Biz siyanobakteri suşları sağlamak için Universidad Autonoma de Madrid Dr. Antonio Quesada teşekkür ederim. Bu eser İspanyolca Ministerio de Economía y Competitividad ve Subdirección General de Proyectos de INVESTIGACION (MINECO) tarafından finanse edildi, hayır verir. AYA2011-24803 ve ESP2014-58494-R.

İmünoj hazırlanması 1. <ol><li> Tablo 1 &#39;de tarif edilen koşullar altında, karşılık gelen kültür ortamı her bir siyanobakteri suşu büyütün. NOT: Her siyanobakteri suşu için büyüme ortamı ve kültür koşulları, Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. Tüm Siyanobakteri suşları, K17 hariç, Autonoma Üniversitesi (Madrid, İspanya) Antonio Quesada adlı gruba aittir. Planktothrix rubescens konusu antikorun Vilasouto hazne (Kuzey İspanya) bu siyanobakterisine bir monospesifik çiçek doğal örnek elde edilmiştir. </li><li> Bir geç üstel veya sabit büyüme fazının kültürden yaklaşık 10 8 hücre / ml elde etmek üzere optik mikroskopi ile hücre sayımı odacığı kullanılarak hücrelerin sayısını ölçmek. </li><li> 5 dakika boyunca 2,000 x g santrifüjleme ile kültür içinde 5 mL Hasat hücreleri. </li><li> Süpernatantı atın ve 10 ml küvette hücreleri tekrar süspansiyon1x Fosfat tamponlu tuz 5 mL (1 x PBS) ile E / ml yaklaşık 10 8 hücreleri elde edildi. </li><li> Homojenize ve portatif, elle tutulan ultrasonik işlemci kullanılarak buz üzerinde 30- 60-s duraklama, 5 döngü, 30 saniye için her sonikasyon ile süspansiyon hücreleri lize veya su banyosu içine tüp daldırılarak maksimum genlik (30 kHz) hücre Topu. </li><li> siyanobakteriye her bir suş için 1.5 - Tekrar 1.3 adımları. NOT: Sonikasyon hücre bozulması ve hücresel içeriği salınmasına yol açmaktadır. proteinler ve polisakkaridler gibi lipidler ve nükleik asitler gibi iyi immünojenler, özel moleküller, olsa da, kendi başlarına, bir hümoral bağışıklık tepki doğurmaz. Bu nedenle, bu molekül karmaşıklığını artırmak için, örneğin polisakaridler veya proteinler gibi taşıyıcılara bağlamak gerekir. Buna ek olarak, sonikasyon antikor üretimini tetikleyebilir hücre içi malzeme serbest bırakır. </li></ol> Poliklonal Antikorların 2. Üretim <ol><li> İlk imm hazırlayınTam Freund katkı maddesi, 0.5 mL 1.5 adım elde ultrasonikasyona hücre lizatı 0.5 mL karıştırılarak unogen doz. poliklonal tavşan antikor üretimi için bir hayvan tesisi operatörü teslim. </li><li> tam olmayan Freund katkı maddesi, 0.5 mL aşama 1.5&#39;de elde edilen aynı homojenat / lizat 0.5 mL karışım ile antikor üretim sürecinde bellek artırır gibi başka kullanım için daha önce olduğu gibi üç dozlarını hazırlamak. Antikor üretim sürecini yerine getirmek için hayvan tesisine verin. </li><li> Yineleyin 2.1 ve her yeni antikor üretim süreci için 2.2 adımları. NOT: Uygun lisans ve eğitim hayvanlarla ile çalışmak için gerekli, çünkü Normalde, antikor üretimi, özel hayvan tesisleri veya şirketlere emanet edilmiştir. şirketlerde serum örnekleminde mevcut olan antijen-spesifik antikor miktarında göreli bir enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA), bir ölçüm kaynağı. </li></ol> 3. Antikor Purification <ol><li> Bağışıklık ve proteinsiz bir afinite kromatografisi ile Adım 2&#39;de elde Bağışıklık öncesi serumun hem immünoglobulin G (IgG) fraksiyonu saflaştınlır. Bazı ticari arıtma kitleri, kartuş sistemleri dayalı, iyi çalışır; sağlayıcı yönergeleri izleyin. </li><li> saflaştırma kiti tuz giderme sisteminin temin etmez zaman, diyaliz ya da bir 100 kDa (veya daha düşük) membran gözenek büyüklüğü santrifüj filtre cihazları kullanarak, ya PBS 0.1X üzere saflaştırılmış antikorlar yıkanmasından sonra tampon değiştirin. </li><li> 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek ve bu Bradford 23, Lowry 24 veya Bikinkoninik asit (BCA) 25 olarak kolorimetrik yöntemler kullanılarak antikor konsantrasyonunu belirler. NOT: Bu da epoksi gruplar ile aktive edilmiş katı yüzeylere bağlanmak için bir antikor ile rekabet için elüsyon tamponu (örneğin Tris tampon) amin grupları dahil olmak üzere önlemek için önemlidir. pu sonrarification, ELISA antikor aktivitesi test etmek önemlidir. </li></ol> 4. Floresan Antikor Etiketleme <ol><li> Dimetil sülfoksit, 100 uL (DMSO) içinde proteinin etiketlenmesi 1 mg boya içeren ticari bir şişe eriterek florokrom (örneğin, uzak-kırmızı flüoresan boya) ile bölüm 3&#39;te elde edilen arıtılmış, antikorları etiketlenir. 50 mM fosfat tamponlu tuzlu su (pH 8.5) içinde 50 uL nihai hacimde 2 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyonda her bir antikorun hazırlanmasına çözündürüldü boya 2 ul ekle. </li><li> Ortam sıcaklığında 1 saat ve titreşim platformu ile 1200 rpm&#39;de sürekli ajitasyon altında etiketleme reaksiyonları koruyun. </li><li> Boyut dışlama kromatografisi ile etiketli antikorlar saflaştınlır (örneğin, kolon içine sıkışıp 1.5 ve 30 kDa&#39;lık bir fraksinasyon aralığına sahip bir jel kullanarak) satıcılar tavsiyelerine uyarak. </li><li> 280 nm&#39;de ve yıkama sıvıları olarak, 650 nm&#39;de absorbansı ölçülür ve Labe hesaplanmasıtedarikçisi aşağıdaki önerileri ling verimleri. Not: 50&#39;ye kadar x 50 uL antikor etiketleme reaksiyonları proteinin etiketlenmesi 1 mg floresan boya, tek bir şişe ile yapılabilir. Adım 4.3 sonrası söndürme işlemleri önlemek için opak 0.5 ml tüpler kullanmak alternatif olarak, alüminyum folyo ya da, Tüpleri karşılamak için tavsiye edilir. IgG için en uygun markalama antikorun molü başına boya 3-7 mol ile elde edilir. </li></ol> 5. CYANOCHIP Üretimi <ol><li> Baskı çözümü ile Antikorlar ve kontroller <ol><li> % 0.01 (v / v) Tween 20 (iyonik olmayan bir deterjan), son konsantrasyonlar olarak tüm ticari 1x proteini baskı tampon maddesi içinde 1 mg / ml her bir antikorun karıştırılmasıyla baskı çözümü her bir saflaştırılmış antikorun 30 uL hazırlayın. Not: Alternatif olarak, bir antikor çözeltisi% 20 gliserol,% 1 sükroz (ya da trehaloz, koruyucu olarak) ve% 0.01 (w / v) (hacim / hacim) karbonat tamponu içinde Tween 20 (pH 8.5) ihtiva edebilir. </li><li> 30 uL kontroller olarak baskı çözeltisi hazırlayın: 1 mg (a) 1 x proteini baskı tamponu,% 0.01 (h / h) Tween 20, (B) protein-A saf ön bağışıklık serumu ile / 1x proteini baskı tamponu ile mi % 0.01 (v / v) Tween 20, ve 1 mg (c), sığır serum albümini (BSA) /% 0.01 mL 1x protein baskı tampon maddesi (hac / hac) Tween 20. </li><li> (Örneğin, 1 ug / ml, 50 ug / ml arasında) Tween 20 ile 1x proteini baskı tamponu içerisindeki aşama 5.1.1 farklı konsantrasyonlarda floresan etiketli saflaştırılmış ön-immün serum 30 ul hazırlar. Bu örnekler, flüoresan çerçeve belirteçleri olarak ve tespit sonrası nispi parlaklık ölçümü için kullanılır. </li><li> polipropilen gibi, yüksek kaliteli 384 oyuklu mikro mikrodizi üretimi için 30 adım 5.1.1 5.1.2 hazırlanan baskı çözümleri oyuk başına uL ve 5.1.3 ekleyin. NOT: Protein baskı tampon antikorların kalite ve stabilitesini artırır ve Tween 20 nokta mo homojenizerphology ve protein bağlama yukarı kurar. Kullanmadan önce, 4 ° C &#39;de 384 mikroplakanın korumak için tavsiye edilir. zaman uzun süreler için -20 ° C&#39;de saklayın. Polipropilen düşük DNA, protein, hücre özü, ve içsel bağlama küçük molekül vardır. </li></ol></li><li> Bir mikroskop lamı üzerine Antikor baskı NOT: temas, bölünmüş iğne, ya da piezoelektrik yazıcılar veya &quot;mürekkep püskürtmeli&quot; teknolojileri gibi temassız cihazlar gibi farklı dizi platformları kullanarak aktive mikroskop lamı üzerine antikorlar yazdırın. Bu çalışmada, CYANOCHIP rutin mikron ölçeğinde antikorların nL miktarlarda tespit edebilen bir robot sistemi (arrayer) kullanarak temas ile basılmıştır. <ol><li> % 50 bağıl nem - 20 ° C ve 40 baskı odanın çevre koşullarını ayarlayın. </li><li> Slayt yüzeyler kurma (örneğin, 75- x 25 mm epoksi aktive mikroskop cam slaytlar) birçok özdeş antikor Arra gerçekleştirmek içinHer slaytta ys. </li><li> Bir üçlü nokta desen kontrolleri ve referans çerçevesi de dahil olmak üzere her saflaştırılmış antikor, spot; Çapı 200 um - Bu koşullar altında, noktalar 180 vardır. </li><li> Baskıdan sonra, 4 ° C&#39;de saklayın sonra kurumaya bırakın ortam sıcaklığında en az 30 dakika süreyle slaytlar bırakın ve; alanında çalışan için, lamlar nakledilebilir ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. NOT: CYANOCHIP slayt başına 3 x 8 özdeş mikroarray&#39;ler veya 1 x 9 mikroarray formatında 9 özdeş dizileri ile bir üçlü nokta mikroarray formatında yazdırılır. Her dizi boyutu 24 oyuklu bir conta (3 x 8 melezleştirme odası içinde genellikle 7.5 x 6.5 mm) tepkime haznesi boyutlarından daha yüksek olmamalıdır. </li><li> çevresel numuneler analiz mikrodizisi kullanmadan önce, bir titrasyon eğrisi her bir antikor için çalışma seyreltisi belirlemek için FSMI kullanın. Her antikor için, karşılık gelen imm standart konsantrasyon kullanımıunogen (10 Mart-10 Nisan hücre / ml) ve fluoresan antikor seri seyreltileri (1 ila 500, 1: 32,000). uygun antikor konsantrasyonu titrasyon eğrisinde elde edilen maksimum sinyal yoğunluğunun% 50&#39;sine karşılık gelir. Blanco ve ark tarif edildiği gibi aynı zamanda, her bir antikor için hassasiyet ve özgüllük, belirlenmelidir. 22. </li></ol></li></ol> Floresan Sandviç Mikroarray Immunoassay Çevre Çoklu Analit özleri 6. Hazırlama (FSMI) <ol><li> Sıvı örnek birden fazla analit özü <ol><li> (Bir su haznesi kıyıdan, örneğin, su), steril bir şırınga ile sıvı numune, 100 mL 1 - alın Numunenin miktarı, hedefleri potansiyel konsantrasyonuna bağlı büyük ölçüde bağlıdır. </li><li> 3 mikron gözenek büyüklüğü, 47 mm çapında bir polikarbonat filtreden su örneği geçirilmesiyle hücrelerin konsantre; Bir hücre konsantrasyonu3, 10 ila - hücreleri 10 8 ug / ml pozitif saptanması için arzu edilen bir durumdur, ancak gerçek konsantrasyonu bilinmemektedir. </li><li> ile kazınarak, bir tadil edilmiş Tris-tamponlu tuzlu su, 1 mL Tween 20 ile takviye edilmiş tampon maddesi (0.4 M Tris-HCl (pH 8), 0.3 M NaCI ve% 0.1 Tween 20 TBSTRR) ile filtre toplanan biyokütle kurtarma 15 mL&#39;lik bir tüp içerisine spatula. </li><li> Homojenize ve ya sadece aşağı birden çok kez yukarı pipetleme ve adım 1.5 açıklandığı gibi, bir el ultrasonik işlemci kullanarak ayrıştırmak; Bu mikroarray ile analiz için örnek hazırlar. </li></ol></li><li> Katı bir örnekten birden fazla analit özü <ol><li> 10 ml tüp içine katı numune 0.5 g (örn kaya, toprak, ya da sedimanlar) kadar tartılır ve TBSTRR 2 mL kadar ekleyin. </li><li> güçlü Sonikatör boynuzunun su banyosu içine tüp batırılmasıyla veya bir el sonikatör kullanılarak tüp içinde sonikasyon probu daldırarak sonikasyon. en az 5 x 30-s gerçekleştirmebuz üzerinde iken 30 saniye süreyle durdurma 30 kHz çevrimi. </li><li> 10 ila 12 mm çapa bağlanmış bir 10 mL&#39;lik bir şırınga, 5 20 um gözenek boyutlu naylon filtre tutucusu ile kum, kil ve diğer iri malzemenin çıkarılması için filtre. 1.5 ml tüp içine filtre üzerinden örnek itin. Filtre Doymuş Eğer şırınga süspansiyon ajite ve yeni bir götürün; Bu immunoassay (adım 7) için süzüntü malzemesini hazırlar. NOT: TBSTRR tamponlama kapasitesi numune tipine bağlıdır. Analitler enzimatik degradasyon etkisini önlemek için çevresel ekstrenin hazırlanmasından hemen sonra bağışıklık tahlilini gerçekleştirmek için önemlidir. Seçenek olarak ise, bir sonraki aşamada -80 ° C kadar çevre özü ve dondurularak protaz inhibitörleri ekleyin. </li></ol></li></ol> 7. Floresan Sandviç Mikroarray Immunoassay (FSMI) <ol><li> CYANOCHIP engelleme NOT: Kullanımdan hemen önce, s tedavirinted slayt tüm epoksi gruplarını bloke etmek ve kovalent olmayan bir şekilde bağlı olan antikorların fazlasının ayrılması için kayar. <ol><li> % 5, 0.5 M Tris-HCl (pH 9) içine bir mikro daldırın 5 dakika için ve bir rocker platformunda gelen hafif bir sallama ile temiz bir yüzeye BSA çözeltisi (örneğin, Petri kabı ya da bir 50 ml tüp) (ağ / hac). Alternatif olarak, o bakan mikroarray noktalar yukarıdaki çözümün bir 100- 200 ul damla üzerine aşağı slayt yatıyordu. 3 bekletin - 5 dakika sonra devam edin. </li><li> Dikkatle plastik uçlu forseps kullanarak slayt pick up; dokunmaktan mikroarray bölgeleri önlemek için deneyin. yumuşak bir kağıt havlu üzerine slayt vurarak sıvının fazlalığı ortadan kaldırın. % 2 ile 0.5 M Tris-HCl (pH 8) ve bir rocker platformunda gelen hafif bir çalkalama ile 30 dakika boyunca (ağırlık / hacim) BSA çözeltisi içinde bırakın. </li><li> mikroskop lamı için uyarlanmış bir ticari mıkro kullanarak - (1 dakika için 300 xg 200) kısa bir santrifüj yaparak slayt kurulayın. Alternatif olarak, usulca ont vurarak slayt kurutmakoa kağıt havlu. </li></ol></li><li> Mikroarray ile birden fazla analit örnek ekstresinin Kuluçka <ol><li> Birden fazla mikroarray&#39;ler 24 kuyuları ile ticari mikroarray hibridizasyon kasetine slayt kurmak; sağlayıcı yönergeleri izleyin. </li><li> slayt ve kaset montaj sonrası, numune ekstraktının veya kaset her kuyuya TBSTRR bunun bir seyreltme 50 uL kadar pipet. </li><li> Her bir numune için yineleyin 7.2.2 analiz edilecek. </li><li> Boş kontrol olarak TBSTRR Pipet 50 uL kasetinin en az iki ayrı oyuklarına tampon. </li><li> Her 15 dakikada bir pipetleme veya hafif çalkalama altında bırakarak karıştırılarak 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Seçenek olarak ise, 4 ° C&#39;de 12 saat boyunca inkübe edilir. Not: mikrodizi desen bir fonksiyonu olarak diğer inkübasyon contalar kullanın. Zaman ve aşama 7.2.5 inkübasyon sıcaklığı, normal olarak afinite ve bağlama Ki bağlıdır ampirik parametrelerdirher davi s antijen-antikor eşleştirilmiş. </li></ol></li><li> Yıkama <ol><li> aşağı Kaseti koyarak ve dikkatli bir temiz, emici kağıt üzerine vurmak suretiyle örnekleri çıkarın. </li><li> Yukarıdaki gibi, her biri için TBSTRR 150 uL ekleyerek kuyuları yıkayın ve tampon ortadan kaldırır. </li><li> Adımı yineleyin 7.3.2 üç kez daha. </li></ol></li><li> Floresan detektör antikorlarla kuluçkalama <ol><li> 17. Anti-siyanobakteri-streyn antikorları ihtiva eden bir antikor karışımı 50 ul ekleyin, her% 1 (ağırlık / hacim) BSA ile TBSTRR olarak florokrom etiketli. (0.7 ile 2 ug / mL) karışımı içinde her floresan antikor konsantrasyonunu belirleyin her bir antijen / antikor çiftinin 22 titrasyon deneyleri yaparak. </li><li> Aşama 7.2.5 anlatılan ya da 4 ° C &#39;de 12 saat boyunca da ortam sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. </li></ol></li><li> Floresan antikor dışarı yıkanması &lt;/ Strong&gt; <ol><li> Adım 7.3 gibi floresan bağlanmamış antikorlar çıkarın. </li><li> Kaseti sökülmesi ve hızlı durulama (50 ml tüp örneğin,) 0.1x PBS içine slayt batırmayın. </li><li> Adım 7.1.3 olarak slayt kurutun. </li></ol></li></ol> Floresan 8. Tarama <ol><li> floresan bir tarayıcı uzak-kırmızı floresan boya için maksimum emisyon floresan zirvesinde floresan slayt tarayın. Genellikle lazer kazanç değerini düşürerek, farklı tarama parametrelerinde microarrays birkaç fotoğraf çekmek. NOT: kaçının doymuş noktalar (&gt; 65,000 floresan sayımları) -onlar ölçek dışında ve miktar hataları tanıtmak olabilir. </li></ol> 9. Görüntü İşleme ve Veri Analizi <ol><li> Görüntü analizi ve ölçümü için bir ticari yazılım kullanma; e (tek noktadan tüm piksellerin medyan veya ortalama FI) yazılım floresan yoğunluğu ölçümleri sağlarBütün mikroarray ach nokta. - FI yerel arka plan FI = Fİ nokta: noktalar etrafında yerel arka plan çıkarın. </li><li> FI verileri kaydetmek ve bir elektronik tablo programı kullanarak açın. </li><li> yanlış pozitif tespit ve atmak için negatif kontrol olarak boş diziler için elde edilen değerleri kullanın. Her antikor nokta FI hesaplamak için aşağıdaki denklemi uygulayın: - FI örneği = Fİ nokta - mikrodizinlerini FI yerel arka plan örnek özü ve boş FI = Fİ nokta ile çalışacak - FI = (FI boş FI numune) FI yerel arka plan boş mikrodizinlerini. </li><li> 2- ek bir kesme eşik uygulamak yanlış pozitif olasılığını en aza indirmek için bütün mikroarray FI ortalama 3 kat; Bu düşük kaliteli mikroarray görüntüler ve düşük sinyal-gürültü oranları için özellikle geçerlidir. </li><li> araziler oluşturmak ve / veya gerektiğinde daha ileri analiz yapmak. </li&gt; </ol>

<ol>
	<li>Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+sensing+of+the+cyanobacterial+pigment+phycocianin+in+turbid+inland+water.">Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water.</a> Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).</li><li>Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+potentially+toxic+cyanobacteria+using+an+online+multi-probe+in+drinking+water+sources.">Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources.</a> J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).</li><li>Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+for+the+isolation,+detection+and+quantification+of+cyanobacterial+hepatotoxins.">Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins.</a> Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).</li><li>Weller, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoassays+and+biosensors+for+the+detection+of+cyanobacterial+toxins+in+water.">Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water.</a> Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).</li><li>Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cyanobacteria+and+their+toxigenicity+in+environmental+samples+by+rapid+molecular+analysis.">Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis.</a> Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).</li><li>Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+response+to+hydrogen+peroxide+and+the+putative+PerR+regulon+of+Synechocystis+sp.+Strain+PCC+6803.">Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803.</a> J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).</li><li>Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+understanding+harmful+algal+blooms:+paradigm+shifts+and+new+technologies+for+research,+monitoring,+and+management.">Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management.</a> Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).</li><li>Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+testing+for+the+presence+of+toxic+algae+monitoring+programme+in+Galicia+(NW+Spain).">Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain).</a> Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).</li><li>Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Project+MIDTAL:+its+methods+and+samples+from+Arcachon+Bay,+France.">Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France.</a> Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).</li><li>Marcheggiani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+emerging+and+re-emerging+pathogens+in+surface+waters+close+to+an+urban+area.">Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).</li><li>Fern&#225;ndez-Calvo, P., N&#228;ke, C., Rivas, L. A., Garc&#237;a-Villadangos, M., G&#243;mez-Elvira, J., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-array+competitive+immunoassay+for+the+detection+of+broad-range+molecular+size+organic+compounds+relevant+for+astrobiology.">A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology.</a> Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).</li><li>Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).</li><li>Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+immunoassay+detection+of+multiple+environmental+chemicals+on+protein+microarrays+using+DNA/dye+conjugate+as+a+fluorescent+label.">Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label.</a> J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).</li><li>Rivas, L. A., Garc&#237;a-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., G&#243;mez-Elvira, J., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+200-Antibody+microarray+biochip+for+environmental+monitoring:+Searching+for+universal+microbial+biomarkers+through+immunoprofiling.">A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling.</a> Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).</li><li>Delehanty, J. B., Ligler, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microarray+immunoassay+for+simultaneous+detection+of+proteins+and+bacteria.">A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria.</a> Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).</li><li>Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+biosensor+for+detection+of+toxins.">Array biosensor for detection of toxins.</a> Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).</li><li>Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+microarrays+for+native+toxin+detection.">Antibody microarrays for native toxin detection.</a> Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).</li><li>Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-based+biosensors+for+environmental+monitoring.">Antibody-based biosensors for environmental monitoring.</a> Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).</li><li>Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+portable+array+biosensor+for+multisample+microcystin+analysis+in+freshwater+samples.">Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples.</a> Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).</li><li>Shlyapnikov, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+simultaneous+ultrasensitive+immunodetection+of+five+bacterial+toxins.">Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins.</a> Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).</li><li>Szkola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+detection+of+ricin,+staphylococcal+enterotoxin+B+and+saxitoxin+by+chemiluminescence-based+microarray+immunoassay.">Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay.</a> Analyst. 139, 5885-5892 (2014).</li><li>Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carre&#241;o, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CYANOCHIP:+An+antibody+microarray+for+high-taxonomical-resolution+cyanobacterial+monitoring.">CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring.</a> Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding.">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+Bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using Bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., Gonz&#225;lez-Toril, E., Parro, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graph-based+deconvolution+analysis+of+multiplex+sandwich+microarray+immunoassays:+applications+for+environmental+monitoring.">Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring.</a> Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).</li><li>Blanco, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+prokaryotic+community+and+metabolisms+in+south+african+deep-mine+biofilms+through+antibody+microarrays+and+graph+theory.">Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory.</a> PloS One. 9 (2), e114180 (2014).</li><li>Gas, F., Baus, B., Quer&#233;, J., Chapelle, A., Dreanno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+quantification+of+the+marine+toxic+algae,+Alexandrium+minutum,+using+a+super-paramagnetic+immunochromatographic+strip+test.">Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test.</a> Talanta. 147, 581-589 (2016).</li><li>Parro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOLID3:+a+multiplex+antibody+microarray-based+optical+sensor+instrument+for+in+situ+life+detection+in+planetary+exploration.">SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration.</a> Astrobiology. 11, 15-28 (2011).</li><li>McKay, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Icebreaker+Life+Mission+to+Mars:+a+search+for+biomolecular+evidence+for+life.">The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life.</a> Astrobiology. 13, 334-353 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, CYANOCHIP, siyanobakteri cinslerin çeşitli saptanması ve tanımlanması için bir 17-antikor mikrodizisi kullanılarak çoklu bir flüoresan sandviç immüno 22 tarif edilmiştir. Bu siyanobakteri, tatlı su ortamlarında bazıları olmanın toksin üreticileri en sık bentik ve planktonik cinsi temsil etmektedir. Son zamanlarda, flüoresan sandviç immüno biçimi çevre uygulamaları 26, 27, <sup class="xr...

algılama ve karmaşık doğal mikrobiyal topluluklar mikroorganizmaların izlenmesi biyomedikal, çevre ekoloji ve Astrobiyoloji dahil olmak üzere birçok alanda, son derece önemlidir. Taze su içinde hücre çoğalması (aşırı çoğalması) oluşturmak için yetenekleri açısından iyi bilinen prokaryotik mikroorganizma Siyanobakteriler bulunmaktadır. Bunlar her yerde vardır, ve birçok türün insan sağlığı için potansiyel bir risk değil, aynı zamanda bir ekolojik etkisi sadece lider, toksinler üretebiliriz. Bu bağlamda, siyanobakteriler ve / veya toprak ve su içinde toksinlerin erken teşhisi için hızlı ve hassas bir yöntem geliştirmek gereklidir. Su yöneticileri uygun su yönetim programlarının uygulanmasında, dolayısıyla karar verme onlara yardım ve bu amaçla, bir multipleks floresan sandviç mikrodizi immunoassay (FSMI) bir araç olarak geliştirilmiştir. yöntemler çeşitli bir yelpazede algılamak ve mavi tanımlamak için geliştirilmiştirOptik mikroskopi, moleküler biyoloji, ve immünolojik teknikler de dahil olmak üzere toprak ve su içinde obacterial hücreleri ve cyanotoxins. Bu yöntemler sağladıkları bilgiler büyük ölçüde değişebilir. Mikroskopik teknikler, hücre morfolojisi ve phycocyanin olarak siyanobakteri pigmentler arasında in vivo olarak floresans algılama ya da 1 klorofil dayanmaktadır. Onlar türü ve bir numunede mevcut Siyanobakterinin sayısı hakkında bilgi gerçek zamanlı ve sık izlenmesi için hızlı ve ucuz yöntemler olmasına rağmen, onlar potansiyel toksisitesi ile ilgili bilgi vermemektedir. Buna ek olarak, genellikle yakın türler 2 ayırt etmek zor olduğu göz önünde, uzmanlık belirli bir düzeyde gerekir. Bu sınırlamaları aşmak için, ışık mikroskobu, biyolojik ve biyokimyasal tarama deneyleri ve cyanotoxins tanımlanması ve ölçümü için fizikokimyasal yöntemlerle hem eşlik etmelidir. <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; enzim bağlı immünosorbent deneyleri (ELISA), protein fosfat inhibisyonu tahlilleri (PPIA), ve farelerde nöro-kimyasal testler cyanotoxins saptanması için biyokimyasal tarama deneyleri örnekleridir. İlk iki hızlı ve duyarlı bir metodolojileri iken kullanılarak ELISA ve PPIA testleri toksinler üç tip ile sınırlı olduğunda, yanlış pozitif tarif edilmiştir. Fare biyoassay gerekli düşük duyarlılık ve hassasiyet, ve özel lisanslama ve eğitim ile niteliksel bir tekniktir. Buna ek olarak, bir numunede mevcut olan toksinlerin türü hakkında bilgi vermemektedir. Cyanotoxins tanımlanır ve bu, yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi analitik yöntemler (HPLC), sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi ile tayin edilebilir (LC-MS), gaz kromatografisi (GC), gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi (GC-MS), veya matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma uçuş süresi (MALDI-TOF). referans standartları, gerek hangi Ancak, bu mümkündürKarmaşık numuneler bireysel toksin konsantrasyonlarını belirlemek için baskı, 3, 4 mevcuttur. Ayrıca, bu metodlar zaman alıcıdır; pahalı ekipman, sarf malzemeleri ve numune hazırlık gerektirir; deneyimli ve uzman personel tarafından yapılmalıdır. Moleküler tabanlı yöntemler genom veritabanlarında yayınlanan dizi bilgiler sayesinde, tespit belirlemek ve siyanobakteri ve bunlara karşılık gelen cyanotoxins ölçmek için yıllardır uygulanmış olan (örneğin, Biyoteknoloji Bilgi, NCBI Ulusal Merkezi). Bu yöntemler arasında, DNA amplifikasyonu için primerlerin setleri tasarım gerektirir ve farklı siyanobakteri türlerinin DNA dizileri önceki bilgiye dayanır, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dayalı olanlardır. Gen tespiti, phycocyanin operon gibi, cins düzeyinde doğru tanımlama yol açarken, bazı türler veya suşları ile algılanmayan olanBu method. Bununla birlikte, bu mikrosistin operon ait olanlar gibi, toksin kodlayıcı genleri, üretici 5 kıt örneklerde toksinlerin belirlenmesini kolaylaştırmaktadır. Yine de, PCR ile toksin işaretlerinin saptanması gerekli ortamında toksisite anlamına gelmez. Ayrıca, bir numunede bulunan siyanobakteri ve toksin üretici türlerinin dizi analiz için geliştirilmiş primerler kümesi hala eksik ve ileri çalışmalar bilinmeyen türler tanımlamak için yapılmalıdır. Diğer moleküler teknikler in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA mikrodizileri floresan olarak, PCR-olmayan dayanmaktadır. son yirmi yılda, mikrotertip teknolojisi, özellikle çevresel izleme, uygulama birçok alanda önem kazanmıştır. DNA mikroarray&#39;ler türler ve analit 4 ayrımı, 6, 7 izin </sup&gt;, 8, 9, 10, fakat çok zahmetli ve zaman alan bir çok adım (örneğin, mikro-dizi performansı, DNA izolasyonu, PCR amplifikasyonu ve hibridizasyon) işlerde olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür bir sandviç ve rekabetçi immünolojik microarrays gibi antikorlar, göre daha az zaman alan deneyler, çoklu ortam analitler 11, 12, 13 tespit edilmesi için gerekli bir güvenilir ve yüksek verimli bir yöntem olmuştur. Antikorların yeteneği özel hedef bileşikleri tanıyan ve hemen hemen her maddeye karşı antikorların üretilmesi olasılığı ile birlikte, analit ve proteinlerin küçük miktarlarda tespit etmek için, antikoru mikrodizilerinde Çevre amaçlar için güçlü bir yöntem tercih. Buna ek olarak, birden fazla sağlama yeteneği olarak analizIngle deneyi, ppm ppb&#39;ye kadar algılama sınırları ile bu yöntem 14 ana avantajlarından biridir. Antikor-biyosensörler çevresel izleme 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 patojen ve zehirli geniş saptanması için, hassas ve hızlı bir araçlar olduğu kanıtlanmıştır. DNA yöntemleri çeşitli adımlar içerir birlikte, antikor bazlı mikrodizileri, yalnızca, uygun bir tampon çözelti kısa bir parçalama adımında dayanan küçük bir örnek hazırlık gerektirir. Delehanty ve Ligler 15 4 ppb An bir protein konsantrasyonu tespit edebilen bir antikor sandviç bağışıklık tahlili göre protein ve kompleks karışımlar bakteriyel analitlerin eşanlı deteksiyonunu raporD 10 4 cfu / hücrelerin ml. Szkola ve ark. 21 biyolojik savaş kullanılan olabilir proteotoxins ve küçük toksin, bileşiklerin birinin eş zamanlı saptanması için ucuz ve güvenilir bir çoklu mikrodizisi geliştirdik. Onlar az 20 dakika içinde 3 ppb, algılama limitli, risin toksin konsantrasyonları tespit edildi. Son zamanlarda, CYANOCHIP, zehirli ve toksik olmayan siyanobakteriler saptanması için bir antikor mikroarray bazlı biyosensör, 22 tarif edilmiştir. Bu mikrodizi çoğunlukla mikroskobik tespit etmek zordur sucul ortamlarda, potansiyel Siyanobakteri sahası belirlenmesi için izin verir. Hatta tür seviyesinde, çok katlı algılama ve siyanobakteri tanımlanması için düşük maliyetli bir araç haline Bu biyosensör dönüm çok türün 10 3 hücreleri, - mikrodizisinin tespit limiti 10 2 &#39;dir. Bütün bu özellikler Antibo haledy mikrodizi tekniği ve bu çalışmada sunulan özel yöntem daha hızlı ve daha basit bir yöntem, söz konusu tekniklere göre. Bu çalışma, toprak ve su örneklerinde Siyanobakterinin varlığını tespit etmek bir antikor mikroarray tabanlı biyosensör kullanmak deney iki örneklerini sunar. Çok küçük örnek hacimleri ve çok temel örnek hazırlama gerektiren bir sandviç immunoassay biçimine dayanan basit ve güvenilir bir yöntemdir. yöntem, kısa bir süre gerektirir ve kolay bir alanda gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>0.22 mm pore diameter filters</td><td>Millipore</td><td>GSWP04700</td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp; 5424R microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011036</td><td>50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Ultrasonic processor UP50H</td><td>Hielscher</td><td></td><td>For preparation of immunogens</td></tr><tr><td>Complete Freund&#039;s adjuvant&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881</td><td>Immunopotentiator</td></tr><tr><td>Incomplete Freud&#039;s adjuvant</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F5506</td><td>For boost injections</td></tr><tr><td>Protein A antibody purification kit&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PURE1A&amp;nbsp;</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Centrifugal filter devices MWCO&amp;lt;100 kDa</td><td>Millipore</td><td>UFC510096-96K</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Dialysis tubings, benzoylated</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7884-10FT</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 columns&amp;nbsp;</td><td>GE-HealthCare</td><td>GE27-5330-02</td><td>For isolation of IgG</td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6916-500 mL</td><td>To quantify the antibody concentration</td></tr><tr><td>MicroBCA protein assay kit&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23235</td><td>To quantify the antibody concentration</td></tr><tr><td>Protein arraying buffer 2x</td><td>Whatman (Sigma Aldrich)&amp;nbsp;</td><td>S00537</td><td>Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20</td></tr><tr><td>Tween 20&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9416</td><td>Non-ionic detergent</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9418</td><td>Control&amp;nbsp; for printing; blocking reagent</td></tr><tr><td>384-wells microplate</td><td>Genetix</td><td>X6004</td><td>For antibody printing</td></tr><tr><td>Robot arrayer for multiple slides</td><td>MicroGrid II TAS arrayer from Digilab</td><td></td><td>For antibody printing</td></tr><tr><td>Epoxy substrate glass slides</td><td>Arrayit corporation</td><td>VEPO25C</td><td>Solid support for antibody printing</td></tr><tr><td>Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester&amp;nbsp;</td><td>Molecular probes</td><td>A20006</td><td>Fluorochrome</td></tr><tr><td>DMSO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D8418</td><td>Fluorochrome dissolvent</td></tr><tr><td>Heidolph Titramax vibrating platform shaker</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>For antibody labeling&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Illustra Microspin G-50 columns&amp;nbsp;</td><td>Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td>For purification of labeled antibodies</td></tr><tr><td>Safe seal brown 0.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72,704,001</td><td>For labeled antibodies storage&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nanodrop 1000 spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>To quantify antibody concentration and labeling efficiency</td></tr><tr><td>3 &amp;micro;m pore size polycarbonate 47 mm diameter filter</td><td>Millipore</td><td>TMTP04700</td><td>To concentrate cells</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride solution pH 8</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T3038</td><td>For TBSTRR preparation; to block slides</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>For TBSTRR preparation</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m nylon filters&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NY2004700</td><td>For environmental extract preparation</td></tr><tr><td>10 - 12 mm filter holders</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td>For environmental extract preparation</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P8340</td><td>For environmental extract storage</td></tr><tr><td>1 M Trizma hydrochloride solution pH 9</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T2819</td><td>To block slides</td></tr><tr><td>Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker</td><td>VWR</td><td></td><td>To block slides; for incubation processes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>VWR Galaxy miniarray microcentrifuge</td><td>VWR</td><td>C1403-VWR</td><td>To dry slides</td></tr><tr><td>Multi-Well microarray hybridization cassette</td><td>Arrayit corporation</td><td>AHC1X24</td><td>Cassette for 24 assays per slide</td></tr><tr><td>GenePix 4100A microarray scanner&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Scanner for fluorescence</td></tr><tr><td>GenePix Pro Software</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software for image analysis and quantification</td></tr></tbody></table>

experimental protocol for detecting cyanobacteria in liquid and solid samples with an antibody microarray chip

Küresel ısınma ve ötrofikasyon bazı sucul ekosistemlerin hızlı ve kitlesel siyanobakteri büyümesini tetikleyecek kadar gerçek biyoreaktörler davranırlar yapmak; Bu, ilgili sağlık ve ekonomik sonuçları vardır. Birçok Siyanobakteri suşları toksin üreticileri, ve sadece birkaç hücre çevreye onarılamaz zarar ikna etmek için gereklidir. Bu nedenle, su vücut yetkililer ve idareleri önleyici veya iyileştirici kararları desteklemek için güvenilir veri sağlama, hızlı ve verimli erken uyarı sistemleri gerektirir. Bu el yazması taksonomik çözünürlük (CYANOCHIP) ile 17 antikorları (Abs) ile bir antikor mikroarray çip kullanılarak toksin üreten Siyanobakteri suşları alan içinde tespiti için deneysel bir protokol bildirir. Burada, 17 siyanobakteriyel soyların aynı anda izlenmesi için çoklu bir flüoresan sandviç mikrodizi immüno (FSMI) sık sık tatlı su ekosistemlerinin açan bulunan, bazıları toksin üretici tarif edilmektedir. Çok olan bir mikrotertipple CYANOCHIP bölgesinin (24 saate kadar) benzer çoğaltır eş zamanlı numune benzer sayıda test etmek için, tek bir mikroskop lamı üzerine basılmıştır. Sıvı numuneleri antikorların (antikorlar) ile doğrudan inkübasyon yoluyla ya da 1 ila 3 mikron filtre içinden süzme ile hücre konsantrasyonu da sonra test edilebilir. Bu tortuların ve zemin taş gibi katı örnekleri, önce homojen hale getirilir ve bir kuluçka tampon maddesi içinde bir elde tutulan ultrasonikatör ile dağıtılır. Kaba malzeme çıkarmak göre - (20 uM 5) ve süzüntü Abs ile inkübe edilir Daha sonra filtrelenir. Immün reaksiyonlar 17 floresan etiketli antikorların bir karışımı ile bir son inkübasyon ile açığa çıkar ve taşınabilir floresan dedektör tarafından okunur. Tüm süreç en iyi şekilde inkübe iki 1 -H süreleri içinde elde edilen, yaklaşık 3 saat sürer. Çıktı parlak noktalar Siyanobakteri belirteçlerin olumlu algılama karşılık bir resim vardır.

Bu çalışma CYANOCHIP antikoru mikrodizisi kullanılarak en uygun, tatlı su, siyanobakteri türlerinin anında belirlenmesi (Tablo 1), çoklu bir bağışıklık testi anlatılmıştır. mikroarray mikroskop lamı üzerine basılmış bir 3 x 8 mikroarray biçimi olabilir. Her bir mikrodizi negatif kontroller olarak a, üçlü bir nokta desen baskılı 17 antikorlarının grubu, karşılık gelen ön-immün antikorları ve BSA oluşur. Mikro-diziler, aynı zamanda kol...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip at JoVE.com

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Saptamak için deneysel protokol<em&gt; Siyanobakteri</em&gt; Bir Antikor Mikroarray Chip ile Sıvı ve Katı Örneklerinde

Global warming and eutrophication make some aquatic ecosystems behave as true bioreactors that trigger rapid and massive cyanobacterial growth; this has ...

experimental-protocol-for-detecting-cyanobacteria-liquid-solid

Research

JoVE Journal

Environment

Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

9.0K Görüntüleme.  Centro de Astrobiología (CAB, INTA-CSIC). The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Video: Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip

Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

Bacterial Detection & Identification Using Electrochemical Sensors

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Elektrokimyasal Sensörler kullanarak Bakteriyel Algılama ve Tanıma

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of cyanobacteria and related cyanotoxins in water samples and in an organic matrix, such as bivalve extracts. FDS combines remote/proximal sensing techniques with analytical/bioinformatics analyses. Sampling spots are chosen through multi-disciplinary, multi-scale, and multi-parametric monitoring in a three-dimensional physical space, including remote sensing. Microscopic observation and taxonomic analysis of the samples are performed in the laboratory setting, which allows for the identification of cyanobacterial species. Samples are then extracted with organic solvents and processed with LC-MS/MS. Data obtained by MS/MS are analyzed using a bioinformatic approach using the online platform Global Natural Products Social (GNPS) to create a network of molecules. These networks are analyzed to detect and identify toxins, comparing data of the fragmentation spectra obtained by mass spectrometry with the GNPS library. This allows for the detection of known toxins and unknown analogues that appear related in the same molecular network.

A fast-multidisciplinarystrategy for early detection of cyanobacterial blooms and associated cyanotoxins is described here. It allows for the detection of cyanobacteria and related cyanotoxins in water samples and in organic matrices, such as bivalve samples, in 24 h.

Hızlı Algılama Stratejisi Kullanılarak Siyanobakteri Çiçeklenmelerinin ve İlişkili Siyanotoksinlerin Erken Tespiti

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

Kimya

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Biyoloji

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge to the development of universal influenza vaccines is high antigenic diversity resulting from antigenic drift. Overcoming this challenge requires novel research tools to measure the breadth of serum antibodies directed against many virus strains across different antigenic subtypes. Here, we present a protocol for analyzing the breadth of serum antibodies against diverse influenza virus strains using a protein microarray of influenza antigens.
This influenza antigen microarray is constructed by printing purified hemagglutinin and neuraminidase antigens onto a nitrocellulose-coated membrane using a microarray printer. Human sera are incubated on the microarray to bind antibodies against the influenza antigens. Quantum-dot-conjugated secondary antibodies are used to simultaneously detect IgG and IgA antibodies binding to each antigen on the microarray. Quantitative antibody binding is measured as fluorescence intensity using a portable imager. Representative results are shown to demonstrate assay reproducibility in measuring subtype-specific and cross-reactive influenza antibodies in human sera.
Compared to traditional methods such as ELISA, the influenza antigen microarray provides a high throughput multiplexed approach capable of testing hundreds of sera for multiple antibody isotypes against hundreds of antigens in a short time frame, and thus has applications in sero-surveillance and vaccine development. A limitation is the inability to distinguish binding antibodies from neutralizing antibodies.

We present a protocol for using a protein microarray constructed by printing influenza antigens onto nitrocellulose-coated slides to simultaneously probe serum for multiple antibody isotypes against over 250 antigens from different virus strains, thus allowing measurement of the breadth of serum antibodies across virus subtypes.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

The influenza virus remains a significant cause of mortality worldwide due to the limited effectiveness of currently available vaccines. A key challenge ...

An Assay to Detect Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G

Source: Liu, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/59014">Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2019)
The video demonstrates a cell-based assay for detecting anti-aquaporin-4 immunoglobulin G using a biochip containing untransfected cells and transfected cells expressing aquaporin-4. This method has applications in diagnosing neuromyelitis optica spectrum disorders, confirmed by strong green fluorescence on the biochip.

Serum Anti-aquaporin-4 İmmünoglobulin G'yi Tespit Etmek İçin Bir Test

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

İmmünoloji

Antikor Tabanlı Teknolojiler

Karakterizasyon ve Fonksiyonel Analiz

Antibody Microarray: A Technique to Study the Protein Expression of miRNA Treated Lung Cancer Cells

Source: Hossian, A. et. al. <a href="https://www.jove.com/v/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique to study the protein expression in miRNA transfected lung cancer cells by using antibody microarray to measure specific gene expression. In the featured protocol, we perform antibody microarray for the identification of the activity of a combinatorial miRNA treatment in halting cell cycle and angiogenesis.

Antikor mikrodizisi: miRNA ile tedavi edilen akciğer kanseri hücrelerinin protein ekspresyonunu incelemek için bir teknik

Source: Hossian, A. et. al. Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes ...

Kanser Araştırmaları

Akciğer Kanseri

İn vitro çalışma

A Technique to Detect Cyanobacterial Strains Using an Antibody Microarray Chip

Source: Blanco, Y. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54994">Experimental Protocol for Detecting Cyanobacteria in Liquid and Solid Samples with an Antibody Microarray Chip.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates a method to detect the Cyanobacterial strains in an environmental sample using an antibody microarray chip. Samples carrying various bacteria interact with printed antibodies, and immunostaining with fluorophore-labeled anti-cyanobacterial-strain antibodies reveals the presence of specific cyanobacterial strains through fluorescence in distinct spots.

Bir Antikor Mikroarray Çipi Kullanarak Siyanobakteriyel Suşları Tespit Etmek İçin Bir Teknik

1. Preparation of the Immunogens

	Grow each cyanobacterial strain in the corresponding culture medium under conditions described in&#160;Table ...

Antikor Tabanlı Görüntüleme ve Tespit Yöntemleri

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

Source: Khan, S., et al., <a href="https://app.jove.com/v/59973">Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Source: Khan, S., et al., Use of an Influenza Antigen Microarray to Measure the Breadth of Serum Antibodies Across Virus Subtypes. J. Vis. Exp. (2019)
In ...

Saptamak için deneysel protokol

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler