This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Hayvan araştırma tüm yönleriyle uygun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Burada açıklanan tüm omurgalı hayvan deney prosedürleri Güney Carolina&#39;nın (MUSC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) yönergelerine altında onaylanmıştır. 1. Model Seçimi <ol><li> Kullanıma hazır olana kadar kurumsal protokollere göre rutin bakıcılık ile düşük gürültü vivaryum hayvan modeli koruyun. Hayvan araştırma tesisleri (ARF&#39;lerdir) ise, NIH standartlarını karşılamak titreşim istikrar, gürültü sönümleme, gündüz aydınlatma, hazırlık alanı, yüzey bitirir, sızdırmazlık ve caulking ve havalandırma korumak. Not: ARF&#39;lerdir ve düşük gürültü vivari bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri gözden edilebilir: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ </li><li> Tüm deneyler için, deneysel kulak gibi sağ kulağını kullanın. Sol kulak içi bir hayvan kontrolü olarak hizmet vermektedir ve cerrahi değişmiş değil. </li><li> Orta veya dış kulak enfeksiyonu belirtileri için önceden ameliyat modeli hayvan kontrol edin. Potansiyel işaretler hayvanın kulak sıvı veya irin drenajı, iltihaplı pinna doku ve / veya uyuşukluk içerebilir. Bu sıradışı, ama belirtildiği takdirde, ileri cerrahi önlemek ve uygun hayvan davranın. </li></ol> 2. Ameliyat öncesi prosedürler <ol><li> Ameliyat öncesinde ve ketamin (100 mg / kg IP) ve xylazine (20 mg / kg IP) intra-peritoneal (IP) enjeksiyon yoluyla bir perioperatif prosedürlere hayvan, 30 dakika anestezisi. Pozitif ayak parmağı sıkıştırma refleks ile değerlendirildiği gibi ketamin (25 mg / kg IP) ve xylazine (5 mg / kg IP) daha düşük bir doz ile, gerektiğinde anestezi Supplement. Doz yaşa uygun ayarlamaları ile fareler için kurumsal izin protokoller uyarınca dozaj belirleme. </li><li> Tam s için kontrol edinModelin edation. Düzenli nefes oranı, bir (farelerde) refleksi eksikliği ve pedalı ve üst kapağında eksikliği (ayak-tutam) refleksleri ile işaretlenmiş açıklanan protokol bütünlüğü için anestezi aşaması 3 düzlemde kontrol edin. Anestezi bu düzeyde hayvan koruyun. Bu ameliyat sırasında ağrı ve ameliyat hareketi, kanama ve interstisyel sıvıların sızıntı azaltılması için her şeyden önemlidir. </li><li> Kapalı döngülü bir ısıtma yastığı ile 37.5 ° C &#39;de, hayvanın vücut sıcaklığı muhafaza edin. </li><li> Buprenorfin subkutan enjeksiyon yoluyla analjezi yönetin. Herhangi bir cerrahi rahatsızlığı en aza indirmek için analjezi olarak buprenorfin (ameliyattan önce 0.1 mg / kg SQ kez 30 dk) sunun. Kurumsal onaylanmış protokoller seçilen modele uygun Bankası dozaj ve alternatifleri. İyi aseptik teknik tatbik edilmiştir ise Antibiyotikler kullanımı gerekli değildir. Acı ve sıkıntı belirtileri varsa hayvanlar post-operatif analjezi alırsınız. </li><li> Ph gerçekleştirinpreoperatif ysiologic testler. Hayvan kurban etmek işitsel beyinsapı cevabı (ABR) testi ve / veya pre-operatif ve hemen önce hem bozulma ürünü optoacoustic emisyon testi (DPOAE) Sahne farenin işitme seçilen ototoksik ajanın etkisi için objektif ölçüm olarak hizmet vermektedir. </li></ol> 3. Cerrahi Hazırlama ve Konumlandırma <ol><li> Ameliyat öncesi kurumsal standartlara göre tüm enstrümanları sterilize edin. İşlem sırasında gereksiz çaba ve hareketi önlemek için tutarlı, steril ve organize bir şekilde cerrahi aletler ve alanını hazırlayın. Tipik araçlar keskin diseksiyon makas, kuyumcu ipuçları, bir otolojik seçim, bir otolojik küret ve bipolar elektrokoter ünitesi (Şekil 1) ile metalik forseps birkaç çift içerir gereklidir. </li><li> Hazırlayın ve x 1 x 1,25 silin (~ 0.7 küçük bir üçgen parça keserek önceden labwipes yapılan kağıt fitilleri sterilize edin.75) ve bir yandan (~ içinde 1.25) baş ve işaret parmağı arasında sıkıca büküm. Sıkıca bükülmüş, son derece ince fitil oluşturulması prosedürün başarısı için her şeyden önemlidir. Cerrahi öncesi 15-20 fitiller (Şekil 2) toplam hazırlayın. </li><li> Hızlı bir şekilde kontrollü olarak kulak bül kemiğini delmek için bir dental sonda kullanın. 1 veya 2 mm konik ucu ile bir kayış tahrikli diş el matkap kullanılması tercih edilir. Bir ameliyat mikroskobu protokolünü tamamlamak için gereklidir. (Adım 4.7 bakınız) </li><li> Bir 28 G, 1/2 &#39;iğne ile 1 ml tüberkülin şırınga seçilen ototoksik maddeyi ihtiva eden bir sulu çözeltinin 0,2 ml önceden çizin. Maddenin Tipik 1 damla (~ 10 ul) tamamen fare RWN doldurmak için yeterli değildir. Keskin konik ucu ile yapıların temel hasar önlerken bir metalik, kör uç şırınga iğnesi ajanın teslim kolaylaştırır. Kabarcıklar yanlışlıkla RWN doldurmak ve / veya uygun önleyebilirsiniz olarak şırınga içinde herhangi bir havayı dışarı atmakyuvarlak pencere kendisine maddenin uygulanması. </li><li> Elektrik tımar makası kullanarak post-aurikular deriden kürk çıkarın. Omuz kuşağı kaudale için rostrally auriculo-sefalik kırışık uzanan bir bölgede kürk çıkarın. Yanal mandibula açı dorsal, sagital orta hattan epilasyon uzatın. Doğru kürk kaldırılması temiz ve berrak bir cerrahi alan sürdürmek için her şeyden önemlidir. Yavaşça amaçlanan cerrahi siteden kupürleri fırçalayın. </li><li> Kurumsal protokollere başına hazırlanan alanın cilt sterilize edin. 2 dakika süreyle dairesel şekilde topikal etanol ile dönüşümlü betadin (povidon / iyot) uygulayın. Diğer ajanlar kurumsal rehberlere başına sübstitüe edilmiş olabilir. </li><li> İşlem sırasında sürekli vücut konumlandırma korumak için düz bir yüzeye hayvan yerleştirin. 36-38 ° C&#39;de hayvanın vücut ısısını korumak için işlem sırasında vücut sıcaklığını kontrol etmek platform üzerine vücudun altına yerleştirilen küçük bir ısıtma yastığı kullanın. Ove etmeyinBu ciddi cilt hasarı ve / veya erken ötanazi hafif yol açabilir olarak hayvan rheat. <ol><li> Bir lokma blok / kafa tutucu aparatlar aracılığıyla hayvanın başını sabitleyin. Uzun ekseni boyunca 5 mm aralıklarla içinden delinmiş 2-4 mm çapında delikleri olan pirinç işlenmiş 2 cm ısırma bloğu ile 0,5 cm kullanmaktadır. Bu fikstür etrafında hayvanın ağzını açın ve hayvanın büyüklüğüne göre deliklerden birine ön üst dişleri uygun. Yavaşça hayvanın burnu yerinde tutmak için (Şekil 3) sırtı üzerinde küçük bir kelepçe sıkın. </li><li> Isırık blok / kafa tutucu katı U-şekilli artikülasyon kolu (Şekil 3) merkeze bağlı olduğundan emin olun. &quot;U&quot; sol koluna bir 1 cm genişliğinde çubuk Güvenli ve sol yan kafa geri kalanı çubuk kullanın (sağ taraf her zaman ameliyat tarafıdır). </li><li> Bir kez sıkıca kafa tutucu güvenli bir sol lateral dekübit pozisyonunda fare döndürün. Vücut dikkatli bir şekild yerleştirinLly düz çalışma yüzeyinde o prosedür boyunca istikrarlı olacak sağlamak ve boyun omurları üzerinde aşırı burulma stres önlemek için. </li></ol></li><li> Bir işletim 4x, 10x yetenekli mikroskop ve cerrahi alanın üzerine 20x büyütme yerleştirin. Bu aşağıda ele iki elle cerrahi protokol için ideal olarak mikroskop eller serbest bir şekilde konumunu koruyabilirsiniz onaylayın. </li><li> Küçük damarların ve dokunun diseksiyonu koterizasyonun yardım için hemen kullanılabilir bir konumda ince uçlu kuyumcu el parçası ile iki kutuplu bir etkin koter ünitesi yerleştirin. Bu aynı zamanda, daha ağır kanama karşılaşılan gereken gerekli olabilir. </li></ol> 4. Cerrahi Yaklaşım <ol><li> Mikroskopik büyütme altında, 1-1,5 cm postauriküler kesi, auriculocephalic kırışık yaklaşık 6-8 mm kaudal oluşturmak için keskin bir makas veya neşter bıçak kullanın. Dorsal orta hat yetişkin farelerde, bir kesiyanal mandibula açısına yakın bir noktaya yeterlidir. Dikkatle altta yatan vasküler yapıları korumak için derin kesme kaçının. </li><li> Değişken kalınlıkta olabilir deri altı yağ katmanı sayesinde dikkatli künt diseksiyon yürütün. Geliştirilmiş maruz gerekiyorsa Yağ güvenle kaldırılabilir. Eksternal juguler ven bu alanda erişir ve bu yapıya zarar kan kaybı ve ameliyat alanın sel büyük miktarda neden olabilir gibi ventral-medial yönde diseksiyon dikkatli olunuz. Emilebilir jelatin sünger ve / veya pamuk pelet ile herhangi bir aşırı kanamayı kontrol edin. Ağır kanama bipolar koter kullanın. </li><li> Yağ tabakası düzgün bölündükten sonra, servikal kas maruz kalmaktadır. Rostrally mandibulanın açısını örten merkezi maruz cerrahi alanındaki cleidomastoideus büyük kas vücut ventral eksternal juguler ven ve parotis dokusu da dahil olmak üzere önemli yapıları unutmayın. Önemli bir dönüm noktası, küçük bir sinir branc olduğunucleidomastoideus posterior / dorsal kenarı sarar (kranial sinir XI) h pinna (Şekil 4) doğru rostrally uzatmak için. </li><li> Yavaşça posterior / dorsal yönde cleidomastoideus kas gövdesini geri (Şekil 4, 5). Yavaşça kas vücudu saran şeffaf fasya bölün. Benzer bir şekilde, hafifçe ters (anterior / ventral) yönünde (Şekil 5) parotid ve dış juguler ven geri çekin. </li><li> Cleidomastoideus kas vücudun iyi geri çekilmesi ile birlikte, timpanik bulla periost parlak kubbe görünümünde (Şekil 6) girecek. Bulla kaudal, derin servikal kas, sternomastoideus yerleştirilmesi, görünümü (Şekil 6) girecek. Dorsal ve bulla kubbe rostral yönü görünür hale yüz siniri, koruyun. Kendi kendine istinat retraktörü yerleştirin (Steril titanyum atılabilir silikon gömülü shaft--sondaj öncesinde) yapıştırın. </li><li> Iki elle tekniği ile hafifçe altta yatan kemik maruz bipolar diatermi ile bül periost bölün. Hafifçe yükseltmek ve çevresel yönde periost itin, forseps veya Otolojik küret kullanılarak yaygın bül kubbe ortaya çıkarmak. Not: Adım 4,6 orta kulak boşluğuna cerrahi görünümü maksimize etmek için önemlidir. Delme sonra bül boşluğuna kanama ve / veya interstisyel sıvı sızıntısını önlemek için titiz ve nazik yumuşak doku işleme yararlanın. </li><li> Düzgün maruz bulla kubbe üzerine, bül rostral yönü boyunca uzanan kubbe kaudal marjı ve (kulak zarına temsil eden) gözle opak hattı arasında bir diş cerrahi matkap ile bül kemiğin içinden 2 mm pilot delik delme (Şekil 7). Böyle stapes arter gibi altta yatan yapıları korumak için sadece kemik yoluyla delmek için özen gösterin. &lt;(Bulla kemiğin un-çatı kolaylaştırmak için yakın bir ikinci pilot delik açınstrong&gt; Şekil 7). </li><li> Takı ucu forseps bir çift kullanarak, dorsal ve kaudal yönde (Şekil 8) &#39;de bulla kemik kapağını açmak. Yüksek büyütme altında parça parça moda kemik çıkarın. Bu arterden kanama prosedürü tehlikeye olabilir, bül kap altında doğrudan yatıyor stapes arter, delmeyin. Hala mükemmel görselleştirme ve yuvarlak pencere niş erişimi (Şekil 8) izin verirken, orta kulağa aşırı sıvı girişini önlemek için çıkarılan kemik miktarını en aza indirin. </li></ol> Ototoksik Agent 5. Yuvarlak Pencere Uygulaması <ol><li> Görünümüne kare RWN getirmek için kafa sahibine ince dönme ayarlamalar yapın. RWN tipik olarak orta kulak boşluğuna dorsal ve kaudal bulunur ve otik kapsül, kemiğin bir fincan benzeri bir girinti olarak görünür. Çoğu durumda, stapedial arter bu 1-2 mm ventral / rostral çalışır. RWN zaman tuc olabilirbulla kubbenin akut açılanma altında periferik ked. Bu gibi durumlarda, hayvanın baş dikkatli pozisyon önemlidir. <ol><li> Kuru kemik görülünceye kadar preoperatif hazırlanmış kağıt fitilleri kullanılarak, orta kulak ve RWN görünür tüm sıvıyı çıkarın. Not: ~ ototoksik madde 10 ul (1 damla) kolayca sıvı ile seyreltilebilen RWN uygulandığı gibi bu, tüm protokol en kritik adımdır. </li></ol></li><li> Maksimum büyütme altında, tamamen doldurarak, RWN doğrudan ototoksik ajanın bir damla (~ 10 ul) uygulamak için 1 ml tüberkülin şırınga ince bir kalibreli iğne kullanın. Stapes arter bozabilir ve niş düzgün dolum olduğunu bir göstergesi olarak donuk ve puslu sıvı menisküs ile kuru niş dibinde küçük bir ışık yansıması değiştirilmesi için yakından gözlemek değil özen gösterin. <ol><li> Ajan yaklaşık 10 dakika maruz kalma süresi için RWN içinde dinlenmek için izin verin. Bundan sonra, tamamen wajan dışarı Ick ve aynı maddenin yeni bir uygulama ile değiştirin. Madde özelliklerine göre uygulama tekrarları belirler. Bu prosedürde toplam maruz kalma süresi tipik olarak 30 ila 60 dakika arasında değişmektedir. </li><li> Prosedürün sonunda, tamamen ajan son bir kez uzak fitil ve RWN taze ajan uygulanır. Kapatılmamış bül bırakın ve cerrahi sitesi üzerinden yumuşak doku kapatmak için forseps kullanabilir. </li></ol></li><li> 4-0, emilemeyen monofilament sütür ile cilt seviyesinde cerrahi siteyi kapatın. Kurtarma kafesi / istasyon hayvan yerleştirin. Düzenli operasyondan sonra hayvanın klinik durumunu izleyin. Stresi en aza indirmek için, yumuşak gıda ile yumuşak yatak ve takviyesi ile konut da dahil olmak üzere, uygun ortam şartlarında, hayvan koruyun. Kurumsal IACUC protokollerine göre gelecek prosedürler ve post-operatif koşulları belirlemek. </li><li> Cihazı sterilize etmek için kurumsal IACUC protokolleri kullanmaBir sonraki hayvan kullanılmadan önce s. Enstrüman kullanımı arasındaki uygun soğutma süre bekleyin. </li></ol> 6. Ameliyat sonrası Usul ve Koklear Doku Hasat <ol><li> Aşama 2,5 anlatıldığı gibi, ameliyat sonrası istenilen noktalarda işitme fizyolojik testinin yapılmasını ve öncesinde kurban. Deneysel amaçlarına göre postoperatif prosedürleri gerçekleştirin. Istenilen postoperatif günde hayvan kurban. </li><li> IP enjeksiyon yoluyla tam anestezi üzerine, kurumsal IACUC protokolleri başına gerektiği gibi, hayvan kurban. Keskin bir makas kullanarak, oksiputa sadece kuyruk hayvan başını kesmek. Keskin dorsal ve ventral orta hat boyunca makasla kranial tonoz açın ve yaygın. Yavaşça zamansal kemikler ortaya çıkarmak için beyin dokusuna kepçe. Not: kokleadaki sonrası maruziyet değişikliklerinin soruşturma prosedürlerinin bir dizi bu noktadan şube ve tartışma bölümünde söz edilecektir. En relevan soruşturma yöntemi belirlemeDeneysel amaçlara t. Koklea kesitli sonra elektron mikroskobu planlanıyor ise, doku ön düzeltmek için kalp kateterizasyonu kullanın. Bu, bu tartışmanın kapsamı dışındadır ve başka derinlemesine katedilmiştir. 13 </li><li> Makasla kafa tabanı üzerinden zamansal kemikler kesin ve derhal fiksatif çözüm yerleştirilir. Oda sıcaklığında 1.5 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde, doğrudan kemik bırakın. Uzun süreli İlerleyen aşamada histolojik analiz sonuçlarını sınırlamak gibi, tespit süresini izleyin. Kirecini 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içinde altında kalma ile zaman değişken bir süre için kemiklerin kesilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kimura, R. S., Iverson, N. A., Southard, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+lesions+of+the+vestibular+labyrinth.">Selective lesions of the vestibular labyrinth.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 97, 577-584 (1988).</li><li>Dodson, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+and+survival+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+guinea+pig+after+intracochlear+perfusion+with+aminoglycosides.">Loss and survival of spiral ganglion neurons in the guinea pig after intracochlear perfusion with aminoglycosides.</a> Journal of neurocytology. 26, 541-556 (1997).</li><li>Wanamaker, H. H., Gruenwald, L., Damm, K. J., Ogata, Y., Slepecky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-related+vestibular+and+cochlear+effects+of+transtympanic+gentamicin.">Dose-related vestibular and cochlear effects of transtympanic gentamicin.</a> The American journal of otology. 19, 170-179 (1998).</li><li>Lee, K. S., Kimura, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ototoxic+drug+administration+to+the+endolymphatic+sac.">Effect of ototoxic drug administration to the endolymphatic sac.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 100, 355-360 (1991).</li><li>Schmiedt, R. A., Okamura, H. O., Lang, H., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+application+to+the+round+window+of+the+gerbil+cochlea:+a+model+of+auditory+neuropathy+and+apoptosis.">Ouabain application to the round window of the gerbil cochlea: a model of auditory neuropathy and apoptosis.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 3, 223-233 (2002).</li><li>Schmiedt, R. A., Lang, H., Okamura, H. O., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+furosemide+applied+chronically+to+the+round+window:+a+model+of+metabolic+presbyacusis.">Effects of furosemide applied chronically to the round window: a model of metabolic presbyacusis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 9643-9650 (2002).</li><li>Suzuki, M., Kikuchi, T., Ikeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocochlear+potential+and+endolymphatic+K++changes+induced+by+gap+junction+blockers.">Endocochlear potential and endolymphatic K+ changes induced by gap junction blockers.</a> Acta oto-laryngologica. 124, 902-906 (2004).</li><li>Chen, Z., Mikulec, A. A., McKenna, M. J., Sewell, W. F., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+intracochlear+drug+delivery+in+the+mouse.">A method for intracochlear drug delivery in the mouse.</a> Journal of neuroscience methods. 150, 67-73 (2006).</li><li>Husmann, K. R., Morgan, A. S., Girod, D. A., Durham, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+administration+of+gentamicin:+a+new+method+for+the+study+of+ototoxicity+of+cochlear+hair+cells.">Round window administration of gentamicin: a new method for the study of ototoxicity of cochlear hair cells.</a> Hearing research. 125, 109-119 (1998).</li><li>Heydt, J. L., Cunningham, L. L., Rubel, E. W., Coltrera, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+gentamicin+application:+an+inner+ear+hair+cell+damage+protocol+for+the+mouse.">Round window gentamicin application: an inner ear hair cell damage protocol for the mouse.</a> Hearing research. 162, 65-74 (2004).</li><li>Palmgren, B., Jin, Z., Ma, H., Jiao, Y., Olivius, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-Bungarotoxin+application+to+the+round+window:+an+in+vivo+deafferentation+model+of+the+inner+ear.">beta-Bungarotoxin application to the round window: an in vivo deafferentation model of the inner ear.</a> Hearing research. 265, 70-76 (2010).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chronic+furosemide+treatment+and+age+on+cell+division+in+the+adult+gerbil+inner+ear.">Effects of chronic furosemide treatment and age on cell division in the adult gerbil inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 4, 164-175 (2003).</li><li>Lang, H., Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain+induces+apoptotic+cell+death+in+type+I+spiral+ganglion+neurons,+but+not+type+II+neurons.">Ouabain induces apoptotic cell death in type I spiral ganglion neurons, but not type II neurons.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 6, 63-74 (2005).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+the+cochlea+of+an+auditory-neuropathy+animal+model:+effects+of+timing+after+injury.">Transplantation of mouse embryonic stem cells into the cochlea of an auditory-neuropathy animal model: effects of timing after injury.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 9, 225-240 (2008).</li><li>Stevens, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heptanol+application+to+the+mouse+round+window:+a+model+for+studying+cochlear+lateral+wall+regeneration.">Heptanol application to the mouse round window: a model for studying cochlear lateral wall regeneration.</a> Otolaryngology--head and neck surgery : official journal of American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 150, 659-665 (2014).</li><li>Zheng, Q. Y., Johnson, K. R., Erway, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+hearing+in+80+inbred+strains+of+mice+by+ABR+threshold+analyses.">Assessment of hearing in 80 inbred strains of mice by ABR threshold analyses.</a> Hearing research. 130, 94-107 (1999).</li><li>Hequembourg, S., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spiral+ligament+pathology:+a+major+aspect+of+age-related+cochlear+degeneration+in+C57BL/6+mice.">Spiral ligament pathology: a major aspect of age-related cochlear degeneration in C57BL/6 mice.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 2, 118-129 (2001).</li><li>Ohlemiller, K. K., Gagnon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical-to-basal+gradients+in+age-related+cochlear+degeneration+and+their+relationship+to+'primary'+loss+of+cochlear+neurons.">Apical-to-basal gradients in age-related cochlear degeneration and their relationship to 'primary' loss of cochlear neurons.</a> The Journal of comparative neurology. 479, 103-116 (2004).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis-related+genes+change+their+expression+with+age+and+hearing+loss+in+the+mouse+cochlea.">Apoptosis-related genes change their expression with age and hearing loss in the mouse cochlea.</a> Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 13, 1303-1321 (2008).</li><li>Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+approach+to+select+genes+from+RMA+normalized+microarray+data+using+functional+hearing+tests+in+aging+mice.">Novel approach to select genes from RMA normalized microarray data using functional hearing tests in aging mice.</a> Journal of neuroscience. 171, 279-287 (2008).</li><li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+hearing+loss:+GABA,+nicotinic+acetylcholine+and+NMDA+receptor+expression+changes+in+spiral+ganglion+neurons+of+the+mouse.">Age-related hearing loss: GABA, nicotinic acetylcholine and NMDA receptor expression changes in spiral ganglion neurons of the mouse.</a> Neuroscience. 259, 184-193 (2014).</li><li>Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+window+membrane+intracochlear+drug+delivery+enhanced+by+induced+advection.">Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 174, 171-176 (2014).</li><li>Tadros, S. F., D'Souza, M., Zhu, X., Frisina, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea:+relations+to+age-related+hearing+deficits.">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279 (2014).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear.">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li></ol>

Hiçbir mali çıkarlarını rakip. Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda açıklanan protokol ve temsilcisi sonuçları her iki cinsiyette de dahil olmak üzere bir CBA / CAJ fare modelinde elde edilmiştir. Bu doğuştan zorlanma iyi araştırma işitme bir &quot;iyi işitme&quot; standart ve &quot;normal yaşlanma&quot; modeli olarak kuruldu. Diğer memeli modellerinde bu protokol kullanımının 16-23 açıklaması bu metnin kapsamı dışındadır. Okuyucu RWN uygulama tekniği memeli iç kulak eğitimi için çeşitli avantajlar sunuyor, ancak, dikkat etmelisiniz. Bunlardan en önemlisi o narin anatomik yapısı direkt bozulmaya ve otik kapsülün duvarları içinde mevcut biyokimyasal geçişlerini engeller olduğunu. Böyle kokleostomisi ve infüzyon pompası implantasyonu olarak Prosedürler doğrudan kalıcı eşik vardiya giden iç kulak yapıları ihlal etmek eğilimi var; sonuçlarını analiz edilirken göz önünde bulundurulması gereken bir gerçektir. Invaziv metho tarafından koklear yanal duvar yapılarının bozulmasıds ayrıca belirli bölge etkisi o konuma sınırlıdır. Bu tür trans-timpanik enjeksiyon ve parenteral enjeksiyon olarak 15,24 Alternatif non-invaziv yaklaşımlar güvenilmez sonuçlar ve boğulmuş olan furosemid veya heptanol gibi ototoksik maddelerin kullanımını kısıtlayabilir / veya hayvan modeli sistemik toksisite. Bu uygulama yöntemi, yukarıda tartışılan diğer invazif yöntemler yaklaşan bir tutarlılık seviyesi elde bu eksikliklerin sakınmayı kanıtlanmıştır. Bu tekniğin diğer avantajları, hayvan modelleri ve fizibilite bir dizi geniş uygulanabilirliği varolan Laboratuvar alt içine dahil etmektir içerir. İkincisi ile ilgili olarak, herhangi bir özel reaktif veya kimyasal seçilmiş ototoksik maddeler, Anesteziyoloji ve analjezikler kenara gereklidir. Ototoksik ajanlar tipik olarak dikkate uzun süreler son çözeltisi (5 mi) içindeki bir yeterince büyük bir hacim içinde sabit bir konsantrasyonda kullanılmaktadır ve karıştırılırher uygulama ing (farelerde) içerisinde, yaklaşık 10 ul kullanır. Böylece, malzeme ve araçların ilk ihaleden sonra, araştırmacılar zaman alıcı Çözelti hazırlama veya malzemelerin sık sık değiştirilmesi görece ücretsizdir. Bu teknik aynı zamanda perilenfatik infüzyon pompaları veya cochleostomies implante ilgili prosedürlere göre önemli olabilir ameliyat süresi azalma sunmaktadır. Teknik yeterlilik seviyesine ulaştıktan sonra, kapatılmasına ilk kesi bizim ortalama tamamlanma süresi ototoksik ajan için istenen maruz kalma süresine bağlı olarak genelde 20 dakika ile 1.5 saat oldu. Üç ya da dört ameliyat kolayca artan verimlilik ve başarılı sonuçlar elde etmek için artan potansiyeli sağlayan, tek bir günde tamamlanabilir. Yukarıda tarif edildiği gibi, bu teknik aynı zamanda kolayca fareler, sıçanlar, kobaylar ve Gerbils da dahil olmak üzere, kemirgen modellerinde çeşitli uygulanabilir. Bu yöntemin Sınırlamalar merkezli olanorta dik bir öğrenme eğrisi usta için gerekli teknik yeterlilik ulaşılana kadar beklenen sonuçları azalmıştır. Aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınacağı gibi, cerrahi yaklaşım ya da cerrahi alanın yetersiz görselleştirme sırasında küçük hatalar hemen her zaman kötü sonuca yol açacaktır. Böyle ajan seyreltilmesi yuvarlak pencere membran veya interstisyel sıvıya maddenin bir alt milimetre kalınlığında hava kabarcığı engelleme erişimi gibi bir acemi tanımak için başarısız olabilir ince bulgular, takdir ve bunları düzeltmek için gerekli psikomotor becerilerini geliştirmek için zaman ayırın. Ancak, bu engeller kolayca üstesinden gelmek ve yukarıda belirtilen invaziv yöntemlerin bazıları daha araştırmacılara az yıldırıcı teknik meydan oluştururlar prosedürün tekrarlanan performansı ile. Son olarak, bu teknik, koklear yaralanması, sadece cerrahi müdahale sırasında bir zaman tek bir noktada indüklenebilir göreceli sınırlama ile ilişkilidir. Bu, belirli bir dereceye kadar aşılabilir, Heydt ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi madde içinde emdirilmiş jelatin sünger ile RWN doldurularak. 10, jelatin süngerin zamanla resorbe, ancak tek başına sulu çözeltinin uygulanması yoluyla elde edilebilir daha uzun bir maruz bırakma dönemi için izin verebilir. Bu tekniğin tam avantajları gerçekleştirmek ve herhangi tuzaklardan kaçınmak için bir araştırmacı için, bu tekniğin iki kritik unsurları tanımak önemlidir: 1) sürekli orta kulak boşluğuna ve RWN görselleştirme korumak; ve 2) yeteneği interstisyel sıvı ve / veya kan serbest cerrahi alanında tutmak için. Bu eski ulaşmada uygun bir kafa tutucu önemi vurgulanmıştır aşırı olamaz. Hayvanın başının güvenli sabitleme mikroskop altında istikrarlı bir görünüm sağlar; ince enstrümantasyon ölçüde büyütme altında yapıların konumlandırma değiştirdiğinde önemi kolayca belirginleşmektedir. İyi bir hHayvanın rostral-kaudal ekseni etrafında dönebilir ead sahibi de sitenin araştırmacının doğrultusunda önemli dinamik değişiklikleri kolaylaştırır. Çoğu zaman, bu eksen etrafında dönme birkaç milimetre RWN görselleştirme ve tek otik kapsül kemik görselleştirme arasındaki fark anlamına gelebilir. Sürekli görünümünü değiştirme yeteneği de düzgün niş ve derinliklerinden çıkarılır interstisyel sıvıyı sağlamak için her şeyden önemlidir, aynı zamanda bizim deneyim, kan, yoğunlaşma veya interstisyel sıvıda Bölüm 5&#39;de tartışıldığı gibi ototoksik ajan tamamen uygulamalar arasında kaldırılır O orta kulak alan tüm deney müdahale etme yeteneğine sahiptir girer. Ototoksik maddenin küçük bir miktan, konu dışı sıvı daha küçük hacimlerde temas ile seyreltilebilen yuvarlak pencere (~ 10 ul) tatbik Bu durum şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, titiz cerrahi diseksiyon, kulak bül ve dikkatli preservat parça parça kapağını açmakstapes arter iyon başarılı deneysel sonuçlar eşdeğer bulunmaktadır. Yukarıdaki kritik adımlar gözlenir ve beklenen sonuçlar hala elde değilse, sorun başlamalıdır. Bizim tecrübelerimize göre, bu iki usul elemanların deneme varyasyonlarını gerçekleştirmek için genellikle yararlı olur. İlk ototoksik ajan yuvarlak pencerede doldurulan sıklığını değiştirmek için. Kullanılan ajana bağlı olarak, toplam maruz kalma süresi tamamlandıktan fitilleme ve ajan, her 10 dakika daha sonra değiştirme ile, 30 dakika ve 1 saat arasında değişmektedir. Kısa süreler için maruz ise, toplam olarak maruz artan ajan daha fazla zaman yuvarlak pencere zarından diffüz izin verebilir. Ek pozlama ve Yenileyici da yukarıda bahsedildiği gibi kan, yoğuşma veya interstisyel tarafından ototoksik ajanın istenmeyen seyreltme önlemek için yardımcı olabilir. Bu yaklaşımı kullanarak zaman istenmeyen riskini artırma eğilimi olarak Dikkat Bununla birlikte, muhafaza edilmelidirly stapes arter yaralanmasına ve / veya RWN için interstisyel sıvının tanıtan. Bu teknik koklear fizyoloji ve fizyopatolojisi soruşturmalara sunduğu için ne önemlidir. Bu minimal invaziv teknik narin biyokimyasal süreçlerin detaylı çalışma sağlar ve koklear rejeneratif potansiyelinin değerlendirilmesi amacıyla bizim araştırma sürdürmek anlamına olmuştur. 12,24 Bu cerrahi yaklaşım ve poz diğer dalı çeşitli teknikler üzerinde çoğaltılamaz ve başarılı sonuçlar istimal bu yöntem Koklear kök hücre implantasyonu çalışmalarda bildirilmiştir. 14 A great deal Ancak araştırmacılara mevcut geniş donanmasını birlikte bu teknik, bu bilgi boşluğunu daralma yardımcı olacak, koklea hakkında bilinmemektedir.

Müfettişler işitme sisteminin normal fonksiyonunu yanı sıra işitme kaybı patofizyolojisini incelemek için hayvan modellerinde geniş bir yelpazeye kullandık. Bu modeller aynı zamanda çeşitli patolojik süreçler karşı müdahale çalışmaların yapılması için son derece yararlı ve insan deneklerde translasyonel uygulamaları için temel olarak hizmet vermektedir. Koklea ve bununla ilişkili işitsel yolları içeren en araştırma, hasar veya bozulma bazı derece sistemine verilmesi gerekir. Genellikle, hasar kasten araştırmacılar, normal işlevi o lezyon yanı sıra ondan kurtarmak için koklear yeteneği etkisini araştırmak için izin belirli bir lezyon oluşturmak amaçlanmaktadır. Hasar verilmesi için belirli bir hayvan modeli ve / veya teknik (ler) seçilirken, bir dizi faktöre mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek için kabul edilmelidir. Bir tekniğin doğrudan ve dolaylı etkileri olabilir iken çeşitli hayvan modelleri, müdahalelere farklı tepkiler verebilirİstenilen sonuca tamamen zararlı. Çoğu durumda, ideal bir iç kulak hasarı protokolü hızla sistemik toksisite önlemek ve güvenilir hasara sebep, hassas ve tutarlı lezyon oluşturmak ve fonksiyonel hücresel ve moleküler değişikliklerin daha fazla çalışma izin survivable olacaktır. İdeal olarak, bu yöntemleri de mümkün olduğunca Kokleanın hassas mikro mimari ve elektrokimyasal geçişlerini korumak istiyorum. Bugüne kadar, araştırmacılar iç kulak hasarı ikna etmek için bir takım teknikler kurarak başardı. Bunların çoğu ya sistemik veya cerrahi yaklaşımla bir ototoksik ajana kokleayı açığa gerektirir. Teknikler perilenfatik perfüzyon ile parenteral enjeksiyon, intra-peritoneal enjeksiyonu, trans-timpanik enjeksiyon, endolenfatik kese enjeksiyon ve kokleostomisi sayılabilir. Bu teknikler furosemid, gentamisin, ouabain ve heptanol olarak ototoksik maddeler, çeşitli tanıtmak için kullanılmıştır. 1-5Belirli koklear lezyonlar oluştururken başarılı olsa da, yukarıdaki teknikler de sınırlamaları kabul ettiler. Sistemik enjeksiyonları hayvan derece toksik olabilir ve istenmeyen koklear hakaret ve tutarsız sonuçlar ile ilişkili olabilir. Ikinci eksiklik trans-timpanik enjeksiyonları ile ilişkilendirilmiştir. Böyle kokleostomisi ve perilenfatik perfüzyon gibi teknikler, hızlı ve son derece güvenilir lezyonlar indükleyebilen iken, iç kulak yapısı ve fonksiyonu doğrudan invaziv. Cerrahi yaklaşımların çoğu da teknik zorluk yüksek derecede ilişkilidir ve böyle bir mikropompa demlik olarak hayvanda yabancı nesneler bırakarak gerekebilir. 2-4,6-8 Tek bir tekniktir eksikliklerin ücretsiz ve araştırmacılar seçmelisiniz yöntemler dikkatle deneysel ihtiyaçlarına uygun. Burada, detaylı, yetişkin farelerde ototoksik maddelerin topikal teslimat için, yuvarlak pencere niş (RWN) uygulaması tekniğini açıklar. Fibir kuş modelinde duyusal saçlı hücre dejenerasyonunun gentamisin etkisini okurken ilk 1998&#39;de al Husmann ve tarif, bu teknik, ilgili zehirlenmelerden kaçınılarak, sistemik gentamisin uygulama göre önemli ölçüde daha güvenilir lezyonlar üretme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. 9 O zamandan beri, Laboratuvarımızda dahil olmak üzere diğer araştırmacılar, sayıları, büyük bir başarı ile bu tekniği kullanmışlardır. 2004 yılında, Heydt ve ark. bir fare modelinde uygun bu ve gentamisin çeşitli konsantrasyonlarda emdirilmiş jelatin süngerle RWN doldurarak lezyon büyüklüğü kontrol etmek için gelişmiş bir yeteneğini,. 10 ve diğ., 2010, p-Bungarotoxin ototoksik etkileri üzerinde çalıştılar Palmgren, güçlü bir Tayvanlı zehiri element erişkin farelerin RWN için bunun sulu bir formu uygulanarak, sandık bantlı. 11 Ayrıca, laboratuvarda önceki çalışmalarda çok sayıda furosemid ototoksik etkisini incelemek için yuvarlak pencere yaklaşımı kullanmış olmasıe ouabain ve heptanol. Bu çalışmalardan 5,6,12-15 sonuçları koklear sıvısı ve normal işitme iyon homeostasisin önemini göstermiştir, spiral ganglion ve koklear yan duvarda hücre çoğalması yeteneğini keşfetti ve anlayışımızı daha da ileriye Yaşa bağlı işitme kaybı. Aşağıdaki yaklaşım cerrahi bir kesi postaurikuler ve kemik timpan bulla kısmi yüzeylemenin yoluyla orta kulağa erişen içerir. Bu seçilmiş ototoksik madde doğrudan tatbik edilebilir olduğu RWN ile zarın daha iyi görüntülenmesi için izin verir. Sıvı madde daha sonra RWN fincan gibi içi boş havuzları (veya yavaş RWN içine paketlenmiş doymuş emilebilir jelatin sünger taşıyıcıdan drene) ve koklear vestibülün perilenfatik uzaya yuvarlak pencere zarından yayılır. Hiçbir doğrudan kokleostomisi bu yaklaşımın yapılır. Bu tekniğin avantajları iç kulak mikro mimarisi, kaçınma korunması dahiliçi hayvan kontrol kulağın sistemik toksisite, yardımının, etkinin hızlı bir başlangıç, belirli bir koklear hücre tiplerinde seçici bir dejenerasyon (örneğin., tip I Ouabain maruz kalma ve koklear Çeşidi heptanolden tedavisinin neden olduğu II fibrositler gangliyon nöronları, spiral), ve tekrarlanabilir / güvenilir sonuçlar. Bu teknik, sıçan, gine domuzu ve Gerbils dahil olmak üzere diğer kemirgen türleri arasında birkaç değişiklik ile uygulanabilir. Dezavantajları dik teknik bir öğrenme eğrisi ve zaman içinde tek bir noktaya sınırlandırılmıştır ototoksik hakaret göreli sınırlamayı içerir.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">1-Heptanol 98%</td>
			<td rowspan="2">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2805&#160;</td>
			<td rowspan="2"><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637&#160;</td>
			<td>Concentrate 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Ketamine HCl)</td>
			<td>10ml</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased Injectable</td>
			<td rowspan="2">Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td rowspan="2">Concentrate 20mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280&#160;</td>
			<td>Concentrate 0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Buprenorphine HCl)</td>
			<td>5 ampules per box</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Skin Prep Solution</td>
			<td rowspan="2">Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&#160;</a></td>
			<td rowspan="2">1 Quart screw top bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Povidone-Iodine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Saline</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For mixing solutions and injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>32192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td>
			<td>Industrial Acoustics Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Surgical Head Holder</td>
			<td>Custom Made &#8211;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Please see Figure 3</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical University of South Carolina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch</td>
			<td rowspan="3">World Precision Instruments</td>
			<td rowspan="3">555801L</td>
			<td>Maximum spread 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&#160;</td>
			<td>Emesco</td>
			<td>N/A (Vintage Item)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle Size6</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>MEDC-011990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&#160;</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td rowspan="2">SKU: 097-7215</td>
			<td rowspan="2">50 Blades/Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via ACE Surgical Supply Code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Jewelers Forceps&#160;</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>MIL17304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Curved</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.00</td>
			<td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kimwipes Delicate Task Wipers&#160;</td>
			<td rowspan="2">Kimtech Science</td>
			<td rowspan="2">CODE 34155&#160;</td>
			<td rowspan="2">White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>House Ear Curette, 6&#8221; shaft, light angle</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&#160;</a></td>
			<td>Substitutions may be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton pellets #3 4mm</td>
			<td>Richmond</td>
			<td>Manufacturer Code 100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td>
			<td>Elmed</td>
			<td>List No. 52-5770</td>
			<td>Bipolar and Monopolar Capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&#8221; length needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Product Number: 329410</td>
			<td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G, blunt tip, 1&#8221; length needle</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>Product Code 8881202397</td>
			<td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>U-line</td>
			<td>S-10478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td>
			<td>U-line</td>
			<td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Hair Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multiple models may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&#160;13mm 3/8 circle needle</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>1855G</td>
			<td>Substitutions may be made.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td rowspan="2">Fisher</td>
			<td rowspan="2">01-812054</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Dry Sterilizer</td>
			<td rowspan="3">ROBOZ</td>
			<td rowspan="3">Germinator TM 500</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Yukarıdaki protokolü kullanılarak Stevens ve ark tarafından yapılan son çalışmada, her iki cinsiyette yetişkin CBA / CAJ fareler heptanol yuvarlak pencere difüzyon yoluyla maruz bırakıldı. 15 Heptanol hedeflenen üretmek için bilinen bir boşluk kavşak un-elemanı, hücrelerine geri kazanılabilir bir yaralanmadır Koklear yanal duvar. Bu çalışmanın amacı hasarlı elemanların ameliyat sonrası rejenerasyon soruşturma için izin hedeflenen koklear hasar için güvenilir bir model üretmek için oldu. Fonksiyonel son nokta olarak görev öncesi cerrahi ve ameliyat sonrası işitme eşikleri. Mikroskopi ve immünohistokimyasal boyama teknikleri morfolojik değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. ABR eşiklerinde önemli artışlar heptanol ile tedavi edilmiş farelerde (Şekil 9) gözlendi. Yerine heptanolden tuzlu teslim ile, sahte cerrahi alan kontrol hayvanları, herhangi bir test frekansta önemli eşik vardiya olmadığı görülmüştür. Bir içeri doğru rektifiye karşı immüno-potasyum kanalı (Kir) 4,1 Kohleanın hasar / kurtarma görselleştirmek için dolaylı bir yöntem olarak görev yaptı. Bu tedavi ile kontrol kulakları arasındaki yüksek tekrarlanabilir farklılıklar göstermiştir. Genel boyama yoğunluğu belirgin bu alanlarda hedeflenen hasar büyük miktarda gösteren, stria vaskularis (STV) içinde ve 1-3 gün heptanol maruziyetten sonra spiral ligaman (SLF) fibrositlerinin arasında azalmıştır. Tip II ve tip IV ÖİDÖ alanları (Şekil 10) ve stv (Şekil 11) Kir 4,1 boyama yoğunluğu, belirli bir azalma vardı. Bozulmuş nükleer bütünlüğü ve kromozomal yoğunlaşma / hücresel apoptoz tipik kabarcıkların kanıtlar ayrıca koklear alanlarda nükleer counterstains (Şekil 10) görüldü. Kir 4.1 boşluklu bölgeler 7 gün belirgin çözülmüş ve 14 gün sonra tamamen yok olduğunu lekeleme. Kir 4.1 boyama yoğunluğu STV alanlarında ölçüldü zaman tedavi kulakları bir initi gösterdi7 gün heptanol maruz (Şekil 12) sonra geri kontrol yoğunluğu doğru önemli bir kayma (p &lt;0.05) izledi al yalak. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> Şekil 1. Enstrüman kurdu. Enstrümantasyon ameliyat öncesi set-up Tasvir. Tüm ekipman steril cerrahi alanında kolayca erişilebilir olmalıdır. İnce kavisli ucu Kuyumcu forseps ile ve elektro-koter ünitesi - Tipik enstrümantasyon 2 keskin diseksiyon makas, 2-3 düz ve / veya kulak küretler kavisli ucu Kuyumcu forseps, kavisli mil otolojik tüyo (gösterilmemiştir sonra Rosen ile ikame alır) içerir headpiece. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt = &quot;Şekil 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Cerrahi malzemeleri rakam. RWN ortamını korumak için ek malzemeler. Kağıt fitil formasyonu (solda) sterilize labwipe kesikler, sıkı biçimlenmiş kağıt sterilize laboratuvar mendil (merkezi) ve 4 mm pamuk pelet (sağda) yuvarlak pencere niş aşırı sıvı ve kan sel silmek için kullanılır yapılan fitiller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">Tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> Şekil 3. Hayvan kafa tutucu. Kafa tutucu ve ısırma bloğunu gösteren bir görüntü. Bloktaki delikler uygun ve üst santral kesici dişler sabitleyin. Bir kelepçe yavaşça yerine hayvan sabitlemek için dorsal burun üzerine sıkılır. Bir kafa tutucu kullanılması başarılı cerrahi outc için kritikome. İdeal olarak, bu işlem sırasında bül cerrahi görüşlerini optimize etmek için hayvanın rostral-kaudal ekseni etrafında döndürmek gerekir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> Şekil 4. Cleidomastoideus m. Temel kemirgen servikal kas anatomisi ve dış juguler ven ile ilişkisini gösteren. Şematik grafik. Cleidomastoideus kas cerrahi yaklaşım sırasında en kolay tespit kastır. Timpanik bulla (siyah daire) doğru cerrahi diseksiyon yönlendirecektir kas vücudun posterior / dorsal geri çekilmesi ardından kuşatıcı fasya Yayın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">Al görüntülemek için tıklayınız</a>Bu rakamın arger sürümü. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> 5. Cerrahi pozlama alanı Şekil. Deri ve deri altı yağ katmanları üzerinden diseksiyonu sonrası pozlama resmediyor. Notun Yapısal görülecek bir cleidomastoideus kas (A), eksternal juguler ven (B) örten kranial sinir XI şube ve maruz parotis dokuyu (C) içerir. Kranial sinir XI dalı genellikle küçük bir gemi ile ilişkili ve önceki davanın bölünmüş olması gerekir. Sağ görüntü hayvanın rostral-kaudal eksenine karşılık sola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> Şekil 6. met maruzlla. cleidomastoideus geri çekilmesi ve çevre yapılara sonra timpanik bulla Poz. Kayda değer görülecek cleidomastoideus kas gövdesi (A) / posterior yansıyan dorsal dahil, fasial sinir (B) ve timpanik bulla periosteum (C) parlak kubbe. Ayrıca, timpanik bulla (yıldız) sol kaudal yönü de sternomastoideus kas ekleme not edin. Bül dorsal ve rostral yönü de fasial sinirin varlığı bulla gerçek tanımlanması için kritik bir dönüm noktası olduğunu. Sağ görüntü hayvanın rostral-kaudal eksenine karşılık sola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> Şekil 7. yuvarlak pencere niş maruz ben. Görüntü tympa resmedennic bül tamamen örten periost diseksiyonu sonrasında gözler önüne serdi. Pilot delik iyi bulla kubbe kaudal kenarı ve rostral yönü (kulak zarına temsil eden) bül içinde görüntülendi ince opak bir çizgi arasındaki yarım noktada yer almaktadır. İkinci bitişik bir pilot delik bulla kemik kolay un-çatı kolaylaştırabilir. Altta yatan stapes arter kesmemeye kadar derin sondaj Kaçınma alınmalıdır. Görüntünün alt kısmındaki koyu metalik nesne titanyum yumuşak doku retraktörü olduğunu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> Şekil 8. yuvarlak pencere niş II maruz. Yuvarlak pencere niş (ok) ve stapes arter maruz kalma ile kapaksız timpanik bulla (kırmızı yapı20x büyütme altında bakıldığında 1-2 mm) niş yanal. Niş genellikle kubbe kaudal yönü de otik kapsül ile bül kubbe ile oluşturulan akut açı altında sıkışmış bir konumda bırakır. Bu niş tam görselleştirme önce ototoksik ajanın veya esneklik uygulanmasına elde edilmesi zorunludur. Interstisyel sıvı / kan büyük delikler oluşturulan zaman boşluğu sel eğiliminde kapağını açmak sırasında aşırı kemik çıkarma da kaçınılmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> Şekil 9. Temsilcisi sonuçları -. Heptanol bağlı işitme kaybı ve kurtarma işitsel beyin sapı cevabı Ortalama (ABR) eşikleri (dB SPL) ton pip bir fonksiyonu olarak çizilensıklığı. Ölçümler öncesi maruz kalma (Siyah-Kontrol) ve post-operatif gün (POD) 1, 7 ve 14 (Kırmızı) göre gruplandırılmış. Hata çubukları SEM&#39;i temsil etmektedir. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir. 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> Şekil 10. Temsilcisi Sonuçlar - heptanol poz bölüm I&#39;de heptanol ile tedavi kulak Potasyum İç Redresör Değişiklikler (Kir) Kanal 4.1 boyama stria vaskularis içinde (STV) ve kulakları kontrol sonrası koklear hasara Hedefli. (A) Normal Kir 4.1 Kir 4.1 (yeşil) için güçlü strial hücre afinite ile kontrol kulakları tipik boyanarak. POD1 (B) Tedavi kulak. DECR geniş vacuolized bölgelerihafifletti Kir 4.1 afinite STV Kir 4.1 boyanma yoğunluğu genel bir azalma ile birlikte STV (Ok uçları) içinde görülür. Çekirdekler propidyum iyot (kırmızı) (B) ile zıt olan. Ölçek çubuğu 15 mikron =. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> Şekil 11. Temsilcisi Sonuçlar - heptanol maruz bölüm II&#39;de sonra koklear hasara Hedefli heptanol tedavi kulak spiral ligaman (SL) değişiklikler kulak kontrole göre.. Normal görünen tip II spiral ligaman fibrositlerden (II) ile kontrol kulağın tipik SL içinde (A) Normal Kir 4.1 boyama (yeşil). (B) Heptanol ttip II spiral ligaman fibrositlerden, nükleer bozulma ve apoptoz (Oklar) ile tutarlı kromozomal yoğunlaşma / kabarcıkların alanında Kir 4.1 boyama yoğunluğu belirgin azalma ile reated kulak. Çekirdekler propidyum iyot (kırmızı) ile zıt olan. Ölçek çubuğu 15 mikron =. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> Şekil 12. Temsilcisi Sonuçlar -. Heptanol maruziyeti takiben koklear boyama yoğunluğu Recovery 4.1 boyama maruziyet sonrası günün bir fonksiyonu olarak çizilmiştir kır göreli parlaklık ortalama. Bağıl parlaklık heptanol tedavi olarak konfokal mikroskobu altında kır olarak 4.1 yansıtıcı yoğunluğu hesaplanıred kulaklar kontrol kulakla aynı bir yüzdesi olarak alındı. Not POD14-28 verileri eğrisi üzerinde tek bir nokta olarak bir araya getirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil ederken katı daireler, ortalama değerleri temsil etmektedir. Göreli parlaklık önemli bir iyileşme POD 7 ve üstü tarihleri ​​(Student t testi p &lt;0.05, yıldız) arasında gösterilmiştir. Şekil Stevens et al. Re-çizilmiştir, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration at JoVE.com

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

the-mouse-round-window-approach-for-ototoxic-agent-delivery-rapid

Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Görüntüleme.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

Video: The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

Psikolojik Stres Başlatmaya Trier Sosyal Stres Testi Protokolü

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Tıp

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &amp;#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

Α-testi: Tüm Tükürük Kullanarak Hızlı Hücre içermeyen CD4 sayımı

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Lokalize Histopatolojik Analiz için bir Retina Protez ile implant İşleme Teknikleri Gözler için: Bölüm Retina Tacks ile 2 Epiretinal İmplantlar

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Fare kaburga Rezeksiyonu için Cerrahi Prosedür: Büyük Ölçekli Uzun Kemik Onarım İçin Bir Model

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

Farelerde Kararlı Yüksek seviyeli Kemik İliği Kimerizm Yaratma için miyelosupresif Ajan olarak Busulfan

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

İç kulak gen teslim yenidoğan Mouse için posterior semisirküler kanal yaklaşım

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

Transkraniyal Doğru Akım Stimülasyonu Dahil Olmak Üzere Güvenilir, Kolay ve Tolere Edilen Transkraniyal Elektriksel Stimülasyon için Güncellenmiş Teknik

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore potential treatment options. This mouse model allows researchers to induce significant lymphedema lasting at least 8 weeks. Lymphedema is induced using a combination of fractioned radiotherapy and surgical ablation of lymphatics. This model requires that the mice get a dose of 10 Gray (Gy) radiation before and after surgery. The surgical part of the model involves ligation of three lymph vessels and extraction of two lymph nodes from the mouse hindlimb. Having access to microsurgical tools and a microscope is essential, due to the small anatomical structures of mice. The advantage of this model is that it results in statistically significant lymphedema, which provides a good basis for evaluating different treatment options. It is also a great and easily available option for microsurgical training. The limitation of this model is that the procedure can be time consuming, especially if not practiced in advance. The model results in objectively quantifiable lymphedema in mice, without causing severe morbidity and has been tested in three separate projects.

This animal model enables researchers to induce statistically significant secondary lymphedema in the hindlimb of mice, lasting at least 8 weeks. The model can be used to study the pathophysiology of lymphedema and to investigate novel treatment options.

Farelerin Hindlimb Sekonder Lenfödem Indükleme için Gözden Geçirilmiş Bir Yöntem

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...