The authors thank Ms.Alisha Knudson for the editorial help. They would also like to acknowledge the financial support from the NIH/NCI (3R01CA115483, to K.S.L.), the DoD PRMRP Award (W81XWH-13-1-0490, to K.S.L.), the NIH/NCI (1R01CA199668, to Y.L.), and the NIH/NICHD (1R01HD086195, to Y.L.).

Etik ifadesi: Dişi atimik çıplak fareler (Nu / Nu suşu), 6-8 haftalık, satın alınan ve AAALAC yönergelerine göre patojensiz şartlar altında tutulur ve herhangi bir deney öncesinde en az 4 gün boyunca ortama alışmaları sağlandı edildi. Tüm hayvan deneyleri kurumsal kurallarına uygun olarak gerçekleştirilir ve California, Davis Üniversitesi&#39;nde Hayvan Kullanım ve Bakım Yönetim Danışma Kurulu tarafından onaylanan protokol sayılı 07-13119 ve sayılı 09-15584 göre edildi. TD PEG 5K Cys 1. sentezi 4 -Ebes 8 -CA 8 <ol><li> Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde, buz üzerinde, susuz dimetilformamid (DMF) ve soğuk 10-20 ml MeO-PEG 5K -NH 2 (2 g, 0.4 mmol) çözülür. </li><li> Bir cam kabın içinde, 3 eşdeğer çözülür. 1-hidroksi-6-kloro-benzotriazol (HOBt), 3 eşd. N, N &#39;diizopropilkarbodiimid (DIC) ve 3 eşdeğer. Susuz D içinde (Fmoc) 2 Lys-OH,MF (10-15 mi). Manyetik bir karıştırma plakası üzerinde 15-20 dakika karıştırılır. </li><li> MeO-PEG 5K -NH 2. buz banyosu alınır ve oda sıcaklığında gece boyunca, reaksiyon karışımı karıştırıldı içeren reaksiyon balonuna karışımı ekleyin. </li><li> Ince tabaka kromatografisi (TLC) 16 ve Kaiser testi 17, reaksiyonun tamamlandığını teyit (san renkli serbest NH2 olmadığını gösterir). Reaksiyon şişesine buz soğukluğunda eter 200 ml ekleyerek polimer ürün 1 (MeO-PEG 5K -Lys (nH-Fmoc) 2) çökelmesi. santrifüj yoluyla çöktürülmüş polimer (6 6,000 xg&#39;de dk ve 4 ° C) ayırın. <ol><li> TLC gerçekleştirmek için, silika jel ile kaplanmış TLC plakaları ile ilgili örnekleri nokta. diklorometan / metanol kullanarak (9: 1) mobil faz olarak. TLC plakaları gelişmekte sonra UV lamba altında noktalar dikkate alınmalıdır. Bir de sıcak bir plaka üzerinde amin noktalar görselleştirmek için boyama reaktif ninhidrin kullanabilirsiniz. </li><li> Kaiser test, Kaiser reaktifi içeren cam tüp numune biraz yerleştirin. 5 dakika boyunca 100 ° C&#39;de ısı ve renk değişimi (çözeltinin rengi san kalırsa, daha sonra reaksiyon tamamlandı) arayın. </li></ol></li><li> Susuz DMF (10-20 mL) içinde bir ürün yeniden çözülür ve çöktürme ve santrifüjleme (adım 1.4) tekrar edin. </li><li> daha sonra tekrar adım 1.5 ve buz soğukluğunda eter ile polimerin çökeltilmesi üç kez yıkayın. </li><li> Temiz bir tepkime şişesine, polimer çökelti 1 transferi ve kalıntı eter uzaklaştırılmış yüksek vakum kaynağına şişesi bağlayın. </li><li> Hazırlama ve% 20, yaklaşık 20-30 ml ekleyin (h / h) DMF içinde 4-metil-piperidin 1 ara polimer için. Tam çözünme gerçekleşene kadar karıştırılır. 3 saat reaksiyondan. </li><li> TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar) 17 (adım 1.4) completio onaylamak içinReaksiyonun n. Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış geçin. </li><li> Polimer ürünü 2 (MeO-PEG 5K-Lys (NH2) 2), bir vakum altında kurutulur. </li><li> (1.1-1.7 adımlar) ürünü 3 oluşturmak için ara 2 üzerine (Fmoc) 2 Lys-OH-kavrama bir tur daha yürütmek (MeO-PEG 5K Lys (Lys (NH-Fmoc) 2) 2). (1.8-1.10 adım) Fmoc grupları (4, MeO-PEG 5K-Lys (Lys (NH2) 2) 2) ve bir çift (Fmoc) Lys (Boc) (1.1-1.7 adım) -OH de korumak üçüncü nesil dendritik polilisin oluşturur (5, MeO-PEG 5k -Lys-Lys 2 - ((Fmoc) Lys (Boc)) 4) PEG zincirinin bir ucunda dört Boc ve Fmoc grubu ile sona erdirildi. </li><li> Bir reaksiyon şişesine, ara elde edilen polimeri 5 aktarın. olarakdiklorometan (DCM), 1 (h / h) trifloroasetik asit (TFA): eparate Reaksiyon şişesi, 1 hazırlayın. Polimer 5, ara 1 TFA / DCM (h / h) karışımı bir 1: 15-20 ml ilave edilir. Polimer tamamen eriyene kadar karışım karıştırılır. ilave bir 3 saat daha karıştırılır. </li><li> TLC 16 gerçekleştirin ve Kaiser testi reaksiyonun tamamlandığını teyit etmek için 17 (adım 1.4) (mavi renk ücretsiz NH 2 varlığını onaylar). Reaksiyon tamamlandıktan Bir zor akışlı bir çözelti elde edilene kadar hava ile polimerin in TFA / DCM karışımı buharlaşır. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için belirtildiği gibi, eter yağış devam edin. Vakum altında - (((Fmoc) Lys (NH2)) 4 -Lys-Lys 2 MeO-PEG 5k) polimerik ürünün 6 kurutun. </li><li> Bir tepkime şişesi içine 6 ara transfer polimeri. 8 eşdeğer ihtiva eden susuz DMF yaklaşık 40 ml kullanın. N, N--diisopropylethylamiNE (DIEA) polimeri 6 ara madde çözülmesi için. Bir cam kabın içinde, 12 eşdeğer çözülür. HOBt, 12 eşd. DIC, 12 eşd. susuz DMF 20-25 ml arasında (Fmoc) Cys (Trt) -OH. 10-15 dakika boyunca sallayın ve 6 içeren reaksiyon balonuna Reaksiyon karışımı ekleyin. Gecede reaksiyonu çalıştırın. </li><li> TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. ((Fmoc) Lys - - ((Fmoc) Cys Reaksiyon tamamlandıktan halinde ürün 1 (adım 1.4-1.6) için tarif edilen şekilde, ürün 7 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys 2 izole etmek için, eter çökelmeye devam (Trt))) 4. </li><li> Ürünü 8 elde etmek için, adım 1.8&#39;de de belirtildiği gibi, on 7 Fmoc de-koruma gerçekleştirin (- (Lys (NH 2) - PEG 5K Lys-Lys 2 (Cys (NH 2) (Trt))) 4). Çift (Fmoc) -PEG 2 -Suc-OH ( &quot;Ebes&quot; bağlayıcı, 24 eşi.), Bir HOBt için yukarıda belirtilen prosedür kullanılarak ara polimer / DIC aracılı bağlanma ile ilgili ara madde 9 (MeO-PEG 5K -Lys-Lys-Lys 2 4 elde etmek için - (Cys (trt) ) 4 (Ebes (NH-Fmoc)) 8). </li><li> Ara 10 almak için Fmoc de koruma bir tur daha (1.6-1.8 adımlar) gerçekleştirin (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 - (Cys (Trt)) 4 (Ebes (NH 2)) 8). </li><li> Bir tepkime şişesi içine polimerin ara madde 10 aktarılır ve çözünmesi susuz DMF (yaklaşık 30-40 mi) ilave edin. Başka bir reaksiyon şişesine ise 24 eşdeğer çözülür. Susuz DMF (daha önce yayınlanmış prosedüre göre hazırlandı) CAOSu (20-30 mi), 18. 48 eşdeğer ekleyin. ve N, N-diizopropiletilamin ve 10-15 dakika boyunca karışmaya bırakıldı. 10 içeren reaksiyon balonuna içine içeriğini aktarın ve reaksiyon çalıştırmak o izinvernight. </li><li> TLC 16 ve Kaiser testi ile reaksiyonun tamamlandığını teyit (adım 1.4 bkz sarı bir renk bilgilerini NH2 olmadığını gösterir) 17. (Cys (Trt)) 4 -Ebes - Reaksiyon tamamlandıktan ise ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) ürünü 11 izole etmek (MeO-PEG 5K Lys-Lys 2 Lys 4 belirtildiği gibi, eter yağış devam 8 -CA 8). de-iyonize su içinde diyaliz ve beyaz bir toz elde etmek için örnek liyofilize. </li><li> Bir tepkime şişesi içine, ara polimerin 11 yerleştirin. Hazırlama ve polimer çözeltisi içine, TFA / 1,2-etanditiol (EDT) / trietilsilan (TIS) 20 ml / H2O (94 / 2.5 / 1 / 2.5, v / v) karışımı ekleyin. Tam çözünme gerçekleşene kadar karışım karıştırılır. 4 saat reaksiyondan. TLC 16 ile reaksiyonun tamamlandığını onaylayın. </li><li> Davlumbaz altında, içine hava üflemek polimer-TFA / EDT / TIS / H 2çözelti kadar Ç karışımı viskoz hale gelir. Ürünün 1 (1.4-1.6 adımlar) için tarif edilen şekilde nihai ürün, 12 (PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8) izole etmek için, eter çökeltme geçin. asetonitril içinde çözülür ve beyaz bir toz elde etmek için bu liyofilize edin. </li></ol> PTX-yüklü misellerin 2. Hazırlık <ol><li> Standart buharlaştırma yöntemi kullanılarak bir PTX yüklü PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 misel hazırlayın. <ol><li> Kloroform, 1 ml (CHCI3) &#39;de PTX farklı bir miktarda (1-9 mg) ile TD 20 mg eritin. Homojen kuru polimer film elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücüyü çıkarın. gerektiğinde ilaç yüklü misellerin oluşumunu sağlamak için, 40 kHz, 30 dakika süreyle sese tabi tutularak ve ardından girdap fosfat-tamponlu salin (PBS) ile 1 ml film sulandırın. </li><li> % 3 (a / a) H2O 2 (1 eşdeğer 6 ul ekle. FRTD&#39;de tiol grupları oksitleyebileceğini) tiyol gruplar ee. Ellman testi 19 ile gösterildiği gibi serbest tiol gruplarının seviyesi, sabit bir düşük değerli kalır kez daha fazla karakterizasyon için misel solüsyonu kullanın. </li><li> örnek sterilize etmek için 0.22 mikron filtre ile çözüm Filtre. 9 kez asetonitril eklenmesi ve sonikasyon 10 dakika gerçekleştirerek miseller uyuşturucu serbest bıraktıktan sonra, bir HPLC sistemine 20 miseller yüklenen ilaç miktarını analiz edin. mobil faz olarak asetonitril / su ile HPLC için bir C18 sütunu kullanın. </li><li> HPLC alan değerleri ve 11, standart ilaç konsantrasyonları arasındaki kalibrasyon eğrisine göre ilaç yüklemesine hesaplayın. NOT: yükleme verimliliği ilk ilaç içeriğine miseller yüklenen ilaç oranı olarak tanımlanır. </li></ol></li></ol> Misellerin 3. Karakterizasyonu <ol><li> m büyüklüğü ve büyüklük dağılımını ölçmekdinamik ışık saçılımı (DLS) alet 29 icelles. oda sıcaklığında ölçümleri gerçekleştirmek ve 1 mg / ml olarak misel konsantrasyonu tutun. NOT: parçacık boyut analizi gerçekleştirmek boş olarak PBS kullanın ve sonra gerçek örnekler için partikül büyüklüğü kaydetmek için. numuneler için üç nüsha olarak okumaları alın ve sonra okumaları ortalama. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 13,21, ABD Doları, önce ve bir hidrofobik flüoresan sonda olarak piren ile çapraz bağlama sonra, PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kritik misel konsantrasyonu (CMC) ölçmek için floresan spektrumu kullanın. NOT: Genellikle, misel konsantrasyonu 5 × 10 -7 5 × 10 -4 M. aralıkları </li></ol> ya da indirgeme maddeleri, SDS misellerin 4. Stabilite <ol><li> sodyum dodesil sülfat stok çözeltileri (SDS) çözeltisi (7.5 mg / ml) ve PBS içinde disülfid çapraz bağlı miseller (1.5 mg / ml) hazırlayın. Daha sonra, uNihai SDS konsantrasyonu olan bir çözelti karışımı yapmak stok solüsyonları şarkı 2.5 mg / ml ve misel konsantrasyonu 1.0 mg / ml olan. </li><li> ile ya da 10 mM glutatyon (GSH) varlığı olmadan önceden belirlenen zaman aralıklarında misel çözeltilerinin (adım 3.1 belirtildiği gibi) boyutu ve boyut dağılımı ölçülür. </li></ol> 5. Hemoliz tayininde <ol><li> Toplanan daha önce yayınlanmış prosedür 11 ve çıplak farelerde taze sitratlı kan kullanılarak PTX yüklü çapraz bağlı miseller (PTX-DCMs) göre hazırlandı PTX yüklü olmayan çapraz bağlı miseller (PTX-NCMs) hemolitik potansiyelini değerlendirir kuyruk peçe. <ol><li> % 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona PBS ile hücre pelletleri yeniden askıya daha sonra, 10 dakika boyunca 1000 x g&#39;de kan numunesi (1.0 mi) bir santrifüj ile kırmızı kan hücreleri toplamak PBS ile uygun üç kez yıkayın ve. </li></ol></li><li> Farklı konsantrasyonlarda (0.2 ve 1.0 ile birlikte eritrosit süspansiyonu 200 ul karıştırınmg PTX-NCMs ve PTX-DCMS, / ml), sırasıyla, bir kuluçka çalkalayıcı içinde 37 ° C&#39;de 4 saat inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca 3.000 xg&#39;de misel-eritrosit karışımları santrifüj. 96 oyuklu bir plakaya her numunenin süpernatant 100 ul aktarın. Bir mikro-plaka okuyucusu kullanmak sureti ile 540 nm de üstte yüzen madde içindeki serbest hemoglobin absorbansı ölçülür. Not: Triton-100 (% 2) ve PBS ile inkübe eritrositler sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak kullanılacak. RBCs yüzde hemoliz aşağıdaki formülle hesaplanır: RBC hemoliz = (OD örneği - OD negatif kontrol) / (OD pozitif kontrol - OD negatif kontrol)% 100 ×. </li></ol>

<ol>
	<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+in+medicine:+therapeutic+applications+and+developments.">Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 761-769 (2008).</li><li>Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+Delivery+of+Cancer+Drugs.">Nanoparticle Delivery of Cancer Drugs.</a> Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).</li><li>Iyer, A. K., Khaled, G., Fang, J., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+enhanced+permeability+and+retention+effect+for+tumor+targeting.">Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting.</a> Drug Disc. Today Targets. 11, 812-818 (2006).</li><li>Morachis, J. M., Mahmoud, E. A., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+and+chemical+strategies+for+therapeutic+delivery+by+using+polymeric+nanoparticles.">Physical and chemical strategies for therapeutic delivery by using polymeric nanoparticles.</a> Pharmacol. Rev. 64, 505-519 (2012).</li><li>Kamaly, N., Xiao, Z., Valencia, P. M., Radovic-Moreno, A. F., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+polymeric+therapeutic+nanoparticles:+design,+development+and+clinical+translation.">Targeted polymeric therapeutic nanoparticles: design, development and clinical translation.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 2971-3010 (2012).</li><li>Li, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversibly+stabilized+multifunctional+dextran+nanoparticles+efficiently+deliver+doxorubicin+into+the+nuclei+of+cancer+cells.">Reversibly stabilized multifunctional dextran nanoparticles efficiently deliver doxorubicin into the nuclei of cancer cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 48, 9914-9918 (2009).</li><li>Miyata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Block+catiomer+polyplexes+with+regulated+densities+of+charge+and+disulfide+cross-linking+directed+to+enhance+gene+expression.">Block catiomer polyplexes with regulated densities of charge and disulfide cross-linking directed to enhance gene expression.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 2355-2361 (2004).</li><li>Chan, Y., Wong, T., Byrne, F., Kavallaris, M., Bulmus, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acid-labile+core+cross-linked+micelles+for+pH-triggered+release+of+antitumor+drugs.">Acid-labile core cross-linked micelles for pH-triggered release of antitumor drugs.</a> Biomacromolecules. 9, 1826-1836 (2008).</li><li>Rijcken, C. J., Snel, C. J., Schiffelers, R. M., van Nostrum, C. F., Hennink, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysable+core-crosslinked+thermosensitive+polymeric+micelles:+synthesis,+characterisation+and+in+vivo+studies.">Hydrolysable core-crosslinked thermosensitive polymeric micelles: synthesis, characterisation and in vivo studies.</a> Biomaterials. 28, 5581-5593 (2007).</li><li>Talelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-crosslinked+polymeric+micelles+with+controlled+release+of+covalently+entrapped+doxorubicin.">Core-crosslinked polymeric micelles with controlled release of covalently entrapped doxorubicin.</a> Biomaterials. 31, 7797-7804 (2010).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+self-assembling+nanoparticle+for+paclitaxel+delivery+in+ovarian+cancer.">A self-assembling nanoparticle for paclitaxel delivery in ovarian cancer.</a> Biomaterials. 30, 6006-6016 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+size-tunable+nanocarrier+system+for+targeted+anticancer+drug+delivery.">A novel size-tunable nanocarrier system for targeted anticancer drug delivery.</a> J. Control. Release. 144, 314-323 (2010).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+disulfide+cross-linked+micelles+for+on-demand+paclitaxel+delivery.">Well-defined, reversible disulfide cross-linked micelles for on-demand paclitaxel delivery.</a> Biomaterials. 32, 6633-6645 (2011).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined,+reversible+boronate+crosslinked+nanocarriers+for+targeted+drug+delivery+in+response+to+acidic+pH+values+and+cis-diols.">Well-defined, reversible boronate crosslinked nanocarriers for targeted drug delivery in response to acidic pH values and cis-diols.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 2864-2869 (2012).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+smart+and+versatile+theranostic+nanomedicine+platform+based+on+nanoporphyrin.">A smart and versatile theranostic nanomedicine platform based on nanoporphyrin.</a> Nat. Commun. 5, (2014).</li><li>Belenki, B. G., Gankina, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-Layer+chromatography+of+polymers.">Thin-Layer chromatography of polymers.</a> J. Chromatogr. A. 141, 13-90 (1977).</li><li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides.">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li><li>Pandey, P. S., Rai, R., Singh, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cholic+acid-based+molecular+receptors:+head-to-head+cholaphanes.">Synthesis of cholic acid-based molecular receptors: head-to-head cholaphanes.</a> J. Chem. Soc., Perkin Trans 1. , 918-923 (2002).</li><li>Riddles, P. W., Blakeley, R. L., Zerner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassessment+of+Ellman's+reagent.">Reassessment of Ellman's reagent.</a> Methods Enzymol. 91, 49-60 (1983).</li><li>Ahuja, S., Rasmussen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+HPLC+method+development+for+pharmaceuticals.">Overview of HPLC method development for pharmaceuticals.</a> HPLC Method Development for Pharmaceuticals. , 1-11 (2007).</li><li>Li, Y., Pan, S., Zhang, W., Du, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+thermo-sensitive+core-shell+nanoparticles+for+targeted+paclitaxel+delivery.">Novel thermo-sensitive core-shell nanoparticles for targeted paclitaxel delivery.</a> Nanotechnology. 20 (6), 065104 (2009).</li><li>Kato, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide+cross-linked+micelles+for+the+targeted+delivery+of+vincristine+to+B-cell+lymphoma.">Disulfide cross-linked micelles for the targeted delivery of vincristine to B-cell lymphoma.</a> Mol. Pharm. 9, 1727-1735 (2012).</li><li>Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glutathione+synthesis.">Regulation of glutathione synthesis.</a> Mol. Aspects Med. 30, 42-59 (2009).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="OA02"+peptide+facilitates+the+precise+targeting+of+paclitaxel-loaded+micellar+nanoparticles+to+ovarian+cancer+in+vivo.">"OA02" peptide facilitates the precise targeting of paclitaxel-loaded micellar nanoparticles to ovarian cancer in vivo.</a> Cancer Res. 72, 2100-2110 (2012).</li><li>Koo, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disulfide-cross-linked+PEG-poly(amino+acid)s+copolymer+micelles+for+glutathione-mediated+intracellular+drug+delivery.">Disulfide-cross-linked PEG-poly(amino acid)s copolymer micelles for glutathione-mediated intracellular drug delivery.</a> Chem. Commun. 28, 6570-6572 (2008).</li><li>McLellan, L. I., Wolf, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+and+glutathione-dependent+enzymes+in+cancer+drug+resistance.">Glutathione and glutathione-dependent enzymes in cancer drug resistance.</a> Drug. Resist. Update. 2, 153-164 (1999).</li><li>Karala, A. R., Lappi, A. K., Saaranen, M. J., Ruddock, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+peroxide-mediated+oxidative+refolding+of+a+protein+at+physiological+pH+and+implications+for+oxidative+folding+in+the+endoplasmic+reticulum.">Efficient peroxide-mediated oxidative refolding of a protein at physiological pH and implications for oxidative folding in the endoplasmic reticulum.</a> Antioxid. Redox Signal. 11, 963-970 (2009).</li><li>Gabizon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+nanomedicines:+closing+the+translational+gap.">Cancer nanomedicines: closing the translational gap.</a> Lancet. 384, 2175-2176 (2014).</li></ol>

Y. Li and K.S.L. are the inventors of a pending patent on reversibly crosslinked micelle systems (US patent application 61/485,774). K.S.L. is the founding scientist of LamnoTherapeutics Inc., which plans to develop the nanotherapeutics described in the manuscript. The remaining authors declare no competing financial interests.

Çeşitli nanopartiküller ilaç iletiminde potansiyel kullanım için incelenmiştir. Lipozomal doksorubisin ve paklitaksel (PTX) insan serum albümin nano-agrega kanser tedavisi için FDA tarafından onaylanmış nanotherapeutics arasındadır -yüklü. klinik olarak etkili olmasına rağmen, ancak, bu nanotherapeutics iki boyut açısmdan göreceli olarak &quot;büyük&quot;, ve karaciğer ve akciğer birikme eğilimindedir. nispeten daha küçük partikül boyutları ve daha yüksek ilaç yükü kapasitesine sahip p...

Nanoteknoloji biyomedikal alanlarda 1 bir dizi yararlandı hızlı gelişen bir alandır. Nanopartiküller geleneksel terapötik diğer türleri ile mümkün değildir özellikleri tasarımı ve ayarlama için fırsatlar sağlar. Nano taşıyıcılar, ilaç dolaşım süresini uzatmak, biyolojik ayrışma karşı ilaçların istikrarı geliştirmek ilaç çözünürlüğü sorunları aşmak ve ince ayarlı hedefli ilaç dağıtım ve ko-teslim görüntüleme maddeleri 1,2 için olabilir. Nanopartikül bazlı verme sistemleri Kanser görüntüleme ve tedavisi ümit vaat etmektedir. Tümör vaskülatürlerden makromoleküllere sızan ve gelişmiş geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisi 3 ile, tümör bölgelerinde nano-tanecikleri, dolaşımdaki birikmesidir yol açabilir. Aktif bir anti-kanser ilaç taşıyıcılar olarak izlenmektedir birçok nano taşıyıcı (örneğin, lipozomlar, hidrojeller ve polimerik misel) arasında, bir polimerik miseller th geniş bir popülarite kazanmışe son on 4,5. Polimerik miseller, intravenöz uygulama ile ilgili potansiyel unimers içine ayrışma yol kritik misel konsantrasyonu (CMC) altına seyreltilebilen bir termodinamik sistemdir. Çapraz bağlanma stratejileri unimers içine misel ayrışmasını en aza indirmek için istihdam edilmiştir. Ancak, aşırı stabilize miseller böylece genel terapötik etkinlik azaltarak, hedef bölgelerde bırakmadan gelen ilaç engelleyebilir. Çeşitli kimyasal yaklaşımlar yapmak için araştırılmıştır çapraz bağlama redoks yanıt olarak ya da indirgenebilir disülfid bağlarının 6,7 ve pH-parçalanabilen 8 veya hidrolize ester bağları 9,10 olarak dış uyaranlara, için parçalanabilir. Daha önce telodendrimers (TD) olarak adlandırılır tasarım ve dendritik kolik asit (CA) blok ve doğrusal polietilen glikol (PEG) kopolimerleri, aşağıdakilerden oluşan misel nanopartiküllerin sentezi 11-15 bildirmiştir </&gt; Sup. Bu TDS (n = molekül ağırlığı kilodalton (K) Y, kolik asit sayısını (CA) birimleri =), PEG nK -CAy olarak temsil edilir. Bunlar hidrofobik çekirdekte paklitaksel (PTX) ile doksorubisin (DOX) halinde kapsül ilaç küçük olmaları, uzun bir raf ömrü ve yüksek verimlilik ile karakterize edilir. PEG, lisin, ve CA gibi TD yapı blokları, biyolojik olarak uyumlu olan, ve bir PEG korona varlığı retiküloendotelyal sistemleri tarafından misel nanopartiküllerin spesifik olmayan soğurulma engelleyen bir &quot;gizli&quot; Nanopartikül karakteri kazandırabilmektedir. Tiollenmiş doğrusal dendritik polimerler kolaylıkla standart TDS dendritik oligo-lisin omurgasına sistein sokulmasıyla üretilebilir. Bu makalede, TDS hidrofobik çekirdeğin içine disülfit çapraz bağlantı (Şekil 1) verilmesi ile tersine çevrilebilir çapraz bağlanmış miselar ilaç verme sistemi üretimi için, basit bir protokol sunulur.

<table><tbody><tr><td>MeO-PEG&lt;sup&gt;5K&lt;/sup&gt;-NH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Rapp Polymere</td><td>125000-2</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Fmoc)-OH</td><td>Aaptec</td><td>AFK107</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Anaspec</td><td>AS-20132</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Aapptec</td><td>AAC105</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1160-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Diisopropylethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125806</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td>Corrosive, handle with care</td></tr><tr><td>4-methyl piperidine</td><td>Alfa-Aesar</td><td>L-02709</td><td></td></tr><tr><td>Ebes linker</td><td>Anaspec</td><td>AS-61924</td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1129</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02390</td><td>Handle inside fume hood. Bleach gloves after usage.</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (anhydrous)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution 30%</td><td>Aaron Industries</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HoBt-Cl</td><td>Aaptec</td><td>CXZ096</td><td></td></tr><tr><td>DIC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D125407</td><td></td></tr><tr><td>Female athymic nude mice (Nu/Nu strain), 6&amp;ndash;8 weeks age</td><td>Harlan (Livermore, CA)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a facile and efficient approach for the production of reversible disulfide cross-linked micelles

Nanotıp biyomedikal uygulama için ölçek nanometre parçacıkların eşsiz özelliklerini sürdürür terapi yükselen bir şeklidir. Tedavi sonuçları maksimize etmek ve ilaç ilişkili yan etkileri azaltmak için ilaç dağıtım geliştirilmesi bugünkü Nanotıp taşlarından bazılarıdır. Özellikle nanopartiküller kanser tedavisinde geniş bir kullanım alanı bulmuştur. tasarım, uygulama ve tümör mikro dayalı üretimde esneklik yüksek derecesi Nanoparçacıklar klinik uygulamaya hızlı çeviri daha etkili olduğu tahmin edilmektedir. polimerik misel nano taşıyıcı ilaç verme uygulamaları için popüler bir seçimdir. Bu makalede, iyi tanımlanmış bir amfifilik lineer dendritik kopolimer (telodendrimer, TD) kendini düzenlemesinden göre ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller sentezlenmesi için basit ve etkili bir protokol açıklar. TD polietilen gl oluşurHidrofilik segmenti ve çözelti esaslı peptid kimyası kullanılarak bir amin ile sona eren PEG çekirdek oluşturucu hidrofobik yarı parça eklenmiş adım adım bir Tiollenmiş kolik asit küme olarak ycol (PEG). Böyle paklitaksel (PTX) olarak kemoterapi ilaçları, standart bir çözücü buharlaştırma yöntemi kullanılarak yüklenebilir. O 2 aracılı oksidasyon önce TDS ile ilgili serbest tiyol grupları içi misel disülfit çapraz bağlantı oluşturulması için kullanılmıştır. Bununla birlikte, reaksiyon yavaş ve büyük ölçekli üretim için uygun değildi. Son zamanlarda, bir H 2 O 2 aracılı oksidasyon yöntemi daha uygun ve verimli bir yaklaşım olarak araştırılan ve 96 kat daha hızlı daha önce bildirilen yönteme göre daha oldu. Bu yaklaşımı kullanarak, PTX-yüklü, disülfid çapraz bağlanmış nanopartiküller 50 g başarılı dar parçacık boyutu dağılımı ve yüksek ilaç yüklemeli verimle imal edilmiştir. Elde edilen misel çözeltisi stabilitesi örneğin W birlikte kuluçkaya olarak kesintiye koşullar kullanılarak çözümlendiya da indirgeyici bir madde olmayan bir deterjan, sodyum dodesil sülfat, i. bunların olmayan çapraz bağlı karşılıkları ile karşılaştırıldığında ilaç yüklü, disülfid çapraz bağlanmış miseller az hemolitik aktivite göstermiştir.

İlaç yüklü disülfid Çapraz bağlanmış misellerin hazırlanışı ve Karakterizasyonu Amfifilik polimerin PEG 5K Cys 4 -Ebes 8 -CA 8 kanser ilaç dağıtımı için bir disülfid çapraz bağlanmış miselar sistemi oluşturabilen bir dendritik polimerdir. Yapısal olarak, bu dallı bir poli (lisin-sisteyin-Ebes) omurgası boyunca doğrusal bir PEG molekülünün (hidrofilik etki, molekül a?...

Watch this Scientific Journal Video about A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles at JoVE.com

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

a-facile-efficient-approach-for-production-reversible-disulfide-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.8K Görüntüleme.  University of California, Davis. To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Video: A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Physical interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane protein complexes and in dynamic processes such as transmembrane (TM) signaling and regulation of cell-surface protein levels. Understanding the structural features driving the association of particular sequences requires sophisticated biophysical and biochemical analyses of TM peptide complexes. However, the extreme hydrophobicity of TM domains makes them very difficult to manipulate using standard peptide chemistry techniques, and production of suitable study material often proves prohibitively challenging. Identifying conditions under which peptides can adopt stable helical conformations and form complexes spontaneously adds a further level of difficulty. Here we present a procedure for the production of homo- or hetero-dimeric TM peptide complexes from materials that are expressed in E. coli, thus allowing incorporation of stable isotope labels for nuclear magnetic resonance (NMR) or non-natural amino acids for other applications relatively inexpensively. The key innovation in this method is that TM complexes are produced and purified as covalently associated (disulfide-crosslinked) assemblies that can form stable, stoichiometric and homogeneous structures when reconstituted into detergent, lipid or other membrane-mimetic materials. We also present carefully optimized procedures for expression and purification that are equally applicable whether producing single TM domains or crosslinked complexes and provide advice for adapting these methods to new TM sequences.

Biophysical and biochemical studies of interactions among membrane-embedded protein domains face many technical challenges, the first of which is obtaining appropriate study material. This article describes a protocol for producing and purifying disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes that are suitable for structural analysis by solution nuclear magnetic resonance (NMR) and other analytical applications.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Kimya

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins with the synthesis of a hydrophilic poly(oligo(ethylene glycol) methyl ether methacrylate) (POEGMA) homopolymer using reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization. Under mild visible light irradiation (&#955; = 460 nm, 0.7 mW/cm2), this macro-chain transfer agent (macro-CTA) in the presence of a ruthenium based photoredox catalyst, Ru(bpy)3Cl2 can be chain extended with a second monomer to form a well-defined block copolymer in a process known as Photoinduced Electron Transfer RAFT (PET-RAFT). When PET-RAFT is used to chain extend POEGMA with benzyl methacrylate (BzMA) in ethanol (EtOH), polymeric nanoparticles with different morphologies are formed in situ according to a polymerization-induced self-assembly (PISA) mechanism. Self-assembly into nanoparticles presenting POEGMA chains at the corona and poly(benzyl methacrylate) (PBzMA) chains in the core occurs in situ due to the growing insolubility of the PBzMA block in ethanol. Interestingly, the formation of highly pure worm-like micelles can be readily monitored by observing the onset of a highly viscous gel in situ due to nanoparticle entanglements occurring during the polymerization. This process thereby allows for a more reproducible synthesis of worm-like micelles simply by monitoring the solution viscosity during the course of the polymerization. In addition, the light stimulus can be intermittently applied in an ON/OFF manner demonstrating temporal control over the nanoparticle morphology.

This article describes a process for producing polymeric self-assembled nanoparticles using visible light mediated dispersion polymerization. Using low energy visible light to control the polymerization allows for the reproducible formation of self-assembled worm-like micelles at high solids content.

Photoredox Katalizörü kullanarak görünür ışık aracılığı ile dispersiyon polimerleştirilmesi ile solucan gibi miseller Facile sentezi

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Fabrication of Spherical and Worm-shaped Micellar Nanocrystals by Combining Electrospray, Self-assembly, and Solvent-based Structure Control

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of fabricating micellar nanocrystals based on combining top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. This method involves first using electrospray to generate uniform ultrafine liquid droplets, each of which functions as a micro-reactor in which self-assembly reaction occurs forming micellar nanocrystals, with the structures (micelle shape and nanocrystal encapsulation) controlled by the organic solvent used. This method is largely continuous and produces high quality micellar nanocrystal products with an inexpensive structure control approach. By using a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF), worm-shaped micellar nanocrystals can be produced due to solvent-induced/facilitated micelle fusion. Compared with the common spherical micellar nanocrystals, worm-shaped micellar nanocrystals can offer minimized non-specific cellular uptake, thus enhancing biological targeting. By co-encapsulating multiple nanocrystals into each micelle, multifunctional or synergistic effects can be achieved. Current limitations of this fabrication method, which will be part of the future work, primarily include imperfect encapsulation in the micellar nanocrystal product and the incompletely continuous nature of the process.

The present work describes a method to fabricate micellar nanocrystals, an emerging major class of nanobiomaterials. This method combines top-down electrospray, bottom-up self-assembly, and solvent-based structure control. The fabrication method is largely continuous, can produce high quality products, and possesses an inexpensive means of structure control.

Küresel ve solucan şeklinde Micellar Nanocrystals Electrospray, kendinden montajlı birleştirerek ve Solvent Bazlı Yapı Denetim imalatı

Micellar nanocrystals (micelles with encapsulated nanocrystals) have become an emerging major class of nanobiomaterials. We describe a method of ...

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a post-translational modification. Thus, it is important to be able to study this modification in living cells. A simple method to analyze these cysteine-stabilized multimeric complexes is through a two-step method of non-reducing SDS-PAGE analysis and formaldehyde cross-linking. This two-step method is advantageous as the first step to uncovering multimeric complexes stabilized by disulfide linkages due to its technical ease and low cost of operation. Here, the human bone osteosarcoma cell line U-2 OS is used to illustrate this method by specifically analyzing the nuclear isoform of dUTPase.

Disulfide linkages have long been known to stabilize the structure of many proteins. A simple method to analyze multimeric complexes stabilized by these linkages is through non-reducing SDS-PAGE analysis. Here, this method is illustrated by analyzing the nuclear isoform of dUTPase from the human bone osteosarcoma cell line U-2 OS.

Kültürde memeliler hücrelerinde Disulfide bağlantıları ile stabilize Multimeric kompleksleri algılamak için non-azaltma SDS-sayfa analizi ve kimyasal Crosslinking birleştiren

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

Gelişim Biyolojisi

Synthesis of Monocyte-targeting Peptide Amphiphile Micelles for Imaging of Atherosclerosis

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. Atherosclerosis is also the leading cause of sudden death and myocardial infarction, instigated by unstable plaques that rupture and occlude the blood vessel without warning. Current imaging modalities cannot differentiate between stable and unstable plaques that rupture. Peptide amphiphiles micelles (PAMs) can overcome this drawback as they can be modified with a variety of targeting moieties that bind specifically to diseased tissue. Monocytes have been shown to be early markers of atherosclerosis, while large accumulation of monocytes is associated with plaques prone to rupture. Hence, nanoparticles that can target monocytes can be used to discriminate different stages of atherosclerosis. To that end, here, we describe a protocol for the preparation of monocyte-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs are self-assembled through synthesis under mild conditions to form nanoparticles of 15 nm in diameter with near neutral surface charge. In vitro, PAMs were found to be biocompatible and had a high binding affinity for monocytes. The methods described herein show promise for a wide range of applications in atherosclerosis as well as other inflammatory diseases.

This paper presents a method involving the synthesis and characterization of monocyte-targeting peptide amphiphile micelles and the corresponding assays to test for biocompatibility and ability of the micelle to bind to monocytes.

Monosit hedefleme peptid Amfifil Micelles için düşsel ateroskleroz sentezi

Atherosclerosis is a major contributor to cardiovascular disease, the leading cause of death worldwide, which claims 17.3 million lives annually. ...

Biyomühendislik

Synthesis of Stimuli-responsive Nanogels using Aqueous One-step Crosslinking and Co-nanopolymerization

Nanogels consisting of crosslinked-polymeric nanoparticles have been developed for the delivery of numerous chemical and biological therapeutics, owing to their versatile bottom-up synthesis and biocompatibility. While various methods have been employed for nanogel synthesis to date, very few have achieved it without the use of harsh organic solvents or high temperatures that can damage the integrity of the biological payload. In contrast, the methodology presented here accomplishes the synthesis of sub-100 nm sized, protein-loaded nanogels using mild reaction conditions. Here, we present a method for the non-covalent encapsulation of protein-based payloads within nano-gels that were synthesized using an aqueous-based, single-step, crosslinking copolymerization technique. In this technique, we initially electrostatically bind a protein-based payload to a cationic quaternary ammonium monomer and simultaneously cross-link and co-polymerize it using ammonium persulfate and N,N,N&#39;,N&#39;-tetramethylethylenediamine to form nanogels that entrap the protein payload. The size and polydispersity index of the nanogels is determined using dynamic light scattering (DLS), while the surface morphology is assessed by transmission electron microscopy (TEM). The mass of protein entrapped within nanogels is determined by calculating the encapsulation efficiency. Furthermore, the controlled-release ability of the nanogels via the gradual degradation of redox-responsive structural elements is also assessed in bioreduction assays. We provide examples of nanoparticle optimization data to demonstrate all caveats of nanogel synthesis and characterization using this technique. In general, uniformly sized nanogels were obtained with an average size of 57 nm and a polydispersity index value of 0.093. A high encapsulation efficiency of 76% was achieved. Furthermore, the nanogels exhibited controlled release of up to 86% of the encapsulated protein by gradual degradation of novel redox-responsive components in the presence of glutathione over 48 h.

Nanogels are an excellent and versatile nanoparticle platform for the delivery of biologics. Stimuli-responsive poly(ethylene) glycol-based polymeric nano-gels, capable of encapsulating protein-based payloads, were synthesized using a one-step cross-linking co-nanopolymerization strategy in aqueous conditions. The optimal fabrication and characterization of these novel nanoparticles are presented here.

Sulu Tek Adımlı Çapraz Bağlama ve Ko-nanopolimerizasyon Kullanılarak Uyaranlara Duyarlı Nanojellerin Sentezi

Nanogels consisting of crosslinked-polymeric nanoparticles have been developed for the delivery of numerous chemical and biological therapeutics, owing to ...

Microfluidic Production of Lysolipid-Containing Temperature-Sensitive Liposomes

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading chemotherapeutic drugs, such as doxorubicin (DOX). To achieve this, an ethanolic lipid mixture and ammonium sulfate solution are injected into a staggered herringbone micromixer (SHM) microfluidic device. The solutions are rapidly mixed by the SHM, providing a homogeneous solvent environment for liposomes self-assembly. Collected liposomes are first annealed, then dialyzed to remove residual ethanol. An ammonium sulfate pH-gradient is established through buffer exchange of the external solution by using size exclusion chromatography. DOX is then remotely loaded into the liposomes with high encapsulation efficiency (&#62; 80%). The liposomes obtained are homogenous in size with Z-average diameter of 100 nm. They are capable of temperature-triggered burst release of encapsulated DOX in the presence of mild hyperthermia (42 &#176;C). Indocyanine green (ICG) can also be co-loaded into the liposomes for near-infrared laser-triggered DOX release. The microfluidic approach ensures high-throughput, reproducible and scalable preparation of LTSLs.

The protocol presents the optimized parameters for preparing thermosensitive liposomes using the staggered herringbone micromixer microfluidics device. This also allows co-encapsulation of doxorubicin and indocyanine green into the liposomes and the photothermal-triggered release of doxorubicin for controlled/triggered drug release.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

The presented protocol enables a high-throughput continuous preparation of low temperature-sensitive liposomes (LTSLs), which are capable of loading ...

Preparation and Characterization of Targeted Microbubbles

Targeting of microbubbles (ultrasound contrast agents for molecular imaging) has been researched for more than two decades. However, methods of microbubble preparation and targeting ligand attachment are cumbersome, complicated, and lengthy. Therefore, there is a need to simplify the targeted microbubble preparation procedure to bring it closer to clinical translation. The purpose of this publication is to provide a detailed description and explanation of the steps necessary for targeted microbubble preparation, functional characterization and testing. A sequence of the optimized and simplified procedures is presented for two systems: a biotin-streptavidin targeting pair model, and a cyclic RGD peptide targeting the recombinant &#945;v&#946;3 protein, which is overexpressed on the endothelial lining of the tumor neovasculature.
Here, we show the following: covalent coupling of the targeting ligand to a lipid anchor, assessment of the reagent quality, and tests that confirm the successful completion of the reaction; preparation of the aqueous precursor medium containing microbubble shell components, followed by microbubble preparation via amalgamation; assessment of the efficacy of lipid transfer onto the microbubble stabilizer shell; adjustment of microbubble size distribution by flotation at normal gravity to remove larger microbubbles that might be detrimental for in vivo use; assessment of microbubble size distribution by electrozone sensing; evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a static binding assay test (in an inverted dish); and evaluation of targeted binding of the microbubbles to receptor-coated surface in a parallel plate flow chamber test.

<meta charset="utf8"></head><body>Hedeflenen mikro kabarcıkların hazırlanması ve karakterizasyonu

The goal of this protocol is to prepare, purify and characterize gas-filled microbubbles (targeted contrast agents for ultrasound molecular imaging). Two targeting systems are described: biotinylated bubbles adherent to streptavidin, and cyclic RGD peptide microbubbles that bind to &#945;v&#946;3, a known tumor neovasculature biomarker.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler