru polimer film elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücüyü çıkarın. gerektiğinde ilaç yüklü misellerin oluşumunu sağlamak için, 40 kHz, 30 dakika süreyle sese tabi tutularak ve ardından girdap fosfat-tamponlu salin (PBS) ile 1 ml film sulandırın. </li><li> % 3 (a / a) H2O 2 (1 eşdeğer 6 ul ekle. FRTD&#39;de tiol grupları oksitleyebileceğini) tiyol gruplar ee. Ellman testi 19 ile gösterildiği gibi serbest tiol gruplarının seviyesi, sabit bir düşük değerli kalır kez daha fazla karakterizasyon için misel solüsyonu kullanın. </li><li> örnek sterilize etmek için 0.22 mikron filtre ile çözüm Filtre. 9 kez asetonitril eklenmesi ve sonikasyon 10 dakika gerçekleştirerek miseller uyuşturucu serbest bıraktıktan sonra, bir HPLC sistemine 20 miseller yüklenen ilaç miktarını analiz edin. mobil faz olarak asetonitril / su ile HPLC için bir C18 sütunu kullanın. </li><li> HPLC alan değerleri ve 11, standart ilaç konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisine göre ilaç yüklemesine hesaplayın. NOT: yükleme verimliliği ilk ilaç içeriğine miseller yüklenen ilaç oranı olarak tanımlanır. </li></ol></li></ol> Misellerin 3. Karakterizasyonu <ol><li> m büyüklüğü ve büyüklük dağılımını ölçmekdinamik ışık saçılımı (DLS) alet 29 icelles. oda sıcaklığında ölçümleri gerçekleştirmek ve 1 mg / ml olarak misel konsantrasyonu tutun. NOT: parçacık boyut analizi gerçekleştirmek boş olarak PBS kullanın ve sonra gerçek örnekler için partikül büyüklüğü kaydetmek için. numuneler için üç nüsha olarak okumaları alın ve sonra okumaları ortalama. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 13,21, ABD Doları, önce ve bir hidrofobik flüoresan sonda olarak piren ile çapraz bağlama sonra, PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kritik misel konsantrasyonu (CMC) ölçmek için floresan spektrumu kullanın. NOT: Genellikle, misel konsantrasyonu 5 × 10 -7 5 × 10 -4 M. aralıkları </li></ol> ya da indirgeme maddeleri, SDS misellerin 4. Stabilite <ol><li> sodyum dodesil sülfat stok çözeltileri (SDS) çözeltisi (7.5 mg / ml) ve PBS içinde disülfid çapraz bağlı miseller (1.5 mg / ml) hazırlayın. Daha sonra, uNihai SDS konsantrasyonu olan bir çözelti karışımı yapmak stok solüsyonları şarkı 2.5 mg / ml ve misel konsantrasyonu 1.0 mg / ml olan. </li><li> ile ya da 10 mM glutatyon (GSH) varlığı olmadan önceden belirlenen zaman aralıklarında misel çözeltilerinin (adım 3.1 belirtildiği gibi) boyutu ve boyut dağılımı ölçülür. </li></ol> 5. Hemoliz tayininde <ol><li> Toplanan daha önce yayınlanmış prosedür 11 ve çıplak farelerde taze sitratlı kan kullanılarak PTX yüklü çapraz bağlı miseller (PTX-DCMs) göre hazırlandı PTX yüklü olmayan çapraz bağlı miseller (PTX-NCMs) hemolitik potansiyelini değerlendirir kuyruk peçe. <ol><li> % 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya daha sonra, 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de kan numunesi (1.0 mi) bir santrifüj ile kırmızı kan hücreleri toplamak PBS ile uygun üç kez yıkayın ve. </li></ol></li><li> Farklı konsantrasyonlarda (0.2 ve 1.0 ile birlikte eritrosit süspansiyonu 200 ul karıştırınmg PTX-NCMs ve PTX-DCMS, / ml), sırasıyla, bir kuluçka çalkalayıcı içinde 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de misel-eritrosit karışımları santrifüj. 96 oyuklu bir plakaya her numunenin süpernatant 100 ul aktarın. Bir mikro-plaka okuyucusu kullanmak sureti ile 540 nm de üstte yüzen madde içindeki serbest hemoglobin absorbansı ölçülür. Not: Triton-100 (% 2) ve PBS ile inkübe eritrositler sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılacak. RBCs yüzde hemoliz aşağıdaki formülle hesaplanır: RBC hemoliz = (OD örneği - OD negatif kontrol) / (OD pozitif kontrol - OD negatif kontrol)% 100 ×. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+in+medicine:+therapeutic+applications+and+developments.">Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).</li><li>Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Delivery+of+Cancer+Drugs.">Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs.</a> Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).</li><li>Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+enhanced+permeability+and+retention+effect+for+tumor+targeting.">Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting.</a> Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).</li><li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles.">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).</li><li>Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+polymeric+therapeutic+nanoparticles:+design,+development+and+clinical+translation.">Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).</li><li>Li, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+stabilized+multifunctional+dextran+nanoparticles+efficiently+deliver+doxorubicin+into+the+nuclei+of+cancer+cells.">Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).</li><li>Miyata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+catiomer+polyplexes+with+regulated+densities+of+charge+and+disulfide+cross-linking+directed+to+enhance+gene+expression.">Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).</li><li>Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-labile+core+cross-linked+micelles+for+pH-triggered+release+of+antitumor+drugs.">Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs.</a> Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).</li><li>Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysable+core-crosslinked+thermosensitive+polymeric+micelles:+synthesis,+characterisation+and+in+vivo+studies.">Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies.</a> Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).</li><li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-crosslinked+polymeric+micelles+with+controlled+release+of+covalently+entrapped+doxorubicin.">Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin.</a> Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-assembling+nanoparticle+for+paclitaxel+delivery+in+ovarian+cancer.">A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer.</a> Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+size-tunable+nanocarrier+system+for+targeted+anticancer+drug+delivery.">A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery.</a> J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+disulfide+cross-linked+micelles+for+on-demand+paclitaxel+delivery.">Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery.</a> Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+boronate+crosslinked+nanocarriers+for+targeted+drug+delivery+in+response+to+acidic+pH+values+and+cis-diols.">Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smart+and+versatile+theranostic+nanomedicine+platform+based+on+nanoporphyrin.">A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Belenki, B. G., Gankina, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+chromatography+of+polymers.">Thin-Layer chromatography of polymers.</a> J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cholic+acid-based+molecular+receptors:+head-to-head+cholaphanes.">Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+Ellman's+reagent.">Reassessment of Ellman's reagent.</a> Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).</li><li>Ahuja, S., Rasmussen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+HPLC+method+development+for+pharmaceuticals.">Overview of HPLC method development for pharmaceuticals.</a> HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , 1-11 (2007).</li><li>Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+thermo-sensitive+core-shell+nanoparticles+for+targeted+paclitaxel+delivery.">Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery.</a> Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).</li><li>Kato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+cross-linked+micelles+for+the+targeted+delivery+of+vincristine+to+B-cell+lymphoma.">Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma.</a> Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="OA02"+peptide+facilitates+the+precise+targeting+of+paclitaxel-loaded+micellar+nanoparticles+to+ovarian+cancer+in+vivo.">"OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo.</a> Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).</li><li>Koo, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-cross-linked+PEG-poly(amino+acid)s+copolymer+micelles+for+glutathione-mediated+intracellular+drug+delivery.">Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery.</a> Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).</li><li>McLellan, L. I., Wolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutathione-dependent+enzymes+in+cancer+drug+resistance.">Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance.</a> Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).</li><li>Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+peroxide-mediated+oxidative+refolding+of+a+protein+at+physiological+pH+and+implications+for+oxidative+folding+in+the+endoplasmic+reticulum.">Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum.</a> Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicines:+closing+the+translational+gap.">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li></ol>

Y. Li and K.S.L. are the inventors of a pending patent on reversibly crosslinked micelle systems (US patent application 61/485,774). K.S.L. is the founding scientist of LamnoTherapeutics Inc., which plans to develop the nanotherapeutics described in the manuscript. The remaining authors declare no competing financial interests.

Çeşitli nanopartiküller ilaç iletiminde potansiyel kullanım için incelenmiştir. Lipozomal doksorubisin ve paklitaksel (PTX) insan serum albümin nano-agrega kanser tedavisi için FDA tarafından onaylanmış nanotherapeutics arasındadır -yüklü. klinik olarak etkili olmasına rağmen, ancak, bu nanotherapeutics iki boyut açısmdan göreceli olarak &quot;büyük&quot;, ve karaciğer ve akciğer birikme eğilimindedir. nispeten daha küçük partikül boyutları ve daha yüksek ilaç yükü kapasitesine sahip p...

Nanoteknoloji biyomedikal alanlarda 1 bir dizi yararlandı hızlı gelişen bir alandır. Nanopartiküller geleneksel terapötik diğer türleri ile mümkün değildir özellikleri tasarımı ve ayarlama için fırsatlar sağlar. Nano taşıyıcılar, ilaç dolaşım süresini uzatmak, biyolojik ayrışma karşı ilaçların istikrarı geliştirmek ilaç çözünürlüğü sorunları aşmak ve ince ayarlı hedefli ilaç dağıtım ve ko-teslim görüntüleme maddeleri 1,2 için olabilir. Nanopartikül bazlı verme sistemleri Kanser görüntüleme ve tedavisi ümit vaat etmektedir. Tümör vaskülatürlerden makromoleküllere sızan ve gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi 3 ile, tümör bölgelerinde nano-tanecikleri, dolaşımdaki birikmesidir yol açabilir. Aktif bir anti-kanser ilaç taşıyıcılar olarak izlenmektedir birçok nano taşıyıcı (örneğin, lipozomlar, hidrojeller ve polimerik misel) arasında, bir polimerik miseller th geniş bir popülarite kazanmışe son on 4,5. Polimerik miseller, intravenöz uygulama ile ilgili potansiyel unimers içine ayrışma yol kritik misel konsantrasyonu (CMC) altına seyreltilebilen bir termodinamik sistemdir. Çapraz bağlanma stratejileri unimers içine misel ayrışmasını en aza indirmek için istihdam edilmiştir. Ancak, aşırı stabilize miseller böylece genel terapötik etkinlik azaltarak, hedef bölgelerde bırakmadan gelen ilaç engelleyebilir. Çeşitli kimyasal yaklaşımlar yapmak için araştırılmıştır çapraz bağlama redoks yanıt olarak ya da indirgenebilir disülfid bağlarının 6,7 ve pH-parçalanabilen 8 veya hidrolize ester bağları 9,10 olarak dış uyaranlara, için parçalanabilir. Daha önce telodendrimers (TD) olarak adlandırılır tasarım ve dendritik kolik asit (CA) blok ve doğrusal polietilen glikol (PEG) kopolimerleri, aşağıdakilerden oluşan misel nanopartiküllerin sentezi 11-15 bildirmiştir </&gt; Sup. Bu TDS (n = molekül ağırlığı kilodalton (K) Y, kolik asit sayısını (CA) birimleri =), PEG nK -CAy olarak temsil edilir. Bunlar hidrofobik çekirdekte paklitaksel (PTX) ile doksorubisin (DOX) halinde kapsül ilaç küçük olmaları, uzun bir raf ömrü ve yüksek verimlilik ile karakterize edilir. PEG, lisin, ve CA gibi TD yapı blokları, biyolojik olarak uyumlu olan, ve bir PEG korona varlığı retiküloendotelyal sistemleri tarafından misel nanopartiküllerin spesifik olmayan soğurulma engelleyen bir &quot;gizli&quot; Nanopartikül karakteri kazandırabilmektedir. Tiollenmiş doğrusal dendritik polimerler kolaylıkla standart TDS dendritik oligo-lisin omurgasına sistein sokulmasıyla üretilebilir. Bu makalede, TDS hidrofobik çekirdeğin içine disülfit çapraz bağlantı (Şekil 1) verilmesi ile tersine çevrilebilir çapraz bağlanmış miselar ilaç verme sistemi üretimi için, basit bir protokol sunulur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="795">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:216px;">MeO-PEG5K-NH2</td>
			<td style="width:105px;">Rapp Polymere</td>
			<td style="width:119px;">125000-2</td>
			<td style="width:355px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">AFK107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td style="width:119px;">AS-20132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Cys(Trt)-OH</td>
			<td>Aapptec</td>
			<td>AAC105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dimethylformamide</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1160-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethyl ether</td>
			<td style="width:105px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">E134-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6508</td>
			<td>Corrosive, handle with care</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4-methyl piperidine</td>
			<td style="width:105px;">Alfa-Aesar</td>
			<td style="width:119px;">L-02709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ebes linker</td>
			<td style="width:105px;">Anaspec</td>
			<td>AS-61924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cholic acid</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">02390</td>
			<td>Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triisopropylsilane</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">233781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform (anhydrous)</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hydrogen peroxide solution 30%</td>
			<td style="width:105px;">Aaron Industries</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HoBt-Cl</td>
			<td style="width:105px;">Aaptec</td>
			<td style="width:119px;">CXZ096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC</td>
			<td style="width:105px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D125407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6&#8211;8 weeks age</td>
			<td colspan="2">Harlan (Livermore, CA)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a facile and efficient approach for the production of reversible disulfide cross-linked micelles

Nanotıp biyomedikal uygulama için ölçek nanometre parçacıkların eşsiz özelliklerini sürdürür terapi yükselen bir şeklidir. Tedavi sonuçları maksimize etmek ve ilaç ilişkili yan etkileri azaltmak için ilaç dağıtım geliştirilmesi bugünkü Nanotıp taşlarından bazılarıdır. Özellikle nanopartiküller kanser tedavisinde geniş bir kullanım alanı bulmuştur. tasarım, uygulama ve tümör mikro dayalı üretimde esneklik yüksek derecesi Nanoparçacıklar klinik uygulamaya hızlı çeviri daha etkili olduğu tahmin edilmektedir. polimerik misel nano taşıyıcı ilaç verme uygulamaları için popüler bir seçimdir. Bu makalede, iyi tanımlanmış bir amfifilik lineer dendritik kopolimer (telodendrimer, TD) kendini düzenlemesinden göre ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller sentezlenmesi için basit ve etkili bir protokol açıklar. TD polietilen gl oluşurHidrofilik segmenti ve çözelti esaslı peptid kimyası kullanılarak bir amin ile sona eren PEG çekirdek oluşturucu hidrofobik yarı parça eklenmiş adım adım bir Tiollenmiş kolik asit küme olarak ycol (PEG). Böyle paklitaksel (PTX) olarak kemoterapi ilaçları, standart bir çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak yüklenebilir. O 2 aracılı oksidasyon önce TDS ile ilgili serbest tiyol grupları içi misel disülfit çapraz bağlantı oluşturulması için kullanılmıştır. Bununla birlikte, reaksiyon yavaş ve büyük ölçekli üretim için uygun değildi. Son zamanlarda, bir H 2 O 2 aracılı oksidasyon yöntemi daha uygun ve verimli bir yaklaşım olarak araştırılan ve 96 kat daha hızlı daha önce bildirilen yönteme göre daha oldu. Bu yaklaşımı kullanarak, PTX-yüklü, disülfid çapraz bağlanmış nanopartiküller 50 g başarılı dar parçacık boyutu dağılımı ve yüksek ilaç yüklemeli verimle imal edilmiştir. Elde edilen misel çözeltisi stabilitesi örneğin W birlikte kuluçkaya olarak kesintiye koşullar kullanılarak çözümlendiya da indirgeyici bir madde olmayan bir deterjan, sodyum dodesil sülfat, i. bunların olmayan çapraz bağlı karşılıkları ile karşılaştırıldığında ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller az hemolitik aktivite göstermiştir.

İlaç yüklü disülfid Çapraz bağlanmış misellerin hazırlanışı ve Karakterizasyonu Amfifilik polimerin PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kanser ilaç dağıtımı için bir disülfid çapraz bağlanmış miselar sistemi oluşturabilen bir dendritik polimerdir. Yapısal olarak, bu dallı bir poli (lisin-sisteyin-Ebes) omurgası boyunca doğrusal bir PEG molekülünün (hidrofilik etki, molekül a?...

Watch this Scientific Journal Video about A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles at JoVE.com

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

a-facile-efficient-approach-for-production-reversible-disulfide-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K Görüntüleme.  University of California, Davis. To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Video: A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Examining Proteasome Assembly with Recombinant Archaeal Proteasomes and Nondenaturing PAGE:  The Case for a Combined Approach

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is not completely understood. All proteasomes contain a structurally conserved core particle (CP), or 20S proteasome, containing two heptameric&#160;&#946; subunit rings sandwiched between two heptameric&#160;&#945; subunit rings. Archaeal 20S proteasomes are compositionally simpler compared to their eukaryotic counterparts, yet they both share a common assembly mechanism. Consequently, archaeal 20S proteasomes continue to be important models for eukaryotic proteasome assembly. Specifically, recombinant expression of archaeal 20S proteasomes coupled with nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) has yielded many important insights into proteasome biogenesis. Here, we discuss a means to improve upon the usual strategy of coexpression of archaeal proteasome &#945; and &#946; subunits prior to nondenaturing PAGE. We demonstrate that although rapid and efficient, a coexpression approach alone can miss key assembly intermediates. In the case of the proteasome, coexpression may not allow detection of the half-proteasome, an intermediate containing one complete &#945;-ring and one complete &#946;-ring. However, this intermediate is readily detected via lysate mixing. We suggest that combining coexpression with lysate mixing yields an approach that is more thorough in analyzing assembly, yet remains labor nonintensive. This approach may be useful for the study of other recombinant multiprotein complexes.

This protocol uses both subunit coexpression and postlysis subunit mixing for a more thorough examination of recombinant proteasome assembly.

Rekombinant Archaeal proteazomlar ve Nondenaturing PAGE ile Proteozom Meclisi İncelenmesi: Durum bir Kombine Yaklaşım

Proteasomes are found in all domains of life. They provide the major route of intracellular protein degradation in eukaryotes, though their assembly is ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as industrial materials. Gene expression profiles are powerful tools for investigating metabolic regulation in plant cells. Therefore, detailed, accurate gene expression profiles during seed development are required for crop breeding. Acquiring highly purified RNA is essential for producing these profiles. Efficient methods are needed to isolate highly purified RNA from seeds. Here, we describe a method for isolating RNA from seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method enables highly purified RNA to be obtained from seeds without the use of phenol, chloroform, or additional processes for RNA purification. This method is applicable to Arabidopsis, rapeseed, and soybean seeds. Our method will be useful for monitoring the expression patterns of low level transcripts in developing and mature seeds.

We have succeeded in establishing a method for RNA isolation from plant seeds containing large amounts of oils, proteins, and polyphenols, which have inhibitory effects on high-purity RNA isolation. Our method is suitable for monitoring the expression of genes with low level transcripts in seeds.

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

Laboratuar ölçekli üretim ve terapötik bir antikor ile saflaştırılması

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall process costs. Alternative, cost-effective capture steps are therefore valuable for industrial-scale manufacturing, where large quantities of a single mAb are produced. Here we present a method for the immobilization of a DsRed-based epitope ligand to a cross-linked agarose resin allowing the selective capture of the HIV-neutralizing antibody 2F5 from crude plant extracts without using Protein A. The linear epitope ELDKWA was first genetically fused to the fluorescent protein DsRed and the fusion protein was expressed in transgenic tobacco (Nicotiana tabacum) plants before purification by immobilized metal-ion affinity chromatography. Furthermore, a method based on activated cross-linked agarose was optimized for high ligand density, efficient coupling and low costs. The pH and buffer composition and the soluble ligand concentration were the most important parameters during the coupling procedure, which was improved using a design-of-experiments approach. The resulting affinity resin was tested for its ability to selectively bind the target mAb in a crude plant extract and the elution buffer was optimized for high mAb recovery, product activity and affinity resin stability. The method can easily be adapted to other antibodies with linear epitopes. The new resins allow gentler elution conditions than Protein A and could also reduce the costs of an initial capture step for mAb production.

In this procedure, a DsRed-based epitope ligand is immobilized to produce a highly selective affinity resin for the capture of monoclonal antibodies from crude plant extracts or cell culture supernatants, as an alternative to Protein A.

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme