Yazarlar, teknik destek için Genomik ve invaziv olmayan nörofonksiyonel Değerlendirme tesisleri (IIBM, CSIC-UAM) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser İspanyol &quot;Ministerio de Economia y Competitividad&quot; (FEDER-SAF2014-53979-R) ve Avrupa Birliği (FP7-AFHELO ve FP7-PEOPLE-TARGEAR) IVN kadar hibe tarafından desteklenmiştir.

hayvan taşıma prosedürleri uluslararası ve ulusal mevzuata uygun olduğundan emin olun. protokol sırasıyla, Avrupa Topluluğu 2010/63 / AB ve İspanyolca RD 53/2013 kuralları takip eder. 1. Genel Hayvan Taşıma <ol><li> Yem fareler ad libitum standart diyet ve içme suyu ile. Kontrol sağlığı ve Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri (FELASA) önerileri Federasyonu takip ederek refahı. </li></ol> 2. İşitme Değerlendirme NOT: ABR 9 gibi non-invazif işlemler ile (bu işin 2, 7, 14 ve 28 g postmicrosurgery olarak) ameliyat öncesi test duruşma tarafından mikrocerrahi usul ve birçok kez Track fonksiyonel etkisi. <ol><li> ABR testi için, (periton ketamin enjeksiyonu (100 mg / kg vücut ağırlığı (BW) ve ksilazin yani 10 kısa süreli etkisi protokolleri ile fareler uyutmakmg / kg BW). Alternatif olarak, uçucu anestezi altında işitme testi gerçekleştirin. NOT: ABR parametreleri anestezik protokolü 28 etkilemiş olabilir beri, deney boyunca aynı birini kullanın. </li><li> ayak-tutam refleks testi ile anestezi derinliğini kontrol edin. NOT: geri çekilme refleksi kaybolduğunda, hayvan işitsel testler yapmak için anestezi uygun bir derinliğe ulaştı. </li><li> Hidroksipropil metilselüloz bazlı jeller olarak gözyaşı takviyeleri, topikal uygulama ile kurutulması ve ikincil kuru keratokonjonktivit gözleri korumak. </li><li> Bütün işlem boyunca fizyolojik sıcaklıkta (37,5-38 ° C) fare tutun. Elektrik girişimi önlemek için, sıcak su pompası ve ısıtma pedleri kullanmayın. rektal prob ile vücut sıcaklığını izleyin. Her zaman hayvan yanmamasına özen gösterin. NOT: fareler arasında bir yüzey dezenfektanı ile ısıtma yastığı temizlemenizi öneririz.0; anestezi indüksiyon ve derlenme, elektrikli ısıtma pedleri, akkor ya da kızılötesi ışıkları için kullanılabilir. </li><li> ABR prosedürü NOT: ABR Kayıt için, dalga formlarını oluşturmak için bir iç ses kartı ile bir bilgisayar iş istasyonu kullanımı (analog Dijital DA çıkış, dönüşüm) ve elektrik tepki dalga formlarını dijital ortama aktarmak için, bir zayıflatıcı, bir osiloskop ve bir (dijital, AD girişine analog) düşük empedanslı amplifikatör. Modern işitsel iş istasyonları (yani Tucker Davis Teknolojiler) tek bir kompakt sistemindeki tüm bu bileşenleri içerir. <ol><li> Ortam gürültüsü girişim ve yankılanma (Şekil 1) önlemek için bir ses azaltıcı odasının içinde ısıtma pedleri yüzükoyun pozisyonda anestezi fare yerleştirin. </li><li> Dış kulak içine akustik uyaranlara sunun. Önceden ayarlanmış uyaranlara veya uygun yazılım ile tasarlanmış yeni sinyaller kullanın. Seçilen hoparlörün DA iş istasyonu çıkışını bağlayın. NOT: Fredış kulak takılı E alanı ya da kapalı-alan hoparlör kullanılabilir. Çünkü kapalı sistemlerde prob yerleştirilmesi ve ses kalibrasyon zorluk fareler ile çalışırken eski tercih edilir. Serbest alan hoparlörleri iki kulağı teşvik etmek ve bir çift taraflı yanıtı ortaya. Serbest alan hoparlörler ile ağırlıklı olarak mono yanıtları elde etmek için, kontralateral aktivitesi (kulak fişleri ile yani) ya da gürültü maskeleyerek tıkanması ile ortadan kaldırılması vardır. <ol><li> dış kulak yolu ile aynı hizada hoparlör merkezi ile baş veya seçilen kulak bakan sabit bir mesafeye (genellikle 5-20 cm) serbest alan hoparlör yerleştirin. herhangi bir engel hoparlör ve kulak arasındaki ve kepçesi tamamen açık olduğunu olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> aşağıdaki gibi paslanmaz çelik subdermal iğne elektrotlar yerleştirin: i) kafatasının tepe üzerinde kulakları arasındaki kafa derisi aktif (pozitif) elektrot (), ii) referans (negatif) elektrot, parotiskepçesi altında bölge ve iii) geri, kuyruk veya arka bacak bölgesinde toprak elektrot (Şekil 1). <ol><li> Pozitif ve negatif elektrotlar elektriksel empedans kontrol edin. empedans az 3 kOhm (ideal 1 kOhm) olduğundan emin olun. daha yüksek ise, alkolle temiz, yeniden konumlandırmak ya da elektrotlar değiştirin. </li></ol></li><li> ABR kayıt için, 5-10 dB SPL 27, 29, 30 adımları ses basınç seviyesi (SPL) 90 ila 10 dB akrabadan yoğunlukları azaltmaya genişbant tıklamaları ve saf ses frekansları ve mevcut üretir. <ol><li> Mevcut kısa tıklama veya ton uyaranlara (1-5 ms) yüksek düzeyde (yani 80 ya da 90 dB SPL) ile başlayan ve 5-10 dB SPL adımlarla yoğunluğunu azaltarak patladı. uyarıldıktan sonra ilk 10 ms elektrik tepki Kayıt Ol (ABR yanıtları 6-8 ms görünür uyarılmış). NOT: Bu nedenle, stimülasyon oranları50&#39;den daha yüksek uyaranlar olmamalıdır / s (normal oran 20-50). </li></ol></li><li> Yükseltmek, kayıt ve her uyarıcı ve yoğunluğu uyarılmış elektrik yanıtı ortalama. Düşük gürültü ve iyi bir sinyal-gürültü oranına sahip bir amplifikatör kullanın ve AD girişine bağlayın. NOT: ABRS, tipik altında 1 mV (peak-tepe) çok düşük genlikleri var ve çok düşük gürültü ile bir amplifikatör kullanarak kaydedilmiş olması gerekir. Ancak yüksek kalite kayıtları elde etmek için, 200 yanıtları, ya da işitme durumunda, daha fazla tekrarlar (750-1,000) 27 tavsiye edilir - Normal işitme farelerde, açık ABR dalgalar 100 ortalama sonra ortaya çıkar. </li><li> Görme test sırasında ABR eşik belirler. NOT: ABR eşik Ben IV açıkça görülebilir ve orta tepe-tepe gerilimi 2 SD ortalama zemin aktivitesi 31 üzerinde dalgalar ile kayıt güvenilir ABR ortaya çıkarır düşük ses uyaranlara yoğunluğudur. Bu veriler du teyit edilecek olantepe ve interpik gecikme dahil olmak üzere diğer parametreler ile birlikte, off-line analiz halka ve genlikleri dalga. </li><li> manuel ya da otomatik veri analizi yapın. <ol><li> Manuel analiz için (I, II, III ... vb.) Ve dorukları (P1, P2, P3 ...) ve vadiler dışarı işaretlemek 4-5 ABR dalgaları tespit (N1, N2, N3 ...) her dalga için. Analiz elektronik tablo veya metin dosyası, ihracat verileri tamamlandığında. NOT: elektriksel tepki kayıt için özel yazılım genellikle otomatik analizini gerçekleştirir. Ek ölçümler sabit bir yoğunlukta (yani 70 ya da 80 dB SPL) ya da tek tek tıklama eşik (eşiğin, yani 15 dB SPL) göre yoğunluklarda yanıt olarak ABR kayıt belirlenebilir. </li></ol></li></ol></li><li> Uygun yazılım kullanarak ABR Verilerin istatistiksel analizi yapın. Deneysel tasarım bağlı olarak, kullanım standart ana ABR parametrede karşılaştırmak için T-testi veya varyans (ANOVA) analizi eşleştirilmişFarklı gruplar 26, 30 içinde ters. NOT: uzunlamasına çalışmalarda, birçok fonksiyonel veri (yani öncesi ve mikrocerrahi sonra) farklı zamansal noktalarda aynı hayvan tahsil edilir. Bu durumda, genel lineer model tekrarlayan tedbir testi ayrıntılı varyans analizi sağlar. </li></ol> 3. Araç Hazırlık <ol><li> Hazırlama ve steril koşullar altında araç çözümleri kullanın. NOT: Sıvı çözümler genellikle östaki borusu yoluyla hızlı bir şekilde temizlenir. Farklı enjekte edilebilir uygulama sistemleri hidrojeller ve nanopartiküllerin 32 de dahil olmak üzere, orta kulak, ilacın kalma zamanını arttırmak için kullanılabilir. <ol><li> , CGP-hidrojel hazırlanması a% 1.5-2 (ağırlık / ağırlık) sitozan solüsyonu elde edildi 0.2 M asetik asit içinde% 75 deasetile kitosan eritin. Bu çözeltiye 7-9% gliserofosfat (ağırlık / ağırlık) ekleyin. çözeltisi hazırlayınverilmesinden hemen önce, ve kullanılana kadar 4 ° C &#39;de hidrojel saklayın. NOT: CGP-hidrojel bu sıcaklıkta orta viskoz ama hala enjektabl olduğunu. 4 ° C altında bu uygulanmasını bloke bir katı faza dönüşür. Uygulamadan sonra, CGP 37 ° C&#39;de yaklaşık 15 dakika içinde, bir yarı-katı jel bir faz geçişi maruz kalır. </li><li> kullanılana kadar 4 ° C&#39;de kısım (0.5 mL), ticari RL tamponu saklayın. </li></ol></li></ol> 4. Mikrocerrahi Prosedürleri <ol><li> Uçucu madde ajanlar (örneğin, izofluran) ardından, sedatif ve analjezik ketamin göre kombinasyonlar (yani ketamin 100 mg / kg, medetomidin 0.05 mg / kg ve 0.025 mg / Kg phentanile) intraperitonal enjeksiyon yolu ile, genel anestezi neden. <ol><li> Enjekte maddelerin uygulanması sonra, fare burun anestezik facemask ayarlamak ve izofluran buharı O 2 kaynağı bağlayacak. sırasında inhalasyon anestezi korumakmikrocerrahi ve ayak tutam refleks ve solunum paterni ile anestezi uçağı izlemek. refleks tamamen mülga ve fare normal nefes sunduğunda cerrahi hazırlık başlar. </li><li> Bütün işlem boyunca ısıtma yastıkları ile vücut ısısını korumak ve hidroksipropil metilselüloz bazlı jel ile kornea keratit gözleri korumak. </li></ol></li><li> Steril örtüler kullanarak temiz cerrahi zemin hazırlayın. cerrahi öncesi cam boncuk sterilizatör ile mikrocerrahi aletleri sterilize. Bütün cerrahi işlem sırasında steril koşullar (steril eldiven, örtüler, cerrahi aletler, vb) koruyun. </li><li> Mikrocerrahi <ol><li> Bullostomy Not: Bullostomy tek taraflı bir işlemdir. Fare bir kulağını işletmek ve kontrol olarak kontralateral kulak kullanın. <ol><li> Bir dekübit yatar pozisyonda fare yerleştirin. için makası kullanarak boyun ventral yüzeyinde cerrahi alan hazırlayınkürk çıkarın. povidon iyot bazlı antiseptik solüsyon ile cilt temizlenir ve steril örtüler ile örtün. </li><li> Bir neşter kullanılarak, köprücük kemiğinin için çeneden alınan 2 cm boyuna kesi yapmak. </li><li> cerrahi mikroskop ile büyütme altında, submandibuler bezleri belirlemek ve forseps ile hem ayırın. submandibuler bezleri geri çekin ve digastricus&#39;un kökeni ve yüz siniri lokalize. </li><li> Timpanik bulla yatan alt-medial açığa bir makas ile digastricus&#39;un kökenli bir kesi yapmak ve ventral onu geri çekin. </li><li> 27 G iğne (Şekil 2A) ile içine delerek bül bir açıklık olun. Stapes arter ve RW membran kaudal ona (Şekil 2B) yerelleştirilmesine. emilebilir jelatin sünger ile delinmiş alanda kan temizleyin. </li><li> 34 G kateter ve cam mikro şırınga kullanarak, yavaş yavaş 3-5 μ enjekteRW niş doğrudan bullostomy taşıtın çözeltisi (CGP hidrojel ya da R), L (şekil 2C) doldurulması suretiyle hazırlanabilir. doku yapıştırıcısı 1-2 damla ile bullostomy mühür. </li><li> başlangıç ​​pozisyonuna submandibuler bezleri dönün ve 5-0 ipek cerrahi dikiş ile cilt kesiler kapatın. Bir klorheksidin tabanlı önlemek için kesi çevresinde antiseptik yara enfeksiyonu uygulayın. Not: emilebilir ve emilemeyen dikiş kullanılabilir. Emilmeyen dikişlerle 2 hafta içinde uzaklaştırılmalıdır. kullanımı kesi enfeksiyonu ve lokal doku reaksiyonları ile ilişkili olduğundan ipek cilt kapatılması için tavsiye edilmez. </li></ol></li><li> İkili transtimpanik enjeksiyon <ol><li> Lateral dekübit pozisyonunda fare yerleştirin ve 4.3.1.1 de açıklandığı gibi dış kulak yolu altında aseptik cerrahi alanı hazırlamak. </li><li> tragus ve s yakın dış kulak kanalının dikey kısmında 0.5 cm boyuna kesi yapmak(Isteğe bağlı) kulak kepçesi iç deri kat ection. </li><li> Cerrahi mikroskop (Şekil 2E) kullanarak dış kulak kanalının sonunda kulak zarı bulun ve malleusun koldan anterior ve posterior bölümlere ayrılmıştır üst pars flaccida ve alt pars tensa tespit (Şekil 2F) . </li><li> Pars flaccida kuyruk kısmında küçük bir myringostomy yapın. Enjeksiyon 33 sırasında hava tahliyesi sağlamak için, kulak zarının pars tensa ek kesi yapmak. Yavaşça aracın 10-15 uL (CGP hidrojel ya da R) orta kulak açık dolana kadar RW niş yakın pars flaccida ile 34 G kateter bağlı bir cam mikro şırınga ile çözelti enjekte edilir. </li><li> 4.3.1.7 açıklandığı gibi 5-0 ipek cerrahi sütür ile cilt kesiler kapatın ve temiz. </li><li> onun diğer tarafında ve oper üzerinde fare yerleştirinkontralateral kulak yedik (4.3.2.5 4.3.2.1-için adım). </li></ol></li></ol></li><li> sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar bir ısıtma pedi üzerinde fare tutun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin. </li><li> vücut durumu, aktivite ve ağrı ya da stres belirtileri varlığını izleyin. Gerekirse analjezikler sağlanması (yani, Buprenorfin 0.05 mg / kg, karprofen 5-10 mg / kg). günlük cerrahi yara gözden geçirin ve postoperatif yara iyileştikten olduğunu doğruladıktan sonra cilt kapanışları 7-14 gün kaldırın. </li></ol> Koklear hücre mimarisini 5. Morfolojik Değerlendirilmesi <ol><li> Ameliyat uzun süreli etkilerini incelemek için intraperitoneal pentobarbital aşırı dozda (100 mg / kg) ile, (bu iş 28 gün postmicrosurgery olarak) deney sonunda fare öldürülür. </li><li> Soğuk 0.1 M fosfat tamponlu bir transcardial perfüzyon gerçekleştirme0.1 M PBS içinde% 4 (ağırlık / hacim) paraformaldehid (PFA), ardından tuzlu su (PBS), pH 7.5, pH 7.5 26 tarif edildiği gibi. DİKKAT: Paraformaldehyde çok zehirlidir; cilt, göz veya mukoza ile temasından kaçının. ölçme ve hazırlanması sırasında toz solumaktan kaçının. </li><li> Vestibüler ve iç kulak koklear bileşenlerini ayırmadan 34, 35 anlatıldığı gibi temporal kemik iç kulak dışarı incelemek için Stereomikroskopta kullanın. </li><li> hafifçe çalkalanarak 12 saat boyunca 4 ° C&#39;de 0.1 M PBS, pH 7.5 içinde% 4 (ağırlık / hacim) PFA izole iç kulak düzeltildi. 0.1 M PBS, pH 7.5 ile 5 dakika boyunca yıkama 3x. </li><li> EDTA solüsyonu her 3 değiştirme D, sabit şekilde çalkalanarak 10 d, 4 ° C &#39;de 0.1 M PBS, pH 6.5 içinde hazırlanır,% 10, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile örnekleri kirecini. </li><li> cochleae yumuşak kıvam elde zaman, EDTA çıkarın ve 0.1 M PBS, pH 7.5, wi ile 5 dakika süresince 3X yıkamaOda sıcaklığında çalkalanarak Th. </li><li> Açıklanan 34 olarak parafin örnekleri embed ve 7 mikron kalınlığında koklear kesitler modiolus paralel olun. </li><li> Koklear hücre mimarisini, hematoksilen ve eozin (H &amp; E) 30 ile leke bölümleri değerlendirmek ve 4X ve 20X lensler ile görüntü yakalamak için bir dijital fotoğraf makinesine bağlı bir ışık mikroskobu kullanın. </li></ol> 6. Koklear Gen İfadesi <ol><li> RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile çalışma yüzeyi ve cerrahi aletler temizleyin. </li><li> Bir mikroskop kullanılarak temporal kemik, iç kulak teşrih hızla 5.1 anlatıldığı gibi fare Euthanize. Ribonükleik asit (RNA) koruyucu ve sabitleyici bir reaktif ihtiva eden bir cam tabak içinde iç kulak bırakın. </li><li> Kuyumcu forseps ile kalan Petröz kemiği kaldırmak ve yavaşça Vanna göz makas 35 kullanılarak vestibülden koklea ayırın. </li><li> hemen transfer 80 uL RNA koruyucusu ve stabilizatör çözeltisi ile 2 mL mikrosantrifüj tüpe koklea ve kuru buz tüpü yerleştirerek doku dondurma. kullanılana kadar -70 ° C &#39;de koklear örnekleri korur. </li><li> 35 açıklandığı gibi koklear RNA izole ve spektrofotometrik kalitesini ve miktarını belirlemek. </li><li> Bir ters transkripsiyon ticari kit kullanılarak toplam fare RNA eşit miktarda gelen koklear cDNA oluşturun. </li><li> Gen transkript 35, 36 ölçmek için üç kopya halinde tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) amplifiye etmek için qRT-PCR gerçekleştirin. NOT: Bu çalışma yanlısı ve IL1b, IL6, TGFb1, TNFa, IL10 ve DUSP1 anti-enflamatuar gen transkript ölçüldü. </li><li> Referans gen düzeyinde aritmetik ortalama ve normalize ederek göreceli ölçümü hedef transkript döngüsü eşiği (Ct) düzeyleri normale göre göreceli ifade oranları hesaplamakSorun grubu kalibratör grubunun 37 aritmetik ortalamaya transkript seviyeleri. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Iç kulağa lokal ilaç dağıtım orta kulak 4, 19, 39, ilacın yerleştirerek intratimpanik uygulama ile doğrudan intrakoklear enjeksiyonla ya da dolaylı olarak yapılabilir. Intrakoklear yönetim bazal-apikal konsantrasyon eğimleri ve boşluk östaki borusu yoluyla, pencere zarları aracılığıyla yayılmasını önlemek, kontrol ve cochlea&#39;ya hassas ilaç dağıtım sağlar. Ancak, karmaşık ve hassas mikrocerrahi 7, 39 gerektiren son derece invaziv bir işlemdir genellikle. Bu bağlamda, endüstri sürekli ilaç salımı, 40, 41 için yeni, kaplamalı, implante edilebilir cihazlar geliştirmektedir. Diğer taraftan, İntratimpanik Yönetim d daha büyük hacimli enjeksiyon sağlayan bir minimal invaziv ve uygulaması kolay bir işlemdirfarmakokinetiği kontrol etmek kolay değildir, ancak, orta kulak içine halı. Ilacın çoğunun östaki borusu yoluyla temizlenir ve geri kalan kısmı koklea 18 ulaşmak için RW zar içinden difüze olması gerekmektedir. RW koklea 7 perilenf dolu timpanik kanal içine orta kulak maddelerin maksimum absorpsiyon sitedir. Geçirgenlik madde özellikleri (boyut, konsantrasyon, çözünürlük ve elektriksel yük) ve zar-ötesi taşıma sistemleri (difüzyon, aktif taşıma ve fagositoz) 42 bağlıdır, ancak bu, bir yarı-geçirgen, üç tabakalı bir yapıdır. Oval pencere ve otik kapsül koklea 43, 44 alternatif ama daha az etkili girişi vardır. Burada göstermek ve hedefli ilaç fare orta kulak içine teslimat için iki mikrocerrahi yöntemleri karşılaştırmak: bullostomy ve transtympaNIC enjeksiyon işlemleri. Bu işlemlerin Ortak kritik adımlar şunlardır: i) işitme bir değerlendirme öncesinde ve mikrocerrahi sonrası, ii) steril koşullarda homojen bir araç çözeltisinin hazırlanması, iii) anestezik prosedür ve hayvan vücut sıcaklığı ve sabitler izlenmesi dikkatli denetim, iv moleküler ve morfolojik analiz tamamlamak için koklear numune almak) yavaş RW hedefleyen aracın uygun hacimde yerleştirme, ve iv). Bullostomy için retroauriküler ve ventral yaklaşımlar, 45 7 tarif edilmiştir. Bizim deneyim daha az morbidite sonuçlandı ve RW 46 daha iyi erişim sağlanan çünkü ventral yaklaşım kullanılır. Transtimpanik enjeksiyonlar genellikle pars kulak zarı tensa üzerinden yürütülmektedir, malleus manubrium 12 anterior veya posterior. İçindeBu çalışma da enjeksiyon sırasında hava tahliyesi sağlamak için pars Tensa önceki bir ek delik ile malleusun ötesinde pars flaccida üzerinden teknik, bir enjeksiyon bir modifikasyonunu yapıldı. Her iki microsurgeries hızlı (bullostomy ve sırasıyla transtimpanik yaklaşım kulağa başına 20 ve 5 dk) olmasına rağmen transtimpanik enjeksiyon kısa postoperatif iyileşme süreleri ve hiçbir morbidite ile, bullostomy daha az invaziv oldu. En önemlisi, her iki işlemler işitme sürdürdü ve ABR parametreleri mikrocerrahi önce tespit edilenlerle aynıydı. transtimpanik yaklaşım bullostomy daha az zaman alır ve aynı müdahale sırasında aynı hayvanın her iki kulakta gerçekleştirilebilir. transtimpanik enjeksiyon avantajları eğer istenirse, iki taraflı yapılmış ve tekrar edilebilir, böylece bulunmaktadır. Öte yandan, bullostomy RW membrana doğrudan görsel erişimi ve Filli sağlarRW niş ng. Bunun aksine, transtimpanik enjeksiyonu RW niş araç yerleştirme kontrolü için izin vermez. Bu çalışmada bildirilen prosedürler gibi işitme kaybı ototoksisite ve etkinlik değerlendirilmesi değerlendirilmesi olarak klinik öncesi uygulamalar için orta kulağa yerel bir uyuşturucu araç teslimatı gerçekleştirmek açıklanmıştır. İki mikrocerrahi prosedürleri belirli avantajları ve dezavantajları ile alternatif yöntemler sağlamak tarif edilmiştir. Hem işitme korumak ve morfolojik değişikliklere neden olmaz. Yerel enflamasyon bullostomy potansiyel bir komplikasyonu olarak tarif edilmektedir. tamamlayıcı teknikler seti de işitme, morfolojik ve inflamatuar belirteç ifade değerlendirmeler de dahil olmak üzere ameliyat sonrası prosedürler için tarif edilmiştir. Bu tekniklerin Gelecek uygulamalar hayvan modellerinde, genetik hücresel ve farmakolojik yaklaşımlar da dahil olmak üzere kaybı, işitme yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirilmesini içermektedir. intratimpanik administratiyonları belirgin koklear zarar vermeden perilenf içine geçişini kolaylaştırmak, yuvarlak pencere membranı ile temas halinde, orta kulakta tedavi teslim edilmesini sağlamak.

Işitme bozukluğu (en sık insan duyu açığı ve dünya nüfusunun% 5,3 ve 65 yaş üstü bireylerin% 30&#39;unu etkilemektedir <a href="http://www.who.int/topics/deafness/en">http://www.who.int/topics/deafness/en</a> 2016 güncelleme). İşitme kaybı çocuklarda dil edinimi etkiler ve yaşlı kişilerde bilişsel gerileme hızlandırır. Bu nedenle, büyük bir sosyo-ekonomik etkisi olan önemli bir sağlık sorunudur. Bu genetik bozukluklar, çevresel faktörler ya da sonunda salyangozu hasar ve saç hücreleri ve nöron ölümüne indüklemektedir 1 &#39;e ait bir kombinasyonu ile kaynaklanabilir. Bu hücreler bu nedenle hücresel kaybı ve eşlik eden işitme kaybı geri alınamaz, memelilerde yeniden yoktur. Klinik seçenekler işitme cihazları ve koklear, orta kulak ve kemik iletim implantlar 2 olmak üzere protez dayanmaktadır. Ne yazık ki, hiçbir özel tıbbi restoratif trea vardırişitme için departmanlarında ve böylece çeşitli araştırma çizgileri önleyici ve onarıcı tedavilerin geliştirilmesi üzerinde duruldu. Yeni tedavi seçenekleri farmakolojik tedavi 2 gen ve hücre terapileri gibi küçük moleküllerin geliştirilmesini içerir. koklear farmakolojik tedaviye en önemli zorluklardan biri ilaç dağıtım olduğunu. Sistemik tedavi nedeniyle kan labirent bariyer 3 kokleadaki sınırlı bir etkiye sahip, dolayısıyla iç kulağa madde geçişini sınırlayan, iç kulak sıvı homeostazı sürdürmek için fiziksel ve biyokimyasal bir bariyer gibi davranan koklear kan damarları ile temas halinde, sürekli endotelyum. geçirgenliği diüretik veya ozmotik maddelerin kullanımı ile koklear inflamasyon sırasında artmış ve yapıda olabilir ancak, sadece küçük bir yağda çözünen moleküllerine geçirgendir. Sonunda sistemik uygulama, indirgenmiş sonra koklea ulaşan ilaç miktarı;Bu nedenle, organik toksisiteye neden olabilir yüksek dozlarda gereklidir. Buna ek olarak, ilacın hepatik metabolizmasının toksik veya aktif olmayan metabolitleri 4, 5, 6, 7 üretebilir. Buna karşılık, lokal müdahaleler istenmeyen yan etkilere 4, 7, 8, 9 olmayan orta ve iç kulak içine ilacın bilinen bir sınırlı miktarda yerleştirilmesini sağlar. Mevcut klinik uygulamada, intratimpanik yönetimler gibi Meniere hastalığı 10 gentamisin gibi bazı koklear patolojiler, sınırlı, ani sağırlık içinde kortikosteroidler, Meniere hastalığı, immün aracılı, 1 13, 12, 11, ve gürültüye bağlı işitme kaybıAni sağırlık 4, 16, 17 4, 15 ve insülin-benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1). Yerel uygulama için formülasyonlar koklear sıvıların hassas homeostazisini (pH ve osmolarite) muhafaza edilmelidir. Buna ek olarak, beyin-omurilik sıvısı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için işlem boyunca sterilite sağlamak için çok önemlidir. ilaç verilmesi için kullanılan bir yardımcı nonototoxic, biyolojik olarak uyumlu ve uygun bir süreklilikle yapılmalıdır. Sıvı çözeltiler bağlı östaki borusu ile temizlenmesi için intrakoklear enjeksiyonlar için tavsiye edilir, ancak intratimpanik şekli için uygun değildir. Bu durumda, ilaçlar genellikle orta kulak 4, 18, 19 kalıcılığını artırmak için yarı-katı jeller tarafından taşınır. Alternatif dağıtım systeiç kulak ilaç geçişini artırmak için taşıyıcı olarak kullanılan ms nanopartiküller 20 ve Burada 21 adenovirüsler iki araç karşılaştırıldığında: CGP ve RL çözüm. CGP çitosan ile oluşturulan bir hidrojel, D-glukozamin ve kabuklu deniz elde edilen N-asetil-D-glukozamin ve β-gliserofosfat, kitosan zincirleri üzerinden su bir kalkan oluşturur ve bunu muhafaza eden bir poliol oluşan bir lineer polisakkarittir sıvı halini alır. CGP ısıya ve orta kulak 22, 23, 24, 25 sürekli bir ilaç salımı sağlayan lysozymes ile parçalanabilir. Kitosan bazlı hidrojellerin bağlı immunojenisite ve lokal iltihabik reaksiyonlara, 23, 24 aktivasyonu eksikliği bunların olmaması gibi ilaç verme gibi klinik uygulamalar için uygun araçlardır. oth üzerindeer El, RL tamponu, özellikle kan kaybı, travmalarda, su ve elektrolit bir kaynağı olarak insanlarda damar içine uygulama için amaçlanan bir pirojenik olmayan izotonik çözeltisi (273 mOsm / L, pH 6.5) ya da laktat metabolizmasının yan nedeniyle yanık karaciğerde asidozu karşı. Burada tarif ve fare iç kulağa yerel uyuşturucu teslimat için rafine edilmiş iki cerrahi yöntemleri karşılaştırır. Her iki teknik güvenlilik profili, fonksiyonel morfolojik ve moleküler testleri kullanılarak değerlendirildi. İşitme İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) 26, 27 öncesi ve farklı zamanlarda mikrocerrahi sonra gerçekleştirilen kullanılarak değerlendirildi. Uç nokta prosedürleri bu iki Mikrocerrahi prosedürleri, anatomik hücresel ve moleküler etkiye koklea incelemek ve karşılaştırmak için kullanıldı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1375">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:455px;">Ketamine (Imalgene)</td>
			<td style="width:251px;">Merial</td>
			<td style="width:207px;"># 2529</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Xylacine (Xilagesic)&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Calier</td>
			<td style="width:207px;"># 6200025225</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Lubricant eye gel (Artific)</td>
			<td style="width:251px;">Angelini</td>
			<td style="width:207px;"># 784710</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Water pump&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Gaymar</td>
			<td style="width:207px;"># TP472</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Subdermal needle electrodes&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Spes Medica</td>
			<td style="width:207px;"># MN4013D10SM</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Low Impedance Headstage&#160; (RA4LI)</td>
			<td style="width:251px;">Tucker-Davis Technologies</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker)</td>
			<td style="width:251px;">Tucker-Davis Technologies</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:455px;">System 3 Evoked Potential Workstation</td>
			<td style="width:251px;">Tucker-Davis Technologies</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;">The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">SigGenRP software</td>
			<td style="width:251px;">Tucker-Davis Technologies</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Warming pads (TP pads)</td>
			<td style="width:251px;">Gaymar</td>
			<td style="width:207px;"># TP3E</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Statistics software (SPSS)</td>
			<td style="width:251px;">IBM</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Chitosan (deacetylated)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;"># C3646</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:455px;">Acetic acid (glacial)</td>
			<td style="width:251px;">VWR</td>
			<td style="width:207px;"># 20103.295</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION: flammable liquid, skin corrosion and respiratory and skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Glycerophosphate</td>
			<td style="width:251px;">Sigma</td>
			<td style="width:207px;"># SLBG3671V</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Ringer&#180;s lactate buffer</td>
			<td style="width:251px;">Braun</td>
			<td style="width:207px;"># 1520-ESP</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Medetomidine (Domtor)</td>
			<td style="width:251px;">Esteve</td>
			<td style="width:207px;"># 02400190</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:455px;">Phentanile (Fentanest)</td>
			<td style="width:251px;">Kern Pharma</td>
			<td style="width:207px;"># 756650.2</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION: &#160;&#160;avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:455px;">Isoflurane (IsoVet)</td>
			<td style="width:251px;">Braun</td>
			<td style="width:207px;"># 469860</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed one hour.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Surgical microscope (OPMI pico)</td>
			<td style="width:251px;">Zeiss</td>
			<td style="width:207px;"></td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Sterile drape (Foliodrape)</td>
			<td style="width:251px;">Hartmann</td>
			<td style="width:207px;"># 277546</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Sterilizer&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:207px;"># 18000-45</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Scalpel blade</td>
			<td style="width:251px;">Swann Morton</td>
			<td style="width:207px;"># 0205</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:207px;"># 91003-12</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Pividone iodine based antiseptic (Betadine)</td>
			<td style="width:251px;">Meda Pharma SAU</td>
			<td style="width:207px;"># M-12207</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Adventitia scissors (SAS18-R8)</td>
			<td style="width:251px;">S&#38;T</td>
			<td style="width:207px;"># 12075-12</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Curved scissors</td>
			<td style="width:251px;">CM Instrumente</td>
			<td style="width:207px;"># AJ023-18</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Forceps</td>
			<td style="width:251px;">CM Instrumente</td>
			<td style="width:207px;"># BB019-18</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Gelatine sponge (Spongostan)</td>
			<td style="width:251px;">ProNaMAc</td>
			<td style="width:207px;"># MS0001</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Microlance 27G</td>
			<td style="width:251px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:207px;"># 302200</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Microliter syringe (701 RN SYR)</td>
			<td style="width:251px;">Hamilton</td>
			<td style="width:207px;"># 80330</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Catheter (Microfil 34G)</td>
			<td style="width:251px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:207px;"># MF34G-5</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Tissue Adhesive (Vetbond)</td>
			<td style="width:251px;">3M</td>
			<td style="width:207px;"># 1469SB</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Needle holder (Round handled needle holder)&#160;</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:207px;"># 12075-12</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Silk surgical suture (Braided Silk 5/0)</td>
			<td style="width:251px;">Arago</td>
			<td style="width:207px;"># 990011</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Chlorhexidine (Cristalmina)</td>
			<td style="width:251px;">Salvat</td>
			<td style="width:207px;"># 787341</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:455px;">Pentobarbital&#160; (Dolethal)</td>
			<td style="width:251px;">Ventoquinol</td>
			<td style="width:207px;"># VET00040</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION: &#160;&#160;avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Stereomicroscope (Leica)</td>
			<td style="width:251px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:207px;"># MZ75</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action</td>
			<td style="width:251px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:207px;"># 28483</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Jeweller&#8217;s forceps (Dumont)</td>
			<td style="width:251px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:207px;"># 11252-00</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">RNase Decontamination Solution&#160; (RNaseZap)</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;"># R2020</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">RNA Stabilization Solution&#160; (RNAlater)</td>
			<td style="width:251px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;"># R0901</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Purification RNA kit (RNeasy)</td>
			<td style="width:251px;">Qiagen</td>
			<td style="width:207px;"># 74104</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:251px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:207px;"># 4368814</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="154" rowspan="1" style="height:154px;width:455px;">Gene expression assay (TaqMan probes)</td>
			<td rowspan="1" style="width:251px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td height="22" style="height:22px;width:207px;">Il1b: Mm00446190_m1 
			Il6: Mm00446190_m1 
			Tgfb1: Mm01178820_m1 
			Tnfa: Mm99999068_m1 
			Il10: Mm00439614_m1 
			Dusp1: Mm00457274_g1 
			Hprt1: Mm00446968_m1</td>
			<td rowspan="1" style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:455px;">Real-time PCR System (7900HT)</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">Applied Biosystems</td>
			<td rowspan="2" style="width:207px;"># 4329001</td>
			<td rowspan="2" style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:251px;">Merck</td>
			<td style="width:207px;"># 1040051000</td>
			<td style="width:464px;">TOXIC: PFA is a potential&#160;carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:455px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:251px;">Merck</td>
			<td style="width:207px;"># 405491</td>
			<td style="width:464px;">CAUTION:&#160; harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if 
			inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Hematoxylin solution</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;"># HHS16</td>
			<td style="width:464px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:455px;">Eosin Y</td>
			<td style="width:251px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:207px;"># E4382</td>
			<td style="width:464px;">Hazards: causes serious eye irritation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative study of drug delivery methods targeted to the mouse inner ear: bullostomy versus transtympanic injection

o iç kulak ulaşabilir böylece orta kulağa spesifik ilaç verilmesi için kemirgenlerde iki minimal invaziv mikrocerrahi teknikler mevcut. İlk prosedür bullostomy olarak adlandırılan, timpanik bulla perforasyon oluşur; İkincisi bir transtimpanik enjeksiyon olduğunu. Her ikisi de insan klinik intratimpanik prosedürleri taklit. Çitosan-gliserofosfat (CGP) ve Ringer&#39;s laktat tampon maddesi (RL) Yerel ilaç verilmesi için biyolojik olarak uyumlu araç olarak kullanılmıştır. CGP yaygın farmasötik uygulamalarda kullanılan, toksik olmayan bir biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer. Bu, oda sıcaklığında viskoz bir sıvı ama vücut sıcaklığında yarı katı faza congeals. RL insanlarda intravenöz yönetimlerin için kullanılan bir izotonik bir çözümdür. bu araç bir küçük hacimli hassas bir şekilde bullostomy aracılığıyla Yuvarlak Pencere (RW) niş yerleştirilir. Bir transtimpanik enjeksiyon orta kulağı doldurur ve daha az kontrol ama iç kulağa daha geniş erişim sağlar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; her iki tekniğin güvenlik profilleri incelenmiş ve fonksiyonel ve morfolojik testler kullanılarak karşılaştırıldı. İşitme İşitsel Beyin Sapı önce Yanıt (ABR) ve mikrocerrahi sonra birkaç kez kayıt değerlendirilmiştir. Kohleanın hücre mimarisini ve koruma seviyesi paraformaldehid sabit ve dekalsifiye koklear örneklerinde geleneksel histolojik teknikler ile incelendi. Buna paralel olarak, sabitlenmemiş koklear örnekleri alındı ​​ve hemen kantitatif Ters Transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT-PCR) ile inflamatuvar belirteçler gen ekspresyon profillerini analiz etmek için donduruldu. transtimpanik enjeksiyon bullostomy kıyasla daha az invazif olduğunu kanıtladı rağmen iki prosedür, fare orta kulak içine ilaç verme yöntemleri olarak uygundur.

İşitme işitsel fonksiyon (Şekil 1A) üzerindeki etkisini değerlendirmek için mikrocerrahi sonra önce ABR tarafından ve birkaç kez test edildi. ABR kaydolur hayvan hareketi ve gerilim eserler önlemek ve bu nedenle tekrarlanabilirlik 27 artırmak için anestezi altında gerçekleştirildi. Intraperitoneal ketamin tabanlı kombinasyonları uygulanabilir veya inhalasyon izofluran genellikle ABR testleri sırasında hayvanların uyutmak için kullanılmıştır. ABR kayıtları yaparken ketamin / ksilazin kombinasyonu kısa etkili (2-3 dk) uyarma ve istikrarlı, güvenli bakım aşamasını sağlar. Izofluran ABR ölçme hassasiyetini 38 etkileyebilir unutulmamalıdır. ABR kayıtları için, deri altı elektrotlar belirli yerler (Şekil 1B) içine yerleştirilir ve elektriksel direnç ölçülür. empedans 3 kOhm veya daha yüksek ise, elektrot yerleştirme alt önlemek için kontrol edilmelidirABR dalga genlik denle. İntratimpanik dağıtım iki mikro işlemler (Şekil 2) farelerde gerçekleştirilir. Bullostomy sırasında bül pozlama submandibuler bezleri ve digastricus&#39;un geri çekilmesini gerektirir. Karotis arter ve vagus sinir çok yakın (Şekil 2A) çünkü bu işlem çok dikkatli yürütülür. Sonraki, bül stapes arter ve RW membran (Şekil 2B) lokalize delinir. kemik çatlamasını önlemek için, küçük bir 0.5 mm&#39;lik bir açıklık delme önce 27 G iğne ile yapılır. 34 G kateter RW membran ve aracın küçük bir hacme doğru bullostomy boyunca yönlendirilir penceresi hücresi (Şekil 2C) üzerine verilir. Transtimpanik enjeksiyon pars bir kesi ile gerçekleştirilir 27 G iğne ile kulak zarı flaccida; de sebep olabilir büyük bir tekzar kulak. Enjeksiyon öncesinde, biz aracın (Şekil 2F) enjeksiyon sırasında havanın akışına izin vermek için pars tensa ek bir kesi yaparak öneririz. Yaşamı tehdit eden kanamaya yol açacak stapes arter, internal karotis arter dalı, bir hasarı önlemek için kritik öneme sahiptir. Olmayan çalışan denetimleri (Şekil 3) benzer deney boyunca işitme korunmuş bullostomy veya transtimpanik ameliyatları ile fareler. tıklama ve ton patlamaları tepki ABR eşikleri bazal değerlere göre mikrocerrahi sonra önemli bir değişiklik olmadı. Anlamlı bir fark bullostomy ve transtimpanik yaklaşımlar arasında gözlenmiştir. Morfolojik çalışmalar orta kulak içine doğru araç teslim onaylamak ve koklear hücre mimarisini de işlemleri nedeniyle potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için yapılmıştır. Ana koklear bölgeler s hiçbiriHer iki prosedürlerden howed morfolojik değişiklikler ve hayvanların tüm Kohleanın (Şekil 4A) benzer bir morfoloji sundu. Buna ek olarak, pro- ve anti-enflamatuar sitokinlerin gen ekspresyonu için koklear profilleri de incelenmiştir. Iki prosedür arasında ABR veri fonksiyonel farklılıklar olmamasına rağmen, bullostomy transtimpanik yaklaşımı (Şekil 4B) daha güçlü bir enflamatuvar yanıtı neden oldu. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig1.jpg" /> Şekil 1. Deney Tasarımı ve İşitme Değerlendirme. Deneysel prosedür (A) Diyagram. İşitme önce ve mikrocerrahi sonrası ABR ile değerlendirildi. Koklear numuneler 28 gün mikrocerrahi sonra elde edildi. (B) deri altı elektrotlu bir ses zayıflatıcı bölmesi içindeki ısıtma pedi üzerinde yüzükoyun pozisyonda anestezi fare,Kafatasının (aktif, pozitif) ve tepe üzerinde kulağı arasında kafa derisi yerleştirilen es; kulak kepçesi (referans, negatif) altında parotis bölgesinde ve arka (toprak) olarak. serbest alan hoparlör sağ kulak bakan sabit bir mesafeye (5 cm) yerleştirilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54951/54951fig2.jpg" /> Araç Uygulaması için Şekil 2. Mikrocerrahi. (A) timpanik bulla alttan görünüşü. bullostomy 27 G iğne ile fasiyal sinirin için kaudal yapılır. (B) RWN ve stapedial arter perforasyonu vasıtasıyla gözlenebilir. (C), 34 g kateter RW niş doğru bullostomy boyunca yönlendirilir. (D) bullostomy bir ay sonra, küçük bir kemikskar açılış sitesinden (ok başı) mevcuttur. Dış kulak kanalına kesi ve kulak zarı (kare) gösteren (E) kulak Yanal görünümü. Kulak zarının (F) Detay. Bir ponksiyon (pars flaccida içinde, siyah yıldız) 27 G iğne kullanılarak kulak zarı kaudal üst kadranda yapıldı; Enjeksiyon 34 G kateter kullanılarak bu perforasyon ile yapıldı. Ek bir delik kulak basıncını dengelemek için enjeksiyondan önce (pars tensa olarak, beyaz yıldız) zar kranial alt kadranda yapıldı. Kulak zarı delik yoluyla 34 g kateterin (G) bakın. Mikrocerrahi sonrası koklear bölge 24 saat (H) Resmi. RWN araç solüsyonu (yıldız) ile doldurulmuş. Yanal, Lat; Ro, rostral; , Dorsal yapmak; Ma, malleus; Co, koklea; OW, Oval pencere; RWN, yuvarlak pencere niş. Ölçek çubukları = A, D, F, 200 um; Ölçek çubukları =<html> 100 B, C, H um; Ölçek çubukları = E 1.000 mikron G. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54951/54951fig3.jpg" /> 3. İşitme Değerlendirme rakam. ABR eşikleri (dB SPL ± SEM, ortalama) yanıt olarak Evrimi tıklayın (A) ve sesi patlaması (B) uyaranlara, erkek sekiz haftalık C57BL / 6J mikro-cerrahi sonrası 14 ve 28 gün önce ve 7 fareler. Bullostomy (turuncu; n = 11); transtimpanik enjeksiyonu (mavi; n = 6); olmayan çalışan (gri; n = 11), <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig3large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> jpg &quot;/&gt; Şekil 4. Koklear Morfoloji ve Gen İfadesi Analizi. Koklea dibinde ana Kohleanın (A) Morfoloji. Bir ay bullostomy ya transtimpanik enjeksiyon ile mikro müdahalesinden sonra orta modiolar parafın olmayan ameliyat farelerin kulak bölümlerine (7 um), ve farelerde Haematoxilin-eozin boyaması. Skala ortam bölmesi (a, b, c) tüm ana bileşenleri sunulur. Bu yapılar (numaralı kutular) her birinin bilgileri daha sonraki resimlerde gösterilmiştir: spiral ganglion (1), çorti organı (2), spiral ligaman (3) ve stria vaskularis (4). İç saç hücresi (yıldız); Dış saç hücreleri (ok başı). Ölçek çubukları = a, b, c, 100 um; Ölçek çubuklar-1,2,3,4 50 mikron =. (B) 28 gün mikrocerrahi sonrası inflamatuar belirteçlerin Koklear ifadesi. bullostomy (turuncu) ve transtimpanik enjeksiyon (mavi) arasında olan ve olmayan çalışan farelerin (beyaz) karşılaştırılması. *: Non-çalışan vsameliyat grupları; ^: Ameliyat gruplar arasında karşılaştırılması. ΔΔCt, ya da olmayan ameliyat group.Values n-kat fark göreceli durum başına 3 fare Havuzu örneklerinden Üçlü parçaların ortalama ± SEM olarak sunulmuştur - gen ekspresyonu seviyesi 2 olarak temsil edilir. İstatistiksel anlamlılık: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ S ≤0.01; ^^^ S ≤0.001. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54951/54951fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection at JoVE.com

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Fare İç Kulak Hedefli İlaç Dağıtım Yöntemleri Karşılaştırmalı İncelemesi: Bullostomy<em&gt; Karşı</em&gt; Transtimpanik Enjeksiyon

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

a-comparative-study-drug-delivery-methods-targeted-to-mouse-inner-ear

Research

JoVE Journal

Biology

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

13.1K Görüntüleme.  Instituto de Investigaciones Biomédicas (IIBm) Alberto Sols CSIC-UAM. Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Video: A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Kertenkeleler Hareket Hız ve Yön Visual Hassasiyet Test

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Biyoloji

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians. The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal pair and a longer maxillary pair. Barbel tissue contains cells of ectodermal, mesodermal and neural crest origin, including skin cells, glands, taste buds, melanocytes, circulatory vessels and sensory nerves. Unlike most adult tissue, the maxillary barbel is optically clear, allowing us to visualize the development and maintenance of these tissue types throughout the life cycle. 
This video shows early development of the maxillary barbel (beginning approximately one month post-fertilization) and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration in the adult appendage (&gt;3 months post-fertilization). Briefly, the left maxillary barbel of an anesthetized fish is elevated with sterile forceps just distal to the caudal edge of the maxilla. A fine, sterile spring scissors is positioned against the forceps to cut the barbel shaft at this level, establishing an anatomical landmark for the amputation plane. Regenerative growth can be measured with respect to this plane, and in comparison to the contralateral barbel. Barbel tissue regenerates rapidly, reaching maximal regrowth within 2 weeks of injury.
Techniques for analyzing the regenerated barbel include dissecting and embedding matched pairs of barbels (regenerate and control) in the wells of a standard DNA electrophoresis gel. Embedded specimens are conveniently photographed under a stereomicroscope for gross morphology and morphometry, and can be stored for weeks prior to downstream applications such as paraffin histology, cryosectioning, and/or whole mount immunohistochemistry. These methods establish the maxillary barbel as a novel in vivo tissue system for studying the regenerative capacity of multiple cell types within the genetic context of zebrafish.

The zebrafish maxillary barbel is an integumentary sense organ containing ectodermal, mesodermal and neural crest derivatives. Importantly, the adult barbel can regenerate after proximal amputation. This video introduces maxillary barbel development and demonstrates a surgical protocol to induce regeneration, followed by collection, embedding and downstream imaging of barbel specimens.

Zebra balığı Maksiller Bärbel Çalışma Yöntemleri

Barbels are skin sensory appendages found in fishes, reptiles and amphibians.  The zebrafish, Danio rerio, develops two pairs of barbels- a short nasal ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

Yüksek Verimli In situ</emFetal Fare Alt Ürogenital Yolu mRNA İfade Desenler Karakterize> Hibridizasyon Yöntemi

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of genes within the mammary epithelium has been difficult to achieve due to the lack of appropriate targeting molecules that are independent of developmental stages such as pregnancy and lactation. Herein, we describe a technique for localized delivery of reagents to the mammary gland at any stage in adulthood via intraductal injection into the nipples of mice. The injections can be performed on live mice, under anesthesia, and allow for a non-invasive and localized drug delivery to the mammary gland. Furthermore, the injections can be repeated over several months without damaging the nipple. Vital dyes such as Evans Blue are very helpful to learn the technique. Upon intraductal injection of the blue dye, the entire ductal tree becomes visible to the eye. Furthermore, fluorescently labeled reagents also allow for visualization and distribution within the mammary gland. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents, and small molecules.

A protocol for the non-invasive intraductal delivery of aqueous reagents to the mouse mammary gland is described. The method takes advantage of localized injection into the nipples of mammary glands targeting mammary ducts specifically. This technique is adaptable for a variety of compounds including siRNA, chemotherapeutic agents and small molecules.

Fare meme bezi Lokalize İlaç Teslim Intradüktal Enjeksiyon

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-iç hücre embriyonik kök hücrelerin kitle enjeksiyon daha yüksek Chimerism oranları için yol açar.

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Fare Lentiviral Gene lazer destekli teslim yumurta döllenmiş

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...