Yazarlar işbirliği, devam eden ve ligule gelişimi ile ilgili tartışmalar uyarıcı S. Hake teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB 1052051 ve IOS-1848478 tarafından desteklenmektedir.

NOT: Doku LM için sabit olduğunu, aynı zamanda histolojik analiz için doku sabitleyin. Daha sonra LM rehberlik edecek morfolojik özellikler için lekeli bölümleri inceleyin. Vahşi tip mutant karşılaştırıldığında, (bu durumda LG1) ilgili gen ifade alan tanımlamak için bir yerinde hibridizasyon veya bağışık gerçekleştirmek. 1. Doku Sabitleme ve İşleme <ol><li> Standart koşullar 6 altında eski iki hafta mısır fidelerinin daire büyür. </li><li> Yanal bölümler (Şekil 4) için ateş apices teşrih. <ol><li> sadece toprak sınırının altında Tüketim fide. </li><li> Bir jilet kullanarak, bir ya da iki olgun yapraklar çevrelediği culm oval görünür (Şekil 4B) kadar kök (kesikler 1, Şekil 4A) tabanından ince dilim çıkarın. </li><li> Başka bir kesim tabanı üzerinde yaklaşık 10 mm (Şekil 4A 2 kesme) olun.Bu 10 mm segmenti SAM ve genç yaprak primordiasında içerecektir. </li><li> Baz yukarı bakacak şekilde 10 mm segmenti çevirin. Kalın bir doku 2-3 mm&#39;lik bir kesit elde edilir, böylece iki kesim yanal eksene paralel hale (kesikler 3 ve 4, Şekil 4B). Dış iki porsiyon atın ve sabitleme ve benimsenmesi için merkezi dilim saklayın. NOT: Dış yaprakları kesilmiş ve atılabilir. </li></ol></li><li> gömmek için doku ve süreci sabitleyin. <ol><li> RNaz ücretsiz olan tüm malzemelerin daha sonraki kademelerde kullanım için emin olun. (. Çözeltinin litresi başına 1 mi DEPC, arada bir sallanarak ve otoklav ile bir gece boyunca inkübe) dietil pirokarbonat (DEPC) ile çözümleri tedavi edin. Fırında 200 ° C de bir fırında cam veya en az 6 saat boyunca daha yüksek ve RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile plastik eşya tedavi. </li><li> Gün 1: buz üzerinde bir cam şişe içinde (asetik asit: 1 Etanol 3) ~ çiftçi düzeltmenin 10 ml doku dilimleri bırakın. Tüm numuneler kesilerek sonra, Vacuu geçerlidirm hava kabarcıkları ve fiksatif yardım penetrasyonunu kaldırmak için. 10 dk sonra yavaşça vakumu boşaltmak için vakum altında tutun. Fiksatif değiştirin ve hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 2. Gün:, çözeltiler, aşağıdaki seri inkübe ~ her biri 10 mL, 1 saat, her biri hafifçe çalkalanarak Tüm; 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C, 4 ° C &#39;de% 100 etanol% 100 etanol% 100 etanol% 95 etanol, 1 ile% 85 etanol: 1 etanol: Oda sıcaklığında ksilenler, Oda sıcaklığında% 100 ksilenler, oda sıcaklığında% 100 ksilenler. NOT: ksilen temas ve solunum yoluyla zehirlidir. Davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven kullanın. </li><li> ksilen, yaklaşık yarım hacme orta peletler gömme parafın doku eklenir ve yavaşça çalkalanarak, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir. </li><li> 3. Gün: peletler eriyene kadar 60 ° C fırında, şişe aktarın. çözüm dökün ve taze erimiş doku gömme ortamı ile değiştirin. Orta iki kez daha değiştirmegün boyunca. </li><li> 4. Gün: Sabah bir kez gömme orta Değişim doku. Öğleden sonraya kadar 60 ° C fırında dönün. </li></ol></li><li> Oyuncular blokları <ol><li> Doku gömme istasyonunun sıcak plaka üzerinde gömme kalıpları yerleştirin. kesim yüzeyi aşağı bakacak şekilde gömme kalıplara doku örnekleri aktarmak için forseps kullanabilir. Erimiş parafin ile kalıp kontör ve kalıp üstüne gömme halkasını yerleştirin. parafin katılaşmış kadar soğuk plaka aktarın. silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C&#39;de, parafin blokları saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Kesit ve Hazırlama Slayt <ol><li> Bir mikrotom 25 10 mikron bölümleri kesin. </li><li> şeritler incelemek ve medyan bölümleri seçin. Medyan bölümler yaprak primordia çevrili hücrelerin bir kubbe olarak görünür SAM dahil olanlardır. </li><li> slaytlar Mount bölümleri. <ol><li> LM için uygun yer slaytlar (ya RNaz ücretsiz ya dapişmiş) 42 ° üzerinde sıcak slayt ve slayt kapsayacak şekilde% 50 etanol çözeltisi birkaç damla uygulamak C. </li><li> bölümler genişlettik kadar etanol çözeltisi ile ilgili bölümleri yüzer. NOT: etanol çözeltisi yerine su bölümleri Yüzer RNA bozulmasını azaltan bir çöktürülmüş halde RNA tutar. </li><li> slayt eğin ve tek kullanımlık transfer pipet yardımıyla aspirasyon ile aşırı etanol çözüm kaldırmak. herhangi bir ek etanol solüsyonu uzak fitil havsız mendil kullanın. </li><li> 42 ° C&#39;de kuru slaytlar birkaç saat veya bir gece. Mağaza silika jel ile hava geçirmez bir kap içinde, 4 ° C &#39;de kayar. </li></ol></li><li> Deparaffinize kullanım gününde kayar. <ol><li> içeren üç cam Coplin kavanoz hazırlayın; % 100 ksilenler (ksilenler I) &#39;in,% 100 ksilenler (ksilenler II) ve% 100 etanol (~ Her çözeltinin 50 mi). </li><li> temiz forseps kullanarak 2 dakika ve 1 dakika süreyle% 100 etanol için, slaytlar aktarmak Ben 2 dakika süreyle ksilol slaytları batırmayın, ksilen II. </li><li> Tahliye kaydırdıOda sıcaklığında havsız mendil ve kuru hava ile ilgili es. </li></ol></li></ol> Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf Örneklerinin 3. Mikrodisseksiyon <ol><li> LM mikroskop sahnede slaytlar sabitleyin. slayt başına beş bölümden kullanan her tekrar için beş ya da altı slaytlar kullanın. NOT: Tek deney için havuzu doku Şekil 5&#39;de görüntülenmiştir. </li><li> slaytlar incelemek ve merkezi referans noktası olarak SAM apeks kullanarak, her slaytta beş en medyan bölümleri belirlemek. Not: Bu, düşük büyütme yapılabilir genellikle 5X amacı yeterlidir. </li><li> 10X veya 20X objektif kullanılarak, her bir bölümün plastochron 7 yaprak primordiumunun üzerinde ligule konumunu belirlemek. ligule yaprak primordiumunun adaxial yüzeyinden çıkıntı bir yumru olarak görünür olacaktır. LM yazılım çizim aracını kullanarak bu konumu işaretleyin; Kalem simgesini seçin, uygun positi imlecive üzerine tıklayın ve çizmek için fareyi sürükleyin. NOT: 10X veya 20X amacı, bu ve sonraki adımlar için uygun değildir. Yanal bölümleri kullanırken, her yaprak primordiumunun iki tarafın her bölüm (Şekil 2A) mevcut olacaktır. </li><li> Cetvel aracı ve dikdörtgen çizim aracını kullanarak, 100 mikron her bölümün ligule merkezli yüksek dikdörtgenler (kırmızı dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) ölçün. Bu &quot;ligule&quot; örnek olacaktır. <ol><li> cetvel aracını kullanmak için; , Cetvel simgesini seçin ölçülecek nesnenin bir ucuna imleci, nesneyi ölçmek için tıklayın ve sürükleyin. Cetvelin uzunluğu ekranda gösterilir. </li><li> Bir dikdörtgen çizmek için; , Dikdörtgen simgesini seçin, dikdörtgenin bir köşesi olacak tıklayın ve uygun büyüklükte bir dikdörtgen çizmek için sürükleyin bir noktaya imleci. Alternatif olarak, düz bir çizgi çizim aracını seçin ve dört düz çizgiler çizmek. </li><li> tedbir 100 mikron dikdörtgenler 50 mikron &quot;ligule&quot; dikdörtgen üstünde ve altında konumlandırılmış. NOT: Bu &quot;Blade&quot; ve &quot;Kılıf&quot; örnekleri, sırasıyla (yeşil ve mavi dikdörtgenler, Şekil 2A, 2B) olacaktır. Bizim histolojik verilere dayanarak, 100 mikron dikdörtgen tüm ligule bölgesini kapsar. bıçak ve kılıfın eşdeğer porsiyon büyüklüğünde doku içindeki miktarları her biri için elde edilmiştir sağlamak için seçilmiştir. 50 um&#39;lik Spacer&#39;ler ligule bölgesi doku yanlışlıkla uç veya kılıf microdissections dahil olmasını sağlamak için kullanılmıştır. </li></ol></li><li> Ayrı tüplerde ligule, Blade ve Kılıf örneklerin toplanması 7, 8, 9, - Microdissect ölçülen dikdörtgenler (2F Şekil 2B). Seçilen etki anahat boyunca doku bölümünde kesmek için lazer kesim işlevini kullanın. Cata kullanınpult işlevi slayt kapalı ve tüp (- 2F Şekil 2B) kapağının içine doku dikdörtgen itmek için. </li></ol> Plastochron 7 Yaprak Primordia Blade, ligule ve Kılıf adaxial Epidermal Örneklerinin 4. Mikrodisseksiyon <ol><li> bölümleri seçin ve bölüm 3 (yukarıda) de tarif edildiği gibi, plastochron 7 ligule merkezli 100 mikron yüksek kesimleri ölçmek için cetvel aracını kullanın. <ol><li> Çizim aracı ile özetleyen her 100 mikron yüksek &quot;Blade&quot; ve &quot;Kılıf&quot; segmenti (yeşil ve mavi seçimleri, Şekil 2C) sadece adaxial epidermal hücreleri seçin. Epidermis, dış hücre tabakasıdır; aks tarafı SAM yakın biridir. </li><li> Bölüm 3.3 (kırmızı seçimi, Şekil 2C) de tarif edildiği gibi &quot;ligule&quot; örneği için, gelişmekte olan ligule yumru sadece hücreleri seçin. </li></ol></li><li> Bıçak, ligule ve Shea toplama Microdissect seçilen bölgeler,bölüm 3.5 anlatıldığı gibi inci, ayrı tüplerde örnekleri epidermis. </li></ol> LG1-R ve vahşi tip kardeşlerinden Plastochron 6 Yaprak Primordia 5. mikrodiseksiyonu <ol><li> Mutant (LG1-R) ve vahşi tipli bitkiler ailelerini segregasyon büyütün. </li><li> bölümlerde 1.2-1.4 açıklandığı gibi, LM için apices saptamak ve süreç ateş. Ayrı onları tutmak için vahşi tip ve ayrı şişelerde mutant ateş apices sabitleyin. Aynı dikim numuneler sabit ve in situ melezleme için işleme tabi tutulmalıdır. </li><li> LG1 in situ hibridizasyon 6, 26, 27 LG1 gerçekleştirerek, vahşi tipli kardeşlerinden transkribe burada belirler. Birden çok numune (Şekil 1 E) yaprak primordiumunun tabanından LG1 transkript birikimi konumunu ölçün. </li><li> Doğal olarak melezleşme verileri göre, yaprak primo kısmını tercihrdium bu LG1 transkribe bölgeyi kapsar. Bu durumda, plastochron 6 yaprak primordia (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) tabanında 400-900 um. </li><li> Bölüm 3.5 de tarif edildiği gibi, ayrı Microdissect tüplerde LG1-R ve vahşi tip numune toplama, yaprak primordia kısmı seçildi. </li></ol> 6. RNA Ekstraksiyon Buffer uygula <ol><li> microdissected dokuya 50 ul RNA ekstraksiyon tamponu uygulayın ve RNA ekstraksiyonu devam edin. Referans 6&#39;da açıklandığı gibi RNA ekstraksiyonu, RNA amplifikasyonu, kütüphane oluşturma, sekanslama ve biyoinformatik analizi ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Becraft, P. W., Bongard-Pierce, D. K., Sylvester, A. W., Poethig, R. S., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+liguleless-1+gene+acts+tissue+specifically+in+maize+leaf+development.">The liguleless-1 gene acts tissue specifically in maize leaf development.</a> Dev Biol. 141 (1), 220-232 (1990).</li><li>Sylvester, A. W., Cande, W. Z., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+during+normal+and+liguleless-1+maize+leaf+development.">Division and differentiation during normal and liguleless-1 maize leaf development.</a> Development. 110 (3), 985-1000 (1990).</li><li>Moreno, M. A., Harper, L. C., Krueger, R. W., Dellaporta, S. L., Freeling, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=liguleless1+encodes+a+nuclear-localized+protein+required+for+induction+of+ligules+and+auricles+during+maize+leaf+organogenesis.">liguleless1 encodes a nuclear-localized protein required for induction of ligules and auricles during maize leaf organogenesis.</a> Genes Dev. 11 (5), 616-628 (1997).</li><li>Emerson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inheritance+of+the+ligule+and+auricle+of+corn+leaves.">The inheritance of the ligule and auricle of corn leaves.</a> Neb. Agr. Exp. Sta. An. Rep. 25, 81-85 (1912).</li><li>Moon, J., Candela, H., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Liguleless+narrow+mutation+affects+proximal-distal+signaling+and+leaf+growth.">The Liguleless narrow mutation affects proximal-distal signaling and leaf growth.</a> Development. 140 (2), 405-412 (2013).</li><li>Johnston, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+Analyses+Indicate+That+Maize+Ligule+Development+Recapitulates+Gene+Expression+Patterns+That+Occur+during+Lateral+Organ+Initiation.">Transcriptomic Analyses Indicate That Maize Ligule Development Recapitulates Gene Expression Patterns That Occur during Lateral Organ Initiation.</a> Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).</li><li>Schmid, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLoS One. 7 (1), e29685 (2012).</li><li>Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+cells+from+plant+tissues.">Laser capture microdissection of cells from plant tissues.</a> Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).</li><li>Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection,+a+tool+for+the+global+analysis+of+gene+expression+in+specific+plant+cell+types:+identification+of+genes+expressed+differentially+in+epidermal+cells+or+vascular+tissues+of+maize.">Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize.</a> Plant Cell. 15 (3), 583-596 (2003).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18 (9), 1509-1517 (2008).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Brooks, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+shoot+meristem+functional+domains.">Microdissection of shoot meristem functional domains.</a> PLoS Genet. 5 (5), e1000476 (2009).</li><li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stamen+abscission+zone+transcriptome+profiling+reveals+new+candidates+for+abscission+control:+enhanced+retention+of+floral+organs+in+transgenic+plants+overexpressing+Arabidopsis+ZINC+FINGER+PROTEIN2.">Stamen abscission zone transcriptome profiling reveals new candidates for abscission control: enhanced retention of floral organs in transgenic plants overexpressing Arabidopsis ZINC FINGER PROTEIN2.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1305-1321 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+dynamics+of+the+maize+leaf+transcriptome.">The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome.</a> Nat Genet. 42 (12), 1060-1067 (2010).</li><li>Eveland, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+modules+controlling+maize+inflorescence+architecture.">Regulatory modules controlling maize inflorescence architecture.</a> Genome Res. 24 (3), 431-443 (2014).</li><li>Takacs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+of+the+maize+shoot+apical+meristem.">Ontogeny of the maize shoot apical meristem.</a> Plant Cell. 24 (8), 3219-3234 (2012).</li><li>Aida, M., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shoot+apical+meristem+and+cotyledon+formation+during+Arabidopsis+embryogenesis:+interaction+among+the+CUP-SHAPED+COTYLEDON+and+SHOOT+MERISTEMLESS+genes.">Shoot apical meristem and cotyledon formation during Arabidopsis embryogenesis: interaction among the CUP-SHAPED COTYLEDON and SHOOT MERISTEMLESS genes.</a> Development. 126 (8), 1563-1570 (1999).</li><li>Ishida, T., Aida, M., Takada, S., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+CUP-SHAPED+COTYLEDON+genes+in+gynoecium+and+ovule+development+in+Arabidopsis+thaliana.">Involvement of CUP-SHAPED COTYLEDON genes in gynoecium and ovule development in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 41 (1), 60-67 (2000).</li><li>Takada, S., Hibara, K., Ishida, T., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CUP-SHAPED+COTYLEDON1+gene+of+Arabidopsis+regulates+shoot+apical+meristem+formation.">The CUP-SHAPED COTYLEDON1 gene of Arabidopsis regulates shoot apical meristem formation.</a> Development. 128 (7), 1127-1135 (2001).</li><li>Nardmann, J., Ji, J., Werr, W., Scanlon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maize+duplicate+genes+narrow+sheath1+and+narrow+sheath2+encode+a+conserved+homeobox+gene+function+in+a+lateral+domain+of+shoot+apical+meristems.">The maize duplicate genes narrow sheath1 and narrow sheath2 encode a conserved homeobox gene function in a lateral domain of shoot apical meristems.</a> Development. 131 (12), 2827-2839 (2004).</li><li>Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+activated+cell+sorting.">Fluorescence activated cell sorting.</a> Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).</li><li>Birnbaum, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+root.">A gene expression map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+root+spatiotemporal+map+reveals+dominant+expression+patterns.">A high-resolution root spatiotemporal map reveals dominant expression patterns.</a> Science. 318 (5851), 801-806 (2007).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Ruzin, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plant microtechnique and microscopy. , (1999).</li><li>Jackson, D., Veit, B., Hake, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+maize+KNOTTED1+related+homeobox+genes+in+the+shoot+apical+meristem+predicts+patterns+of+morphogenesis+in+the+vegetative+shoot.">Expression of maize KNOTTED1 related homeobox genes in the shoot apical meristem predicts patterns of morphogenesis in the vegetative shoot.</a> Development. 120, 405-413 (1994).</li><li>Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+for+the+precise+localization+of+transcripts+in+plants.">In situ hybridization for the precise localization of transcripts in plants.</a> J Vis Exp. (57), e3328 (2011).</li><li>Day, R. C., McNoe, L., Macknight, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+global+RNA+amplification+and+its+use+for+high-throughput+transcript+analysis+of+laser-microdissected+endosperm.">Evaluation of global RNA amplification and its use for high-throughput transcript analysis of laser-microdissected endosperm.</a> Int J Plant Genomics. , 61028 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Deney tasarımı RNA DİZ deneylerinde önemli bir faktördür. Anahtar hususlar kesin etki (ler) ve gelişimsel aşaması (ler) analiz edilecek ve ne karşılaştırmalar yapılacaktır vardır. çıkış iki veya daha fazla durum arasında de genlerin bir liste genellikle, çünkü karşılaştırmalar açısından düşünmek için çok önemlidir. Tüm deneylerde olduğu gibi, aynı anda yalnızca tek bir değişken değiştirmek için önemlidir. Farklı yaprak etki karşılaştırırken Örneğin, aynı koşullar ...

Genetik diseksiyon (Şekil 1A) için uygun olan bıçak ve kılıf arasında belirgin bir sınır olduğu gibi mısır yaprağı, morfolojilerinden sırasında gelişimsel alanların oluşumunu incelemek için ideal bir model. yaprak gelişimi, küçük hücrelerden oluşan bir lineer grubun ilk aşamalarında, preligule bandı (PLB), pre-bıçak ve ön kılıf etki alanlarına yaprak primordium&#39;u subdivides. Bir saçak gibi ligule ve üçgen kulakcık PLB (Şekil 1A, C, D) gelişir. Genetik ekranlar bıçak kılıf sınırını bozan mutasyonlar saptanmıştır. Örneğin, resesif liguleless1 (LG1) mutasyonları ligule kulakçıkların, 1, 2, 3, 4 (Şekil 1B) silin. İn situ hibridizasyon LG1 transkript P birikir ortayaLB ve ligule gelişme 5, 6 (Şekil 1E) için o mükemmel bir işaretleyici yaparak, ligule ortaya çıkıyor. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55004/55004fig1.jpg" /> Şekil 1: vahşi tip ve liguleless1-R mısır yaprakları. Ligule ve kulak kepçesi yapıları gösteren, olgun, vahşi tip yaprak (A) Bıçak kaplama sınır bölgesi. (B) ligule ve kulak kepçesi yapıların olgun liguleless1-R yaprak gösteren yokluğunda Bıçak kılıf sınır bölgesi. A ve B Yapraklar yaprak orta damarı boyunca yarıya edilmiştir. Vahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla (C) Boyuna kesit. Örnek işleme ve histolojik analiz için boyanmıştır edilmiştir. başlatılması ligule yaprak (ok başı) düzleminden dışarı çıkıntı yapan bir tümsek belirgindir. (D) Boyuna mezhepvahşi tip yaprak primordiumunun yoluyla iyon. metinde tarif edildiği gibi Örnek LM için işlenmiştir. Ok başı ligule başlatılması gösterir. Sürgün ucuna uzunlamasına yanal bölümün in situ hibridizasyon (E) LG1. Yıldız P6 yaprak primordiumunun PLB de LG1 transkript birikimi gösterir. Oklar P6 primordium&#39;un tabanını gösterir. Bar PLB için primordium&#39;un tabanından ölçümünü gösterir. A ve B Ölçek çubukları 20 mm =. CE Ölçek çubukları = 100 mikron. Bu rakam referans 6 (Bitki Biyologlar Telif Amerikan Derneği) modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55004/55004fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Bu çalışmada, LM RNA Seq yaprak primordiumunun ve ide diğer bölgelerine bıçak-kılıf sınır nispetle farklı ifade edilen genlerin bir paketi (DE) tanımlamak için kullanılmıştır<html> vahşi tip kardeşleri göre LG1-R mutantlar DE vardır ntify genler. LM RNA Seq özel hücreler ya da hücre alan 7 transkript birikimi ölçülmesi için bir yöntem olup. LM sistemleri lazer ve bir dijital kamera ile bir mikroskop birleştirir. Kesitli doku slaytlar üzerine monte edilir ve mikroskop aracılığıyla görüntülenebilir. LM yazılım genellikle kullanıcı mikrodiseksiyon seçilen herhangi bir bölgeyi anahat izin çizim araçları içerir. hat boyunca lazer kesim ve seçilen doku slayt kapalı mancınık ve slayt üzerinde asılı bir tüp içine almaktadır. LM kullanıcıya özel hücre katmanları ve hatta tek hücreler 8, 9 da dahil olmak üzere hassas etki, microdissect sağlar. RNA daha sonra microdissected dokusundan elde edilebilir. Daha sonra, RNA-Seq bileşen çıkarılan RNA 10 üretilen cDNA kütüphaneleri sıralamak için yeni nesil dizileme kullanır,= &quot;xref&quot;&gt; 11. LM RNA seq Anahtar avantajları kesin olarak tanımlanmış alanlarda transkript birikimi ölçmek yeteneği ve tüm transkriptom aynı anda 7 profile kapasite vardır. teknik faiz bölge genellikle mikroskobik erken gelişim olayları sondalama için uygundur. Daha önceki çalışmalar, LM bitkiler 9, 12, 13, gelişim süreçleri incelemek için mikrodizi teknolojisi ile birlikte kullanmıştır. RNA Seq düşük ifade edilen genler de dahil olmak üzere, geniş bir dinamik aralık, arasında transkript miktarının avantajı vardır ve önceki dizi bilgisi, 11 10 gerekli değildir. Ayrıca, LM RNA Seq nedeniyle-of-zarara genetik fazlalık veya öldürücülüğü için mutagenez ekranlarında gözden kaçabilir gelişimsel olarak önemli genlerin vurgulamak için potansiyele sahiptirfonksiyon mutant. Bu tür dar bir sheath1 (NS1) ve kupa şekilli cotyledon2 (CUC2) halinde gelişimsel olarak önemli genler, genellikle sadece bir spesifik ekspresyon modelleri ya da birkaç hücre 17, 18, 19, 20 sahiptir. Çoğu sadece erken gelişim evrelerinde ve olgun bir organ olarak ifade edilir. Bütün organlar ya da büyük etki incelendiğinde, bu hücreye spesifik transkriptler seyreltilmiş ve daha geleneksel analizlerde tespit edilemez. kesin olarak tanımlanmış etki analiz edilmesine izin vererek, LM RNA Seq bu dokuya özgü genler belirlendi ve miktarları tayin edilmesini sağlar. Burada tarif edilen deneylerde başarısında önemli faktörlerdir bir analiz için uygun gelişim aşamasında ve etki alanının seçimi güdümlü tam histolojik analiz ve hassas measureme vardıLM hücre dokusunu etki nt. Eş etki her kopya için örneklendi emin olmak için, doku, aynı gelişim aşamasında, yaprak primordia toplandı ve microdissected etki, ortaya çıkan ligule (Şekil 2) gibi morfolojik noktalara göre ölçülmüştür. Bazı genler, yaprak tabanına ucundan gradyanı olarak ifade edilmiştir bilinmektedir. Nedeniyle yaprak proksimal-distal ekseni boyunca farklı yerlerden numune hassas etki, varyasyon ölçerek en az (Şekil 3A) tutuldu. Aynı boyutta etki microdissecting ile nedeniyle değişkenlik hücreye özel transkriptlerin seyreltme (Şekil 3B) indirgenerek diferansiyel. Atış apeksinin yan uzunlamasına kesitleri, tüm microdissections kullanılmıştır. Bunlar (Şekil 4) yaprak orta damarı-margin eksenine dik bölümler vardır. SAM içeren tek bölümleri kullanarak o eşdeğer yanal bölgeleri sağlaryaprak taslakları analiz edilir. İşlenmiş ve LM için kesitli numunelerde, ligule akıbet ilk morfolojik işareti nedeniyle adaxial epidermis (Şekil 1D, Şekil 2) periclinal hücre bölünmeleri adaxial tarafında bir darbedir. Gelişmekte olan ligule güvenilir plastochron 7 aşamalı yaprak primordiasında tespit edilebilir o belirlenmiştir. Biz gelişmekte olan ligule ve kulak kepçesi oluşturacaktır hemen uzak hücreleri dahil olmak üzere tüm ligule bölgede ifade genler, ilgilenmişlerdir. Eşdeğer doku seçimi yapılırken sağlamak amacıyla, ligule yumru morfolojik işareti olarak kullanıldı ve ligule yumru merkezli 100 um dikdörtgen LM (Şekil 2A, 2B) için seçildi. Ön bıçak ve ön kılıfın aynı büyüklükte dikdörtgenler aynı yaprak primordia seçilmiştir. liguleless mutant bitkilerin analizi Farklı challe sunulmaktadırnge; LG1-R mutantlar bu nedenle bu morfolojik özellik LM için bölgeyi seçmek için kullanılan olamazdı bir ligule, oluşturmazlar. Bunun yerine, vahşi tip yaprak primordia olarak LG1 transkript birikimi alanı tespit edildi ve bu da kapsamak olan bir bölge tanımlanmıştır. son tahlilde için kullanılan önceki çalışma PLB yeri büyüme koşullarına bağlı olarak değişir göstermiştir beri bu ön analizler, aynı dikimden itibaren fidelerin üzerinde gerçekleştirilmiştir. In situ hibridizasyon LG1 transkript PLB P6 yaprak primordia (Şekil 1 E) birikir olduğunu göstermiştir. Biz LG1 ifadesinin alanını (mor dikdörtgenler, Şekil 2A) kapsıyor ve yabani tip ve LG1-R bitkilerden bu eşdeğer bölgeleri ele yaprak primordiasında tabanından bir alanı 400-900 mikron seçilmiş. transkripsiyonu karşılaştırırken genetik altyapı ve büyüme şartlarına varyasyonu en aza indirmek içinLG1-R ve vahşi tip bitkiler, mutant ve vahşi tipli kardeşlerinden ailelerini ayırma t birikimi kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Diethyl pyrocarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>159220</td><td>Used for RNase treatment of solutions</td></tr><tr><td>Razor blades&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020-250ML</td><td>RNase decontamination solution</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP28184</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Glass vials - 22 ml</td><td>VWR</td><td>470206-384</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, histological grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056-4L</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>VWR</td><td>15154-072</td><td></td></tr><tr><td>Embedding rings</td><td>VWR</td><td>15154-303</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel packets</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71206-01</td><td>Desiccant for storage of paraffin blocks</td></tr><tr><td>Oven</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0503</td><td>Oven must maintain temperature of 60 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Paraffin embedding station</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>EG1160</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Slide warmer</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71317-10</td><td></td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70316-02</td><td></td></tr><tr><td>Laser microdissector</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES&amp;trade; Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN</td><td>Zeiss</td><td>415190-9041-000</td><td>Slides for laser microdissection</td></tr><tr><td>Adhesive Cap 200 opaque</td><td>Zeiss</td><td>415190-9181-000</td><td>Tubes for laser microdissection</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr></tbody></table>

experimental design for laser microdissection rna-seq: lessons from an analysis of maize leaf development

gelişmesinde önemli rolleri olan genler sıklıkla mekansal ve / veya zamansal sınırlı ifade desenleri var. Genellikle bu gen transkript tespit edilmemiştir ya da farklı olarak tüm bitki organlarının transkriptomik analizlerinde (DE) ifade edildiği gibi tanımlanmamıştır. Lazer Diseksiyon RNA Seq (LM RNA Seq) özel gelişimsel alanlarda DE olan genleri tanımlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, hücresel alanlarının seçimi microdissect ve karşılaştırmak ve microdissections doğruluğu deneylerin başarısı için çok önemlidir için. Burada, iki örnek transkriptomik deneyler için tasarım konuları göstermektedir; RNA DİZİ analizi, mısır yaprağı yakın-uzak eksen boyunca de genleri belirlemek için bir LM ve ikinci bir deney, DE liguleless1-R (LG1-R) olan genleri tanımlamak için mutantlar vahşi tip ile karşılaştırıldığında. Bu deneylerin başarısına katkıda kilit unsurları histolojik ve si ayrıntılı edilditu melezleme analiz edilecek bölgenin analizleri, eşdeğer gelişim aşamalarında yaprak primordiasında seçimi, morfolojik yerlerinden kullanımı mikrodiseksiyon bölgeleri seçin ve hassas ölçümler etki mikrodisseksiyon için. Bu makale LM RNA Sek tarafından gelişimsel etki analizi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Burada sunulan veriler mikrodiseksiyon seçilen bölge elde edilen sonuçları nasıl etkileyeceğini göstermektedir.

Yaklaşık 1,000,000-1,500,000 um 2 doku her biri için elde edilmiştir, Şekil 2&#39;de belirtilen LM şeması kullanarak, tüm hücre tabakaları LM (Şekil 5) çoğaltmak ve 200,000 mikron 2 başına adaxial epidermisin LM çoğaltma. Her LG1-R ve vahşi tip yaprak primordia LM replike yaklaşık doku 2,500,000 mikron 2 toplanmıştır. Doğrusal, RNA amplifikasyonuna ait iki tur her tekrar için RNA, mikrogr...

Watch this Scientific Journal Video about Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development at JoVE.com

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

experimental-design-for-laser-microdissection-rna-seq-lessons-from-an

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Görüntüleme.  Cornell University. Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena. 

Video: Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique applications for OMV where traditional nanoparticles are proving too difficult to synthesize. To date, all Gram-negative bacteria have been shown to produce OMV demonstrating packaging of a variety of cargo that includes small molecules, peptides, proteins and genetic material. Based on their diverse cargo, OMV are implicated in many biological processes ranging from cell-cell communication to gene transfer and delivery of virulence factors depending upon which bacteria are producing the OMV. Only recently have bacterial OMV become accessible for use across a wide range of applications through the development of techniques to control and direct packaging of recombinant proteins into OMV. This protocol describes a method for the production, purification, and use of enzyme packaged OMV providing for improved overall production of recombinant enzyme, increased vesiculation, and enhanced enzyme stability. Successful utilization of this protocol will result in the creation of a bacterial strain that simultaneously produces a recombinant protein and directs it for OMV encapsulation through creating a synthetic linkage between the recombinant protein and an outer membrane anchor protein. This protocol also details methods for isolating OMV from bacterial cultures as well as proper handling techniques and things to consider when adapting this protocol for use for other unique applications such as: pharmaceutical drug delivery, medical diagnostics, and environmental remediation.

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Tasarım, Üretim ve Arıtma

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Biyokimya

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is needed to open up the structure of the plant cell wall, increasing the accessibility of the cell wall carbohydrates. Lignin, a polyphenolic material present in many cell wall types, is known to be a significant hindrance to enzyme access. Reduction in lignin content to a level that does not interfere with the structural integrity and defense system of the plant might be a valuable step to reduce the costs of bioethanol production. In this study, we have genetically down-regulated one of the lignin biosynthesis-related genes, cinnamoyl-CoA reductase (ZmCCR1) via a double stranded RNA interference technique. The ZmCCR1_RNAi construct was integrated into the maize genome using the particle bombardment method. Transgenic maize plants grew normally as compared to the wild-type control plants without interfering with biomass growth or defense mechanisms, with the exception of displaying of brown-coloration in transgenic plants leaf mid-ribs, husks, and stems. The microscopic analyses, in conjunction with the histological assay, revealed that the leaf sclerenchyma fibers were thinned but the structure and size of other major vascular system components was not altered. The lignin content in the transgenic maize was reduced by 7-8.7%, the crystalline cellulose content was increased in response to lignin reduction, and hemicelluloses remained unchanged. The analyses may indicate that carbon flow might have been shifted from lignin biosynthesis to cellulose biosynthesis. This article delineates the procedures used to down-regulate the lignin content in maize via RNAi technology, and the cell wall compositional analyses used to verify the effect of the modifications on the cell wall structure.

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

A double stranded RNA interference (dsRNAi) technique is employed to down-regulate the maize cinnamoyl coenzyme A reductase (ZmCCR1) gene to lower plant lignin content. Lignin down-regulation from the cell wall is visualized by microscopic analyses and quantified by the Klason method. Compositional changes in hemicellulose and crystalline cellulose are analyzed.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

Biyomühendislik

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Biyoloji

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Kinematic Analysis of Cell Division and Expansion: Quantifying the Cellular Basis of Growth and Sampling Developmental Zones in Zea mays Leaves

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying<em&gt; Zea mays</em&gt; Yapraklar

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...

Mısır Yaprağı Primordia'yı Görüntülemek için Geliştirilmiş Yöntemler

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study early leaf development. Here, we describe methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging. The first method uses a wire stripper to remove the upper portions of older leaves, exposing the tip of the leaf primordium and allowing its measurement for more accurate transverse section sampling. The second method uses clear, double-sided nano tape to unroll and mount whole-leaf primordia for imaging. We show the utility of the two methods in visualizing and analyzing fluorescent protein reporters in maize. These methods provide a solution to the challenges presented by the distinctive morphology of maize leaf primordia and will be useful for visualizing and quantifying leaf anatomical and developmental traits in maize and other grass species.

Yazar Spot Işığı: Floresan ve Konfokal Görüntüleme için Mısır Yaprağı Primordia'nın Enine Kesitlerini ve Açılmamış Bütün Montajlarını Hazırlamak için Geliştirilmiş Yöntemler  

Maize leaf primordia are deeply ensheathed and rolled, making them difficult to study. Here, we present methods for preparing transverse sections and unrolled whole mounts of maize leaf primordia for fluorescence and confocal imaging.

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Outer zar vezikülleri içinde Yönetmen Protein Paketleme

Lignin Aşağı düzenleme

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Hücre Bölünmesi ve Genişleme Kinematik Analizi: Büyüme ve Örnekleme Gelişim Bölgeleri Hücresel Temeli Quantifying

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma