MEC ve Victoria Hükümeti (Veski Yenilik Fellowship, bu iş için Harçlar Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (WEHI Bağımsız Araştırma Enstitüleri Altyapısını Destekleme Programı [IRIISS] hibe MEC ve MJC için NHMRC proje hibesi 1011352) tarafından sağlanır; WEHI için Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme). MEC Avustralya Araştırma Konseyi Kraliçe Elizabeth II üyesidir. EFXB Melbourne Üniversitesi&#39;nde Norma Hilda Schuster Burs Programı desteğini onaylar.

1. Klonlama ve Construct Tasarım HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (bkz. Şekil 1) kullanarak PMM-peptid vektör (hangi istek üzerine temin edilebilir) içine ilgi dizileri klonlama. Çift sarmallı DNA sokmasını aşağıdaki sırayla içermelidir: Bir HindIII sitesi; CNBR bölünme için tek bir metionin kodon; E. kodlama sekansı coli kodon-optimize peptid, bir stop kodonu, bir BamHI sitesi. Peptid diğer tüm methionines bertaraf edilmesi gerekir ve bu da asidik koşullar altında ayrılır edileceği gibi dipeptid sekans Asp-Pro kaçınılmalıdır. Benzersiz bir sistein artığını nihai komplekse disülfid çapraz bağ arzu edilen konumlandırma göre her bir peptid sıranın içerisine sokulmuştur olmalıdır ve tüm diğer sistein, serin için mutasyonlu olmalıdır. Plazmit seçimi için bir kanamisin direnç kasedi taşır. 2. TrpLE-pepti İfadede Füzyon <ol><li> (0.1 mM CaCI2, 2 mM MgSO4, 3 g / L, KH 2 PO 4, 7.5 g / L Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0.5 g / L NaCl, makyaj ve steril filtre M9/Kan en az büyüme ortamının 1 g / L NH4CI, 4 g / L glukoz, 50 mg / L kanamisin sülfat). Çözünmeyen malzeme ve steril filtre turuncu süpernatant kaldırmak için 30 dakika, santrifüj için karıştırma ile 40 ml H 2 O 1 tablet çözülür:. Olan Merkez Komple A B vitaminleri ve iz metaller sağlamak Çinko Supplement 2 haftaya kadar ve M9 4 ml / L kullanımı için karanlıkta 4 ° C de saklayınız stok solüsyonu. NOT: eğer istenirse 15 N-zenginleştirilmiş NH4CI, 13 C-zengin glikoz veya diğer sabit-izotop etiketli öncüleri, bu aşamada M9 ortam olarak dahil edilebilir. </li><li> Taze transforme BL21 (DE3) suşu E. 100 ml starter kültür inoküle M9/Kan ortamda coli. 200 rpm&#39;de sallama ile 37 ° C &#39;de gece boyunca büyümeye. </li><li> Ertesi sabah, başlangıç ​​kültür OD 600, - bu 2 veya daha büyük bir aralık içinde olmalıdır. Merkez-takviye M9 orta 1 L toplam hacmi içine 100 ml starter kültür seyreltin. Iki 2 L şaşkın şişeler (her bir şişeye 500 ml kültür) bölünür ve 37 büyüyecek ° C OD 600 0.6 ulaşıncaya kadar 140 rpm&#39;de sallayarak. </li><li> 18 çalkalayıcı sıcaklığını ayarlayın ° C ve kültürler indüksiyonundan önce tamamen soğumasını sağlayan, 1 saat boyunca sallayarak devam. </li><li> (OD 600 = 1 bir kültürün 50 ul eşdeğeri) SDS-PAGE analizi için bir ön-indüksiyon numune alın, sonra trpLE-peptid füzyon ifadesini teşvik etmek için 0.1 mM nihai konsantrasyona IPTG ilave edin. 18 ° IPTG indüksiyon altında gecede C/140 Devri (16-20 saat) büyüyor devam edin. </li></ol> 3. İçerme Vücut Hazırlama ve Nikel Matrix Ciltleme <ol><li> Az orta gecede ifade kültürlerin son OD 600 değişken ve sho olduğunuuld 2.5 ve 5.0 arasında olmalıdır. SDS-PAGE analizi için numune alın (OD 600 = 1 bir kültür 50 ul eşdeğeri) ve 5.000 x g&#39;de 20 dakika süreyle santrifüj hücreleri toplamak. </li><li> Yeniden süspanse hücre pelet, 50 ml lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM β-ME, 0.2 M NaCI) içinde 1 M kültüründen. Hücre süspansiyonu daha sonra işlenmek için dondurulmuş saklanabilir. </li><li> 5 dakika buz üzerinde 1 dakika ve geri kalanı için maksimum çıkışta buz üzerinde sonication tarafından hücreleri Lyse. Biz ½-inç yüksek yoğunluklu değiştirilebilir ucu ile bir Misonix sonikatör 3000 (max çıkış 600 watt) kullanın. Sonication / üç kür için soğutma tekrarlayın. </li><li> 20.000 g&#39;de 15 dakika santrifüj ile çözünmeyen inklüzyon cisimciği (IB) malzeme toplayın ve supernatant atın. Açık renkli hücre enkaz gevşek, ince bir tabaka yoğun IB pelet üstünde görülebilir, bu nazik ajitasyon ile su veya tampon kullanarak uzak yıkanabilir. Adımları 3.3 ve 3.4 IB fraksiyonu saflığını iyileştirmek için tekrar edilebilir eğer desikırmızı. Pelet ve süpernatant malzeme örnekleri dahil organlarına trpLE-TM füzyon yerelleştirme onaylamak için SDS-PAGE analizi için alınmalıdır. </li><li> İşlenmiş kültür litresi başına 25-50 ml kullanılarak guanidin çözeltisi (6 M guanidin HCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCI, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), IB granül çözülür. Bu adım, çalkalama ve sonikasyon ile zaman zaman hafif bir kaç saat gerektirir. </li><li> 75,000-100,000 xg&#39;de 1 saat ile 20 ° C için santrifüjleme ile IB lizat temizleme Bir 0.2 um membran ile süpernatantı ve filtre süzün. </li><li> 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde temizlenmiş IB lizat, ya da su ve guanidin çözeltisi ile dengelenmiş ile yıkandı nikel afinite reçine ile, sıkıca kapatılmış olabilir daha büyük bir kap birleştirin. TrpLE-DAP12TM (Şekil 3, şerit 2), burada gösterildiği gibi benzer bir dereceye kadar ifade füzyonları için işlenmiş kültür litre başına 3-4 ml yerleşik reçine kullanımı. Oda t geceleme kuluçkaya alarak Toplu bind<html> nazik karıştırma ile emperature. </li></ol> 4. On-sütun Oksidatif Crosslinking <ol><li> Tüm hacmi akan kadar sürekli olarak ekleyerek, gözenekli yatak desteği ile boş bir yerçekimi akışı sütuna IB lizat / nikel reçine süspansiyon yükleyin. Toplamak ve hala çözülmüş füzyon proteini içerebilir flowthrough, bir kenara koymak. </li><li> Β-ME 5 mM üre çözeltinin 5 yatak hacmi (8 M üre, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) ile yerçekimi akışı ile nikel reçine yıkanır. </li><li> Β-ME olmadan üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile tekrar nikel reçine yıkayın. </li><li> 20 uM CuSO 4 ve glutatyon okside 2 mM ile takviye edilmiş üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile nikel reçine üçüncü kez yıkayın. Bu yıkamadan sonra, sütun çıkış yakın ve en fazla disülfit bağ oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li></ol> 5. TFA Elüsyon ve Miktar içeriği &quot;&gt; DİKKAT: Trifloroasetik asit (TFA) deri ve duman ile temas şiddetli yanıklara neden son derece rahatsız edici olan Konsantre TFA göz koruması olmayan lateks eldiven ile onaylı kimyasal davlumbaz kullanılmalıdır tüm kimyasal uyumluluğunu kontrol edin.. malzemeler; polipropilen Bu protokol tüm adımları ile uyumludur. <ol><li> Su 10 yatak hacmi ile oksitleyici üre çözeltisi yıkayın ve sütun çıkışına bir vakum hattı uygulayarak sütun yatak kurulayın. </li><li> Kolon çıkışında kapatın ve düzgün (99-100%) TFA 1.5 yatak hacmi ekleyin. Asit ile dahi maruz kalmasının ve 5 dakika inkübe edilir ve küçük bir spatula ile nikel reçine karıştırın. Kolon çıkış açın ve tüm sıvı dışarı itmek için gerekli ise, bir şırınga veya basınçlı hava hattı ile yavaşça basınçlandırma, asit ile arındırıldı ve toplamak. </li><li> Düzgün TFA başka 1.5 yatak hacmi ile asit elüsyon adımı yineleyin. Beade tam çözünmesini önlemek için bu aşamada hızlı çalışınd agaroz matrisi. Protein verim Beer-Lambert denklem ile trpLE-peptid dizisi teorik molar tükenme katsayısına göre bu noktada tespit edilebilir. Trifluoroethanol içinde TFA ile arındırıldı (1:20-01:50) (TFE) bir örnek seyreltilir ve bir boş olarak aynı dilüsyonda, TFA / TFE kullanılarak, 280 nm&#39;de absorbansı ölçülür. </li></ol> 6. CNBR Sindirim DİKKAT: siyanojen bromür (CNBR) son derece toksik ve sadece onaylı kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. Emniyet gözlüğü, laboratuvar önlüğü ve olmayan lateks eldiven dahil KKD kesinlikle gereklidir. CNBR neme reaktif ve açmadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir. Nötralizasyon / CNBR-kontamine çözümleri ve malzemelerin bertaraf talimatları için kurumsal güvenlik ofisine başvurun. <ol><li> Hafifçe karıştırma sırasında damla damla su ilave edilerek% 80 TFA nihai konsantrasyon asit elüsyon seyreltilir. Bir çökelti oluştu, bir varsadd geri temiz TFA küçük bir miktarda (0,5-1 ml) çözeltisi su ile% 80 yeniden doğru, daha sonra açıklık kadar. Sıvı azot içinde dondurulması ve hemen örnek liyofilize edilmesiyle, SDS-PAGE analizi için bir 5 ul ön özet numune alın. </li><li> Kapalı, önceden tartılmış tüpleri güvenle toksik kimyasal tartmak bakımı veya kimyasal davlumbaz içinde bir denge kullanarak, yaklaşık 0.2 g / ml CNBR kristalleri ekleyin. Tamamen eriyene kadar yavaşça karıştırın. Yıkayın ve atıl gaz (argon ya da azot akışı) altında tepkime kabı mühürlemek ve ışıktan koruyarak, oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe edilir. </li><li> SDS-PAGE analizi için 5 ul sonrası özet numune alın ve dondurma ve hemen lyophilize. Beklenen peptid kompleksi boyutu göre, 3.5 kDa ya da daha az bir moleküler ağırlığa sahip bir kesme rejenere selüloz diyaliz kaset ya da boru (selüloz asetat konsantre asit içinde eriyecektir) ile sindirmek reaksiyon aktarın. Su içinde 4 M vermek üzere gece boyunca Dialyzekimyasal davlumbaz TFA konsantrasyonunu azaltmak ve herhangi bir reaksiyona girmemiş CNBR ayrıştırılması. Gecede diyaliz sırasında hacminde önemli bir artış (kadar üç kat iki-gibi) için diyaliz kaset veya tüp boşluk bırakın. </li><li> Diyaliz kaset ya da boru (protein en TFA konsantrasyonu düşük olduğu zaman çökelti olacaktır) asılı bir çökelti ile diyalize edilen çözelti tepkime çıkarın ve 50 ml konik tüpe süspansiyon aktarın. Freeze ve su CNBR / TFA izlerini kaldırmak için lyophilize. Bu adım birkaç gün ihtiyacı doğacaktır. DİKKAT: diyalizlenmiş özeti reaksiyonu ve diyaliz su Hem toksik ve uygun önlemler ile bertaraf / ele muamelesi devam edilmelidir. </li><li> Öncesi indüksiyon ve hasat dönemlerinde, inklüzyon body süpernatant ve pelet, TFA arındırıldı ve CNBR-sindirilmiş malzemeden kültürlerin örnekleri SDS-PAGE ile analiz edilebilir. 95 ile ısıtma ile numuneler hazırlayın Invitrogen NuPAGE LDS sampl ° Ce tampon. TFA arındırıldı ve özet örneklerinin oksidatif crosslinking ürün tanımlama ve değerlendirme kolaylaştırmak için azaltma ve non-düşürücü hem koşullarda hazırlanmalıdır. </li><li> En küçük özet ürünlerin optimum çözümü için MES-SDS tamponu kullanılarak çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde örnekleri ayırın. </li></ol> 7. Disülfür çapraz bağlı peptid komplekslerini arasında Ters-faz HPLC saflaştırma <ol><li> Bir preparatif-ölçek üzerine 2-3 ml formik asit ve muntazam yük (21.2 x 150 mm) içine liyofilize özet ürünleri 100 mg a kadar eritilir Agilent Zorbax SB-300, çözücü, C3 PrepHT A sütunu (tipik olarak% 10-20 asetonitril ya da 5 % 0.1 TFA ile su içinde% 10 izopropanol). </li><li> En az 5 kolon hacmi üzerinden çözücü B gradyanı (% 0.1 TFA ile asetonitril veya izopropanol) içinde özet ürünler Zehir. Farklı peptidle optimum eğim koşulları seçimi önerileri için TARTIŞMA bakınız. </li><li> AlmakSDS-PAGE analizi ve dondurma ve hemen lyophilize için her HPLC fraksiyonu 50-100 ul örnekleri. HPLC solvent kaldırılmasını hızlıdır ve 1-2 saat içinde tam olmalıdır. </li><li> Herhangi bir indirgen ajan ile Invitrogen NuPAGE LDS numune tamponu içinde 95 ° C ye ısıtmak suretiyle SDS-PAGE için liyofilize HPLC numuneleri hazırlanır. Soğutulur ve onları ve yeniden ısıtma kısaca birine 100 mM DTT ekleyerek, eşit 2 mikrosantrifüj tüpleri içine her bir numune ayrılır. </li><li> MES-SDS olarak yukarıdaki tampon ile çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde daha az olmayan ve azaltılmış HPLC numuneleri ayırın. Küçük, hidrofobik peptitler genellikle Coomassie sıra leke yapmayız ve beklenen molekül ağırlıklarında çalışmayabilir. Ancak, azaltılmış ve non-azaltılmış örneklerinin karşılaştırılması çapraz peptid ürünleri ve saflık değerlendirilmesi belirlenmesi kolaylaştırmalıdır. </li><li> Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonlaşma time-of-flight (MALDI-TO tarafından aday peptid içeren fraksiyonları analizF) kütle spektrometresi (TARTIŞMA bakınız) faiz türleri belirlemek ve beklenen kitle onaylayın. </li><li> , Kombine saf, çapraz bağlı TM peptid kompleksi ihtiva eden HPLC fraksiyonları dondurmak ve lyophilize ve verimi belirlemek için, son ürünün bir kuru ağırlık al. Yüksek izopropanol içerikli Kesirler dondurulmuş kalmayabilir. Peptit parçaları yerine bir kabarık liyofilize edilmiş ürüne göre daha aşağı kuru film halinde, saf hekzafloroizopropanol (HFIP) küçük bir hacim içinde tamamen filmi yeniden çözülür donma ve tekrar lyophilize. HFIP ile tedavi edilen ürün, kolaylıkla dışarı uçlu ve tartılmış küçük, beyaz bir koni olmalıdır. </li></ol>

<ol>
	<li>Call, M. E., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+view+into+the+blind+spot:+solution+NMR+provides+new+insights+into+signal+transduction+across+the+lipid+bilayer.">A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer.</a> Structure. 18, 1559-1569 (2010).</li><li>Bocharov, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+dimeric+transmembrane+domain+of+the+growth+factor+receptor+ErbB2+presumably+corresponding+to+the+receptor+active+state.">Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+of+the+transmembrane+domain+heterodimer+of+ErbB1+and+ErbB2+receptor+tyrosine+kinases.">Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases.</a> J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).</li><li>Mineev, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+structure+and+dimer--monomer+equilibrium+of+the+ErbB3+transmembrane+domain+in+DPC+micelles.">Spatial structure and dimer--monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles.</a> Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).</li><li>Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+integrin+alphaIIbbeta3+transmembrane+complex+explains+integrin+transmembrane+signalling.">The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling.</a> The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).</li><li>Zhu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+a+receptor+with+two+associating+transmembrane+domains+on+the+cell+surface:+integrin+alphaIIbbeta3.">The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3.</a> Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).</li><li>Call, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+zetazeta+transmembrane+dimer+reveals+features+essential+for+its+assembly+with+the+T+cell+receptor.">The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor.</a> Cell. 127, 355-368 (2006).</li><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structural+basis+for+intramembrane+assembly+of+an+activating+immunoreceptor+complex.">The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex.</a> Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).</li><li>Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+expression+and+purification+of+highly+insoluble+transmembrane+domains.">Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains.</a> Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).</li><li>Schnell, J. R., Chou, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+M2+proton+channel+of+influenza+A+virus.">Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus.</a> Nature. 451, 591-595 (2008).</li><li>Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=purification,+and+isotope+labeling+of+cannabinoid+CB2+receptor+fragment,+CB2(180-233).">purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233).</a> Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).</li><li>Miozzari, G. F., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+the+leader+region+of+the+Escherichia+coli+tryptophan+operon.">Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon.</a> J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).</li><li>North, C. L., Blacklow, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+independence+of+ligand-binding+modules+five+and+six+of+the+LDL+receptor.">Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor.</a> Biochemistry. 38, 3926-3935 (1999).</li><li>Staley, J. P., Kim, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+native-like+subdomain+in+a+partially+folded+intermediate+of+bovine+pancreatic+trypsin+inhibitor.">Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor.</a> Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).</li><li>Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C-terminal+region+of+signal+peptide+peptidase+defines+a+functional+domain+for+intramembrane+aspartic+protease+catalysis.">A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).</li><li>Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+beta-amyloid+protein+is+covalently+modified+when+dissolved+in+formic+acid.">Alzheimer's beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid.</a> J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).</li><li>Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+identification+of+the+formic+acid-modified+residue+in+Alzheimer's+amyloid+protein.">NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer's amyloid protein.</a> J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).</li><li>Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reversible+chemical+modification+of+the+tryptophan+residue.">A reversible chemical modification of the tryptophan residue.</a> Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).</li><li>Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Advances+in+the+Application+of+Solution+NMR+Spectroscopy+to+Multi-Span+Integral+Membrane+Proteins.">Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins.</a> Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C&#39;de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref 15) ...

Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son 1 yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek için bu teknikler istihdam var. Bu teknikler, bir çok başka zar proteini sistemlerinin yanı sıra çözelti NMR ek olarak aşağı analitik yöntemler geniş bir yelpazede için de geçerlidir. Burada verilen örnekte yerli sistein kalıntıları kullanır ikendoğal disülfit-gümrüklü protein taklit eden bir kompleks oluşturmak için, tasarım eşit derecede iyi normalde böyle homo-ve hetero-dimerik TM kompleksleri gibi zayıf, non-kovalent etkileşimler arada tutarak kompleksleri stabilize etmek için tasarlanmış disülfit bağları oluşturmak için uygundur epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi proteinleri 2-4 veya heterodimerik αβ integrin kompleksleri 5,6. Bu tür lipit türetilmiş olanlar gibi, son derece hidrofobik peptid dizileri kapsayan-çift-katlı TM proteinlerinin kısımlarını biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için son derece zor konusudur. Standart protein ve peptid kimyası teknikleri kullanılarak manipüle etmek çok zor olmasının yanı sıra, genellikle hücreler için oldukça toksik olan ve bu nedenle yeniden birleştirilerek üretmek zordur. Biz 7,8 ve diğerleri 9-11 sahip olan in-frame karboksi-terminal olarak bakteri gibi zor peptid sekansları ifade önemli bir başarıE. türetilen ΔtrpLE1413 dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu ile füzyonları coli trp operon 12. Bu sekans ile kodlanan ~ 13 kDa trpLE polipeptid bir T7 promotor altında yüksek düzeyde üretilebilir ve tamamen toksisite ve / veya istikrarsızlık ile ilgili problemler atlatılabilir edilir dahil organları lokalize edilmektedir. Bir amino-terminal 9-histidin etiketi 13 ve trpLE sıra, iç metionin ve sistein kalıntıları ortadan kaldırılması metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve sindirildi edilmesi için izin verilen 14 trpLE-peptid füzyonları ve siyanojen bromür (CNBR kullanılarak eklenmesi ile sekans modifikasyonu ) istenen peptid dizisi serbest kalmasını sağlar. Biz başarıyla en fazla dört TM alanları içeren membran proteini parçaları temsil trpLE füzyonlar gibi bir düzine farklı dizilerin daha ifade etmek için bu sistemi kullanılmış (7,8 ve yayınlanmamış sonuçlar; ayrıca TARTIŞMA bölümüne bakınız). Bu protokolde de önemli bir yenilik yapısal olmayan ve çok az çözünen trpLE-TM füzyonları verimli bir iş akışı bağlamında disülfür-çapraz bağlı olabilir hangi koşullar altında tespit edilmesidir. Yüksek verim ifadesi, taşıma ve peptid ürünlerinin saflaştırılması birkaç yönü de iyice optimize, ve burada sunulan öneriler olmayan disülfit çapraz bağlı (monomerik) TM peptid ürünlerinin üretimi için aynı derecede geçerli olarak oylandı.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Siyanojen bromür </td><td> Aldrich </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Teneffüs edilmesi, deri ile teması ve yutulması halinde zararlıdır. Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> Trifloroasetik asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P.CODE-1000984387, CAS Numarası 76-05-1 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL., Ciddi yanıklara neden olur. Solunması halinde sağlığa zararlıdır. Sudaki organizmalar için zararlı, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P.No M7154, CAS Numarası 60-24-2 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda toksiktir. Cildi tahriş eder. Gözlere ciddi hasar riski. Deri ile teması halinde hassasiyete neden olabilir. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolün hazırlanması </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Ürün Numarası 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunması halinde sağlığa zararlıdır ve yutulduğunda toksiktir. Yanıklara neden olur. </td></tr><tr><td> Formik asit </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Yanıcı sıvı ve buhar. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. </td></tr><tr><td> Üre </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Ürün Numarası, 817, CAS-No 57-13-6 </td><td> ısıtmalı, deckarbon dioksit ve amonyak ile omposes, yanmış halinde, azot oksit, az miktarda yayar. Kızarıklık ve cilt ve gözlerde tahrişe neden olabilir. </td></tr><tr><td> Guanidin HİDROKLORİD </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, CAS Numarası: 50-01-1 </td><td> Yutulması halinde zararlıdır, Ciddi derecede göz tahrişine neden olur cilt tahrişi, Akut Toksisite Oral, Cilt Tahriş edici, Göz Tahriş edici neden olur. </td></tr><tr><td> TRİTON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Ürün Numarası-T8532 CAS No: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 sık sık proteinleri çözünür biyokimyasal uygulamalarında kullanılan bir iyonik olmayan deterjan,% 100 aktif maddedir. Triton X-100, herhangi bir antimikrobiyal özelliklere sahiptir ve nispeten hafif bir denatüre edici olmayan bir deterjan olarak kabul </td></tr><tr><td> Onun-Seçiniz Nikel-Affinity jel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Katalog Num-P6611 </td><td> IS-Select Nikel Affinity Jel bir immobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) ürünüdür. HIS-Seçiniz NickEl Affinity jel özellikle histidin içeren proteinlere bağlamak için tasarlanmıştır nikel ile tahsil boncuklu agaroz üzerine özel bir quadridentate preparatıdır. </td></tr><tr><td> (-)-Glutatyon, okside </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Katalog num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonikatör </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (üretilmiyor) </td><td> Maksimum çıkış gücü 600 watt. 1/2-inch değiştirilebilir uçlu prob 1/2-inch yüksek yoğunluklu, yüksek hacimli ipuçları ve yüksek yoğunluklu, düşük hacimli ipuçları bir dizi alır. Bu firma şu anda mevcut en yakın modeller Q500 ve Q700 vardır. </td></tr><tr><td> RP-HPLC: Biyolojik Çift Geçişli kromatografi sistemi, Yazılım Sürüm 5.3 </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Seri No: 484BR3705 </td><td> Peptitler yüksek aq faz HPLC kolonları ters bağlanırueous mobil faz ve yüksek organik hareketli faz ile RP HPLC kolonları arasından kolonda sürüklenecektir. RP HPLC peptidlerin hidrofobik özelliğine göre ayrılır. Peptitler, organik çözücü bir doğrusal gradyan ile çalışan ayrılabilir. </td></tr><tr><td> Hazırlık HT C3 Zorbax 300SB-Analitik HPLC Kolon, 21.2 x 150 mm, 5 mm partikül boyutu </td><td> Agilent </td><td> Ürün No: 895150-909 </td><td> Ters-faz HPLC kolon </td></tr><tr><td> NuPAGE% 12 Bis-Tris Jeller </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> NP0341BOX </td><td> Protein elektroforezi için Prefabrik jeller </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer G2 Diyaliz Kasetler, 3,5 K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Ürün No: 87724 </td><td> Örnek diyaliz </td></tr></tbody></table>

production of disulfide-stabilized transmembrane peptide complexes for structural studies

Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.

TrpLE füzyonları için elde ekspresyon seviyesi, değişken ve ekli peptidin amino asit dizisinin büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 3, önceden indüksiyon SDS-PAGE analizi (hat 1) ve time-of-hasat (kulvar 2) göstermektedir kültürü 1 litre ve 4 ml nikel matris saf, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık 120 mg&#39;lik bir kültür örnekleri. TrpLE-DAP12TM füzyon Tüm olarak süpernatant (yol 3) karşı inklüzyon cisimciği pelet (şeritli 4) lokalize edilmiştir. <p class="jove_c...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies at JoVE.com

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

production-disulfide-stabilized-transmembrane-peptide-complexes-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

14.0K Görüntüleme.  The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Video: Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Kimya

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Thin-layer Chromatographic (TLC) Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the chromatograms to microbial suspensions (e.g. fungi or bacteria in broth or agar), allowing time for the microbes to grow in a humid environment, and visualizing zones with no microbial growth.&#160;The effectiveness of this screening method, known as bioautography, depends on both the quality of the chromatographic separation and the care taken with microbial culture conditions.&#160;This paper describes standard protocols for TLC and contact bioautography&#160;with a novel application to amino acid-fermenting bacteria. The extract is separated on flexible (aluminum-backed) silica TLC plates, and bands are visualized under ultraviolet (UV) light.&#160;Zones are cut out and incubated face down onto agar inoculated with the test microorganism.&#160;Inhibitory bands are visualized by staining the agar plates with tetrazolium red.&#160;The method is applied to the separation of red clover (Trifolium pratense cv. Kenland) phenolic compounds and their screening for activity against Clostridium sticklandii, a hyper ammonia-producing bacterium (HAB) that is native to the bovine rumen.&#160;The TLC methods apply to many types of plant extracts&#160;and other bacterial species (aerobic or anaerobic), as well as fungi, can be used as test organisms if culture conditions are modified to fit the growth requirements of the species.

Thin-layer Chromatographic TLC Separations and Bioassays of Plant Extracts to Identify Antimicrobial Compounds

Methods are described for thin-layer chromatographic (TLC) separation of plant extracts and contact bioautography to identify antibacterial metabolites. The methods are applied to the screening of red clover phenolic compounds inhibiting hyper&#160;ammonia-producing bacteria (HAB) native to the bovine rumen.

İnce tabaka kromatografi (TLC) Ayırımı ve bitki özleri Biyodenemeler Antimikrobiyal Bileşikler tanımak

A common screen for plant antimicrobial compounds consists of separating plant extracts by paper or thin-layer chromatography (PC or TLC), exposing the ...

Capillary Electrophoresis to Monitor Peptide Grafting onto Chitosan Films in Real Time

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. Compared to other analytical separation techniques, such as chromatography, CE is cheap, robust and effectively requires no sample preparation (for a number of complex natural matrices or polymeric samples). CE is fast and can be used to follow the evolution of mixtures in real time (e.g., chemical reaction kinetics), as the signals observed for the separated compounds are directly proportional to their quantity in solution.
Here, the efficiency of CE is demonstrated for monitoring the covalent grafting of peptides onto chitosan films for subsequent biomedical applications. Chitosan&#39;s antimicrobial and biocompatible properties make it an attractive material for biomedical applications such as cell growth substrates. Covalently grafting the peptide RGDS (arginine - glycine - aspartic acid - serine) onto the surface of chitosan films aims at improving cell attachment. Historically, chromatography and amino acid analysis have been used to provide a direct measurement of the amount of grafted peptide. However, the fast separation and absence of sample preparation provided by CE enables equally accurate yet real-time monitoring of the peptide grafting process. CE is able to separate and quantify the different components of the reaction mixture: the (non-grafted) peptide and the chemical coupling agents. In this way the use of CE results in improved films for downstream applications.
The chitosan films were characterized through solid-state NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. This technique is more time-consuming and cannot be applied in real time, but yields a direct measurement of the peptide and thus validates the CE technique.

Free solution capillary electrophoresis is a fast, cheap and robust analytical method that enables the quantitative monitoring of chemical reactions in real time. Its utility for rapid, convenient and precise analysis is demonstrated here through analysis of covalent peptide grafting onto chitosan films for improved cell adhesion.

Kapiler Elektroforez Real Time Kitosan Films üzerine Peptit Aşılama Monitör

Free-solution capillary electrophoresis (CE) separates analytes, generally charged compounds in solution through the application of an electric field. ...

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, allowing for the synthesis of isotactic poly(&#945;-hydroxy acids) with expected molecular weights (&#62;140 kDa) and narrow molecular weight distributions (Mw/Mn &#60; 1.1). This ring-opening polymerization is mediated by Ni and Zn complexes in the presence of an alcohol initiator and a photoredox Ir catalyst, irradiated by a blue LED (400 - 500 nm). The polymerization is performed at a low temperature (-15 &#176;C) to avoid undesired side reactions. The complete monomer consumption can be achieved within 4 - 8 hours, providing a polymer close to the expected molecular weight with narrow molecular weight distribution. The resulted number-average molecular weight shows a linear correlation with the degree of polymerization up to 1000. The homodecoupling 1H NMR study confirms that the obtained polymer is isotactic without epimerization. This polymerization reported herein offers a strategy for achieving rapid, controlled O-carboxyanhydrides polymerization to prepare stereoregular poly(&#945;-hydroxy acids) and its copolymers bearing various functional side-chain groups.

Controlled Photoredox Ring-Opening Polymerization of O-Carboxyanhydrides Mediated by Ni/Zn Complexes

A protocol for the controlled photoredox ring-opening polymerization of O-carboxyanhydrides mediated by Ni/Zn complexes is presented.

Photoredox yüzük-açılış polimerizasyon O- Carboxyanhydrides Ni/Zn kompleksleri tarafından aracılı ile kontrol

Here, we describe an effective protocol that combines photoredox Ni/Ir catalysis with the use of a Zn-alkoxide for efficient ring-opening polymerization, ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the aziridine ring. The utility of bicyclic aziridinium ions, specifically 1-azoniabicyclo[3.1.0]hexane and 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate highlighted in the aziridine ring openings by the nucleophile with the release of the ring strain to yield the corresponding ring-expanded azaheterocycles such as pyrrolidine, piperidine and azepane with diverse substituents on the ring in regio- and stereospecific manner. Herein, we report a simple and convenient method for the preparation of the stable 1-azabicyclo[4.1.0]heptane tosylate followed by selective ring opening via a nucleophilic attack either at the bridge or at the bridgehead carbon to yield piperidine and azepane rings, respectively. This synthetic strategy allowed us to prepare biologically active natural products containing piperidine and azepane motif including sedamine, allosedamine, fagomine and balanol in highly efficient manner.

Bicyclic aziridinium ions such as 1-azoniabicyclo[4.1.0]heptane tosylate were generated from 2-[4-tolenesulfonyloxybutyl]aziridine, which was utilized for the preparation of substituted piperidines and azepanes via regio- and stereospecific ring-expansion with various nucleophiles. This highly efficient protocol allowed us to prepare diverse azaheterocycles including natural products such as fagomine, febrifugine analogue and balanol.

Kararlı Bicyclic Aziridinium iyonları ve onların halka açılış Azaheterocycles sentezi için hazırlanması

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Novel Techniques for Observing Structural Dynamics of Photoresponsive Liquid Crystals

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational spectroscopy and time-resolved electron diffraction. Liquid crystal phase is an important state of matter that exists between the solid and liquid phases and it is common in natural systems as well as in organic electronics. Liquid crystals are orientationally ordered but loosely packed, and therefore, the internal conformations and alignments of the molecular components of LCs can be modified by external stimuli. Although advanced time-resolved diffraction techniques have revealed picosecond-scale molecular dynamics of single crystals and polycrystals, direct observations of packing structures and ultrafast dynamics of soft materials have been hampered by blurry diffraction patterns. Here, we report time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffractometry to acquire ultrafast snapshots of a columnar LC material bearing a photoactive core moiety. Differential-detection analyses of the combination of time-resolved IR vibrational spectroscopy and electron diffraction are powerful tools for characterizing structures and photoinduced dynamics of soft materials.

Here, we present the protocols of differential-detection analyses of time-resolved infrared vibrational spectroscopy and electron diffraction which enable observations of the deformations of local structures around photoexcited molecules in a columnar liquid crystal, giving an atomic perspective on the relationship between the structure and the dynamics of this photoactive material.

Yapısal Photoresponsive sıvı kristaller dinamikleri gözlemlemek için yeni teknikleri

We discuss in this article the experimental measurements of the molecules in liquid crystal (LC) phase using the time-resolved infrared (IR) vibrational ...

Analyzing Protein Architectures and Protein-Ligand Complexes by Integrative Structural Mass Spectrometry

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing metabolic reactions, DNA repair and replication. Therefore, a detailed understanding of these processes provides critical information on how cells function. Integrative structural MS methods offer structural and dynamical information on protein complex assembly, complex connectivity, subunit stoichiometry, protein oligomerization and ligand binding. Recent advances in integrative structural MS have allowed for the characterization of challenging biological systems including large DNA binding proteins and membrane proteins. This protocol describes how to integrate diverse MS data such as native MS and ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) with molecular dynamics simulations to gain insights into a helicase-nuclease DNA repair protein complex. The resulting approach provides a framework for detailed studies of ligand binding to other protein complexes involved in important biological processes.

Mass spectrometry (MS) has emerged as an important tool for the investigation of structure and dynamics of macromolecular assemblies. Here, we integrate MS-based approaches to interrogate protein complex formation and ligand binding.

Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz

Proteins are an important class of biological macromolecules that play many key roles in cellular functions including gene expression, catalyzing ...

Preparation of SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each possessing two sulfur and one nitrogen donor atom functionalities (SNS) and based on bis-imidazole or bis-triazole compounds) are metallated with CoCl2&#183;6H2O to afford tridentate SNS pincer cobalt(II) complexes. Preparation of the cobalt(II) model complexes for liver alcohol dehydrogenase is facile. Based on a quick color change upon adding the CoCl2&#183;6H2O to acetonitrile solution that contains the ligand precursor, the complex forms rapidly. Formation of the metal complex is complete after allowing the solution to reflux overnight. These cobalt(II) complexes serve as models for the zinc active site in liver alcohol dehydrogenase (LADH). The complexes are characterized using single crystal X-ray diffraction, electrospray mass spectrometry, ultra-violet visible spectroscopy, and elemental analysis. To accurately determine the structure of the complex, its single crystal structure must be determined. Single crystals of the complexes that are suitable for X-ray diffraction are then grown via slow vapor diffusion of diethyl ether into an acetonitrile solution that contains the cobalt(II) complex. For high quality crystals, recrystallization typically takes place over a 1 week period, or longer. The method can be applied to the preparation of other model coordination complexes and can be used in undergraduate teaching laboratories. Finally, it is believed that others may find this recrystallization method to obtain single crystals beneficial to their research.

Preparation of SNS CobaltII Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase

The preparation of SNS pincer cobalt(II) model complexes of liver alcohol dehydrogenase is presented here. The complexes can be prepared by reacting the ligand precursor with CoCl2&#183;6H2O and can then be recrystallized by allowing diethyl ether to slowly diffuse into an acetonitrile solution that contains the cobalt complex.

Karaciğer Alkol Dehidrogenaz SNS Kobalt(II) Kıskaç Model Kompleksleri Hazırlanması

Chemical model complexes are prepared to represent the active site of an enzyme. In this protocol, a family of tridentate pincer ligand precursors (each ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.