Mikroskopik görüntüleme Gelişmiş Mikroskopi için Michigan State University Center hizmetleri aracılığıyla yapılmıştır. Mısır kallus Iowa State University mısır dönüşümü Merkezi&#39;nden satın alınmıştır. Yazarlar karbonhidrat analizi yaptığı teknik yardım için MSU Bitki Araştırma Laboratuvarı Jeffrey R. Weatherhead teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma cömertçe Michigan Mısır Pazarlama Programı (CMPM) ve Bitki Biyoteknoloji Araştırma Konsorsiyumu (CPBR) tarafından finanse edildi.

1.. ZmCCR1 ve Aşağı-regülasyon için kullanılır dsRNAi Yapıların Hazırlanması <ol><li> Bir dsRNAi knock-out ZmCCR1 geni oluşturmak yapmak için gerekli enzimi bölgelerine dahil Tasarım genine. İki primer setleri ZmCCR1 cDNA fragmanı, iki bölümleri amplifiye edilmesi için dizayn edilmiştir:. 1271 nükleotidinden 748 bir 523 bp fragmanı, ve 1271 nükleotidinden 986 bir 285 bp fragmanı ZmCCR1 cDNA Arizona Genome Enstitüsü (AGI) sağlanmıştır. Daha fazla bilgi, Şekil 1 &#39;de tarif edilmiştir. </li><li> ZmCCR1_748F_BglII primerler (5&#39;-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3 &#39;) ve ZmCCR1_1271R_NcoI (5&#39;-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3&#39;) kullanılarak ZmCCR1 şablonundan cDNA, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile büyük fragmanı yükseltin. ZmCCR1_986F_BglII primerler (5&#39;-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3 &#39;) ve bir ZmCCR1_1271R_SacI (5R kullanılarak küçük fragmanının (285 bp) büyütmek17;-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3 &#39;). </li><li> Bireysel üreticinin talimatları izlenerek pGEM-T Kolay içine parçalarını birbirine bağlamak. </li><li> Her biri tek tek transformantlardan mini hazırlık plazmid DNA izole gerçekleştirme pGEM-T ticari bir mini hazırlık kiti kullanılarak plazmid oluşturur. </li><li> Her iki Digest BglII ve Ncol ile iki pGEM-T :: ZmCCR1 (523 bp) ve ImpactVector (IV) -1,1 (sitoplazma ekspresyon vektörü). </li><li> IV-1.1 arıtıldı sindirilmiş jel içine geniş sindirilmiş jel ile saflaştırılmıştır ZmCCR1 fragmanının (523 bp) Arter. </li><li> IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) içine küçük fragmanı eklemek için Bglll ve SacI her ikisi ile pGEM-T :: ZmCCR1 (285 bp) ve IV-1.1 :: ZmCCR1 (523 bp) Digest. </li><li> IV-1.1 arıtıldı sindirilmiş jel :: ZmCCR1 (523 bp) içine küçük sindirilmiş jel ZmCCR1 parçası (285 bp) Arter. </li><li> 523 bp ve 285 bp parçalanmasına hem de Cloneters çevrilmiş tekrar parçalarının ortasında bir 238 bp ara parçası (bkz. Şekil 1) ile, bir 285 bp ters çevrilmiş tekrar dizisine sahip ZmCCR1 RNAi oluşturmak için IV-1.1 içine ts. </li><li> Bu Escherichia coli (E. coli) içine inşa aktarın büyüyebilir ve mısır genetik transformasyonu için yeterli plazmid DNA elde etmek için bir Midi-prep boyutu plazmid DNA izolasyon gerçekleştirin. </li></ol> 2.. Genetik Dönüşüm mısır <ol><li> Tungsten Parçacıklarının Hazırlanması <ol><li> Bir 1.5 ml bir tüp içinde tungsten boncuklar, 60 mg (M10) koyun ve 2 dakika boyunca karıştırın% 70 etanol, 1 ml ile yıkayın. 23 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe edilir, daha sonra 2 dakika boyunca 18894 x g&#39;de santrifüj ve supernatant atın. </li><li> 2 dakika boyunca santrifüj ve supernatant atarak, 1 ml% 100 etanol ile 3 kez yıkayın. 60 mg / ml mikropartikül konsantrasyonu getirmek için steril% 50 gliserol, 1 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> Bombardıman için DNA&#39;nın hazırlanması <ol><li> Pl1.5 ml tüp içine% 50 gliserol içinde hazırlanan tungsten boncuk 50 ul (3 mg) as. IV-5 ul 1.1 (1 ug) :: ZmCCR1 RNAi plasmid DNA, 2.5 M CaCI2 ve 50 ul 0.1 M spermidin ve 20 ul ekle. Yukarıda kısaca reaktifler her ilave arasında Vortex. </li><li> Vortex 30 saniye boyunca 18,894 xg tungsten boncuk-DNA karışımı kısaca ve santrifüj. Süpernatantı dökün ve% 70 etanol içinde 140 ul pelet tekrar süspansiyon. Sıvı çıkarın ve atın. % 100 etanol içinde 140 ul ekleyin. Sıvı çıkarın ve atın. </li><li> % 100 etanol içinde 48 ul ekle. , Bombardıman öncesi kadar 4 saat boyunca, kullanıma veya buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Bombardıman <ol><li> 32 (osmotium olarak), en az 4 saat önce bombardımana N6OSM ortamı ihtiva eden 100 mm Petri tabaklarda ortasında (Iowa State University mısır dönüşüm Merkezi&#39;nden Resim) 3-5 cm çapında bir Hi-II mısır embriyojenik calli yerleştirin. </li><li> Preparüreticinin talimatlarına uygun olarak 33 e PSD-1000/He Particle Delivery cihazı. </li><li> % 70 etanol ile oda duvarı sterilize edin. Steril tespit kapağı içine steril 650 psi kopma diski yerleştirin. Bir makro taşıyıcı, kuru kısaca yüzeyi üzerine M10-DNA çözeltisi 5-6 ul yayıldı. Yük macrocarrier ve microcarrier lansman montaj içine ekranı durdurma. </li><li> Durdurma ekranı (L2 = 6 cm) ve kapalı kapı seçilen bir mesafede odası içinde bir mikro başlatmak montaj ve mısır kalus yerleştirin. Bir tel örgülü elek karşı 27 psi&#39;lik bir vakumda hızlandırılması. </li><li> Patlama diski patlamaları ve helyum basıncı göstergesi sıfıra düşene kadar yangın düğmesine basın. Yangın düğmesini bırakın. </li><li> 27 ° C&#39;de karanlıkta 16 saat boyunca N6OSM (ozmotik ortamı) 32 içeren bir Petri kabındaki bombardıman kalus inkübe On parçalar halinde kalus kırmak ve N6E (kallus indüksiyon ortamı) için Petri tabaklarında 32 aktarmak ve 5 gün için inkübe in, 27 ° C de karanlık. </li></ol></li><li> Seçim <ol><li> N6E on 5 gün sonra, N6S ortamı (seçim ortamı) 32 üzerine kalus aktarın. Alt kültür seçim ortamı üzerinde kalus tüm kalus yapısının bozmadan 8-12 hafta süreyle her 30 günde. </li><li> 8-10 hafta sonra, beyaz hızlı büyüyen sektörler olmayan çoğalan ve kısmen nekrotik anne kallusların dışarı büyüyecek. Beyaz hızlı büyüyen dokuları tüketim ve taze seçim ortamına (N6S) 32 onları altkültürü ve yukarıdaki gibi inkübe devam ediyor. </li></ol></li><li> Yenilenme <ol><li> Rejenerasyon ortamında 32 üzerine beyaz ve hızlı büyüyen embriyonik calli aktarın ve 1 hafta boyunca yukarıdaki gibi inkübe edin. 25-27 ° C de 16 saat gün ışığı ve 8 saat karanlık bir döneme yenileyici embriyonik Kalusların Anahtarı </li><li> Rejenerasyon köklenme üzerine 3-4 hafta sonra bir cam test tüpünde 32 vurur transfer ortamı, yukarıdaki gibi inkübe devam etmektedir. Önemli r sonraoot geliştirme toprak ile 4 &quot;tencere Güller nakli ardından, musluk altında dikkatle kökleri yıkayın, görünür. Nemli tutmak için plastik torba ile tencere örtün. 2 gün küçük delik plastik torbalar yaptıktan sonra. 5-6 gün sonra plastik torbalar kaldırmak. 5-6 gün için yukarıdaki gibi inkübe devam edin. </li></ol></li><li> Sera <ol><li> Toprak ile 18 &quot;tencere içine fidan aktarın ve tam yaz güneş ışığı veya sera ışığında korumak. Ilk tohumları T 1 nesil ait ise ilk rejenere bitkiler T 0 denir. </li></ol></li></ol> 3.. Histolojik Assay <ol><li><ol><li> % 10 nötr tamponlu formalin içinde 5 ml mısır yaprak orta kaburga düzeltildi. </li><li> İşlem ve vakum bir doku işlemcisi kullanılarak bir doku işlemcide parafin ile sızmak. </li><li> Bir Histocentre III gömme istasyonu kullanılarak parafin içinde dokuları gömün. </li><li> Kenarlarından fazla parafin çıkarın kez blokks soğutulur. </li><li> Bir mikrotom kullanılarak bir mikrotom ile 4-5 mikron at bölümü örnek. </li><li> Mikroskop slaytlar ve 2-24 saat süreyle 56 ° C inkübatör üzerine kuru bölümleri yerleştirin. Emin olun bölümleri tamamen slayt yapıştırılır. </li><li> 23 ° C&#39;de 5 dakika boyunca iki kez değiştirilerek ksilen içinde Deparaffinize bölümler </li><li> Hidrat 2 dakika boyunca% 100 etanol iki değişiklik ve 23 ° C&#39;de 2 dakika boyunca% 95 etanol içinde iki değişiklik üzerinde kaydığı </li><li> 2 dakika için akan musluk suyu altında bölümleri durulayın. </li><li> 1-2 dakika boyunca% 0.05 toluidin mavisi O ile leke ve GKD 2 O. ile kısaca durulayın </li><li> Işık mikroskobu ile immersiyon ve görselleştirme ile numuneler üzerinde bir lamel yerleştirin. </li></ol></li><li> Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) <ol><li> % 4 glutaraldehid çapraz kesit mısır yaprak orta kaburga saptamak ve 1-2 saat boyunca 4 ° C&#39;de 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.4). </li><li> Kısaca tamponunda örnekleri durulama, bunları bir in susuz10 dakika, 3x her derece ve% 100 etanol ile 10-15 dakika boyunca etanol serisi (% 25,% 50,% 75 ve% 95). </li><li> Geçiş sıvı olarak sıvı karbon dioksit kullanılarak, bir kritik nokta kurutucuda susuz enine mısır yaprak orta kaburga kurutun. </li><li> Yüksek vakum karbon sekmelerini kullanarak alüminyum dallarda kurutulmuş örnekleri monte </li><li> Coat mısır yaprak orta kaburga argon gazı ile temizlenmiştir, bir püskürtme kaplayıcıda altın (yaklaşık 20 nm kalınlıkta) ile alüminyum lamı üzerine yerleştirildi. </li><li> Bir JEOL JSM-6400V (lantan heksaborattan elektron verici) tarama elektron mikroskobunda kaplanmış örnekleri inceleyin. </li><li> Dijital görüntüler bir analiz Pro yazılımı (sürüm 3.2) kullanılarak resimde edildi. </li></ol></li></ol> 4. Klason Lignini Ölçüm <ol><li> 2 mm elekten Mill örnekleri. </li><li> Her numunenin nem içeriğini tespit etmek ve değeri kaydetmek için bir nem analiz cihazı kullanın. </li><li> • Her bir numune, 1.5 g tartılır ve kütle kaydedin. DXtract otomatik bir çıkarıcı solvent (ekstraksiyon başına 3 döngüleri, döngü başına ~ 14 dakika) ya da Soxhlet cihazı (ekstraksiyon başına 8 saat) kullanılarak ikinci bir ekstre için, etanol, ardından birinci çıkarılması için su ile örnekler. (Not: Bu adım, belirgin Klason lignin içeriğini artırmak, asit hidrolizi sırasında yoğunlaştırmak ve doğru lignin ölçüm engelleyebilir çıkarıcılar kaldırır.) </li><li> Gece boyunca, 45 ° C&#39;de ekstre örnekleri kurutun ve sonra her bir desikatöre serin ve tekrar tartmak için izin verir. </li><li> 30 ° C&#39;ye kadar bir kuluçka ayarlama (Örnek başına kopyaların önerilir) vidalı kapaklı yüksek basınç tüpleri içine her kuru ekstre numunenin 0.3 g ölçülür ve en yakın 0.1 mg ağırlıkları kaydedilir. Her bir basınç borusu 72, H% 2 3 ml SO 4 ekleyin. </li><li> Bir cam veya teflon tavada çubuk kullanılarak örnek karıştırın. Su ilave edildi, inkübasyonu takiben kadar boru içinde karıştırma çubuğu bırakın. </li><li> Bir inkübatör şişe yerleştirin se30 ° C ve 60 dakika boyunca 150 rpm t. 1 saat sonra% 4 asit konsantrasyonunun seyreltilmesi ve bir karıştırma çubuğu ile karıştırmak için iyonu giderilmiş suyun 84 ml. Su hattı üzerinde şişenin yüzüne numunenin büyük miktarda bırakmak için dikkatli olun. </li><li> Sıkıca tüm şişeler üzerinde stoperleri mühür ve metal raf veya büyük çanakların içine koyun. 1 saat boyunca bir sıvı sterilizasyon çevrimi kullanılarak 121 ° C&#39;de otoklav. Onları açmadan önce oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyiniz. </li><li> En az 4 saat boyunca 575 ° C&#39;de bir fırın içinde filtre potalar ön kül. Potalar en az bir saat için bir desikatörde soğumasını bekleyin. </li><li> Vakum pota güvenli bir lastik adaptörü kullanarak, ayrı bir krozeden her tüpten çözüm filtre. Tüp kalan parçacıklar durulamak için deiyonize su kullanın. </li><li> 4 saat içinde, en az 105 ° C de lignin tortu kurutun. Kuru pota ve tortu ağırlığını kaydedin. </li><li> 575 ° C kullanıyorsanız, ön-Yangın bir Bunsen beki üzerinden örnekler hiçbir duman ya da kül ve daha sonra 24 saat boyunca fırında yerleştirin veya programlanabilir bir fırın kullanıyorsanız,-kül öncesi ve aşağıdaki programı kullanmayın sonu: </li><li> 105 ° C, oda sıcaklığı ve ikinci rampa 12 dakika için tutun. </li><li> 10 ° C / dk &#39;da 250 ° C&#39;ye yükseltmek ve 30 dakika için tutun. </li><li> 20 ° C / dk &#39;da 575 ° C&#39;ye kadar rampa ve en az 180 dakika için tutun. </li><li> Fırından potalar çıkarın ve bir kurutucuda serin. Pota ve kül tartılır. </li><li> Aşağıdaki denklem kullanılarak asit çözünmeyen tortu hesaplayın: </li></ol><img alt="Denklem 1" fo:content-width="300" src="/files/ftp_upload/51340/51340eq1.jpg" width="450" /> Önceden ekstre biyokütle M PRE = Kütle Post-ekstre biyokütle M POST = Kütle Ekstre biyokütle M VIAL = Kütle şişeye ilave Pota ve lignin resid M BAKİYENİN = Kütleue Pota ve kül M ASH = Kütle Önceden çıkarılır biyokütle, toplam ağırlık bazında MC = nem içeriği 5. Karbonhidrat Analizi <ol><li> Hücre duvarı karbonhidrat Foster vd dayalı analizler. (2010) protokol 31 gerçekleştirin. Kısaca, dondurularak kurutuldu, bitkisel maddeden elde edilen alkol çözülmeyen bir tortu hazırlayın. Daha sonra trifloroasetik asit ile hidrolize malzeme ve bunlara karşılık gelen alditol asetatlar için çözündürülmüş monosakkarit türevleri maç. Bir dörtlü kütle spektrometresi bağlı gaz kromatografisi (GC) ile, bu uçucu türevleri analiz edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ralph, J., Grabber, J. H., Hatfield, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin-ferulate+cross-links+in+grasses+-+Active+incorporation+of+ferulate+polysaccharide+esters+into+ryegrass+lignins.">Lignin-ferulate cross-links in grasses - Active incorporation of ferulate polysaccharide esters into ryegrass lignins.</a> Carbohydrate research. , 275-178 (1995).</li><li>Park, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Expediting cellulosic biofuels agenda: Production of high value-low volume co-products and lignin down-regulation of bioenergy crops [Ph.D. thesis]. , (2011).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Gibson, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hierarchical+structure+and+mechanics+of+plant+materials.">The hierarchical structure and mechanics of plant materials.</a> Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 9, 2749-2766 (2012).</li><li>Dien, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+alfalfa+conversion+efficiencies+for+sugar+recovery+and+ethanol+production+by+altering+lignin+composition.">Enhancing alfalfa conversion efficiencies for sugar recovery and ethanol production by altering lignin composition.</a> Bioresource technology. , 102-6486 (2011).</li><li>Fu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Cinnamyl+Alcohol+Dehydrogenase+(CAD)+Leads+to+Improved+Saccharification+Efficiency+in+Switchgrass.">Downregulation of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase (CAD) Leads to Improved Saccharification Efficiency in Switchgrass.</a> Bioenerg Res. 4, 153-164 (2011).</li><li>Grabber, J. H., Ralph, J., Hatfield, R. D., Quideau, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p-hydroxyphenyl,+guaiacyl,+and+syringyl+lignins+have+similar+inhibitory+effects+on+wall+degradability.">p-hydroxyphenyl, guaiacyl, and syringyl lignins have similar inhibitory effects on wall degradability.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 45, 2530-2532 (1997).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+monomer+composition+affects+Arabidopsis+cell-wall+degradability+after+liquid+hot+water+pretreatment.">Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment.</a> Biotechnology for biofuels. 3, (2010).</li><li>Mansfield, S. D., Kang, K. Y., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+for+deconstruction--poplar+trees+altered+in+cell+wall+lignification+improve+the+efficacy+of+bioethanol+production.">Designed for deconstruction--poplar trees altered in cell wall lignification improve the efficacy of bioethanol production.</a> The New phytologist. 194, 91-101 (2012).</li><li>Studer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+content+in+natural+Populus+variants+affects+sugar+release.">Lignin content in natural Populus variants affects sugar release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6300-6305 (2011).</li><li>Chen, F., Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+modification+improves+fermentable+sugar+yields+for+biofuel+production.">Lignin modification improves fermentable sugar yields for biofuel production.</a> Nature. 25, 759-761 (2007).</li><li>Ziebell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increase+in+4-coumaryl+alcohol+units+during+lignification+in+alfalfa+(Medicago+sativa)+alters+the+extractability+and+molecular+weight+of+lignin.">Increase in 4-coumaryl alcohol units during lignification in alfalfa (Medicago sativa) alters the extractability and molecular weight of lignin.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 38961-38968 (2010).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quest+for+alternatives+to+microbial+cellulase+mix+production:+corn+stover-produced+heterologous+multi-cellulases+readily+deconstruct+lignocellulosic+biomass+into+fermentable+sugars.">The quest for alternatives to microbial cellulase mix production: corn stover-produced heterologous multi-cellulases readily deconstruct lignocellulosic biomass into fermentable sugars.</a> Journal of Chemical Technolog., and Biotechnology. 86, 633-641 (2011).</li><li>Mol, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+gene+expression+by+antisense+RNA.">Regulation of plant gene expression by antisense RNA.</a> FEBS letters. 268, 427-430 (1990).</li><li>Adamo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene-mediated+cosuppression+and+RNA+interference+enhance+germ-line+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans.">Transgene-mediated cosuppression and RNA interference enhance germ-line apoptosis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3440-3445 (2012).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+silencing+by+intron-spliced+hairpin+RNAs.">Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs.</a> Nature. 407, 319-320 (2000).</li><li>Park, S. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+Maize+Cinnamoyl-Coenzyme+A+Reductase+via+RNA+Interference+Technology+Causes+Brown+Midrib+and+Improves+Ammonia+Fiber+Expansion-Pretreated+Conversion+into+Fermentable+Sugars+for+Biofuels.">Downregulation of Maize Cinnamoyl-Coenzyme A Reductase via RNA Interference Technology Causes Brown Midrib and Improves Ammonia Fiber Expansion-Pretreated Conversion into Fermentable Sugars for Biofuels.</a> Crop Sci. 52, 2687-2701 (2012).</li><li>Altpeter, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+and+the+genetic+enhancement+of+crops:+myths+and+realities.">Particle bombardment and the genetic enhancement of crops: myths and realities.</a> Mol Breeding. 15, 305-327 (2005).</li><li>Pichon, M., Courbou, I., Beckert, M., Boudet, A. M., Grima-Pettenati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+and+characterization+of+two+maize+cDNAs+encoding+cinnamoyl-CoA+reductase+(CCR)+and+differential+expression+of+the+corresponding+genes.">Cloning and characterization of two maize cDNAs encoding cinnamoyl-CoA reductase (CCR) and differential expression of the corresponding genes.</a> Plant molecular biology. 38, 671-676 (1998).</li><li>Mansoor, S., Amin, I., Hussain, M., Zafar, Y., Briddon, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+novel+traits+in+plants+through+RNA+interference.">Engineering novel traits in plants through RNA interference.</a> Trends in plant science. 11, 559-565 (2006).</li><li>Hatfield, R. D., Jung, H. -. J. G., Ralph, J., Buxton, D. R., Weimer, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+insoluble+residues+produced+by+the+Klason+lignin+and+acid+detergent+lignin+procedures.">A comparison of the insoluble residues produced by the Klason lignin and acid detergent lignin procedures.</a> J Sci Food Agr. 65, 51-58 (1994).</li><li>Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compositional+analysis+of+lignocellulosic+feedstocks.+1.+Review+and+description+of+methods.">Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 58, 9043-9053 (2010).</li><li>Sluiter, A., Hames, B., Ruiz, R., Scarlata, C., Sluiter, J., Templeton, D., Crocker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+structural+carbohydrates+and+lignin+in+biomass.">Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.</a> Laboratory Analytic Procedure. , (2008).</li><li>Bate, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Relationship+between+Phenylalanine+Ammonia-Lyase+Levels+and+Phenylpropanoid+Accumulation+in+Transgenic+Tobacco+Identifies+a+Rate-Determining+Step+in+Natural+Product+Synthesis.">Quantitative Relationship between Phenylalanine Ammonia-Lyase Levels and Phenylpropanoid Accumulation in Transgenic Tobacco Identifies a Rate-Determining Step in Natural Product Synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 7608-7612 (1994).</li><li>Hu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+lignin+biosynthesis+promotes+cellulose+accumulation+and+growth+in+transgenic+trees.">Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees.</a> Nature. 17, 808-812 (1999).</li><li>Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+cinnamyl+alcohol+dehydrogenase+deficiency+in+poplar+lignins.">Signatures of cinnamyl alcohol dehydrogenase deficiency in poplar lignins.</a> Phytochemistry. 65, 313-321 (2004).</li><li>Updegraff, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials.">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal Biochem. 32, 420-424 (1969).</li><li>Yemm, E. W., Willis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+carbohydrates+in+plant+extracts+by+anthrone.">The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone.</a> The Biochemical journal. 57, 508-514 (1954).</li><li>Filomena, A. P., Cherie, W., Geoffrey, B. F., Antony, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls.">Determining the polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature. 7, 1590-1607 (2012).</li><li>Foster, C. E., Martin, T. M., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Compositional+Analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass)+Part+II:+Carbohydrates.">Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates.</a> J. Vis. Exp. (e1837), (2010).</li><li>Department of Agronomy, Iowa State University. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+bombardment+of+Hi+II+immature+zygotic+embryos+and+recovery+of+transgenic+maize+plants.">Particle bombardment of Hi II immature zygotic embryos and recovery of transgenic maize plants.</a> , (2005).</li><li>Cano-Delgado, A., Penfield, S., Smith, C., Catley, M., Bevan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+cellulose+synthesis+invokes+lignification+and+defense+responses+in+Arabidopsis+thaliana.">Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 34, 351-362 (2003).</li><li>Boudet, A. M., Kajita, S., Grima-Pettenati, J., Goffner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignins+and+lignocellulosics:+a+better+control+of+synthesis+for+new+and+improved+uses.">Lignins and lignocellulosics: a better control of synthesis for new and improved uses.</a> Trends in plant science. 8, 576-581 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hücre duvarı polisakaritler bitki mikrobiyal selülazların erişim fenolik polimer 23 ile ilişkili için derecesine büyük ölçüde bağlıdır. Şeker fermente için lignocellulosic biyokütle dönüşüm oranı negatif bitki secondadry hücre duvarlarında biriken lignin içeriği ile ilişkilidir. Bu ilişki, bu tür hidrofobik 24, kimyasal heterojen olarak lignin fiziksel özellikleri atfedilen ve düzenli olarak hidrolize edilebilir intermonomeric yokluğunun 25 Bağlantılar ...

Lignoselülozik biyokütle biyoyakıt üretim nedeniyle, ABD 1 bugünkü bolluk oldukça tercih edilir ve tarım ve orman artıklarının sürdürülebilir hasat durumunda, gıda ve hayvan yemi üretimi için kullanılan tarım doğrudan rekabet yeteneği. Ancak, şu anda ABD&#39;de üretilen biyoyakıt ana kaynağı olan mısır tahıl, aksine, lignoselülozik malzemeler çok daha karmaşık ve zor yıkmak için vardır. Uzun zincirli karbonhidratlar, selüloz ve hemiselüloz, lignoselülozik malzemelerin fermantasyon sırasında şekerlerin başlıca kaynaklarıdır, bitki hücre duvarlarının, aynı zamanda, çok çeşitli lignin içeren, bitkinin patojen saldırısına karşı dayanıklılık, savunma sağlayan bir fenilpropanoid polimer, ve hidrofobiklik ek olarak, duvarları hücre. Bitki gelişimi ve yaşamı için gerekli olsa da, lignin da selüloz ve hemicellu başarılı enzimatik dönüşümü için önemli bir engel sunulurçözünür şekerlerin kaybetmek. Yüksek lignin içeriği ile malzemeler genellikle (biyolojik dönüşüm yollar aracılığıyla) biyoyakıt ve işleme özellikleri ve ürün kalitesi üzerinde olumsuz etkileri nedeniyle hamuru ve kağıt endüstrisi için daha az arzu malzemelerdir. Bu nedenle, ürün yapısal mukavemet ve savunma sistemleri ile karışmaz bir seviyede linyin azaltılması için bitkisel maddelerin genetik manipülasyon lignoselülozik biyoyakıt ve kağıt hamuru ve kağıt endüstrisi hem de üretim maliyetlerinin azaltılması için önemli olabilir. Mısır (Zea mays) olarak, lignin kovalent ferulat ve diferulate köprü 2 üzerinden birincil hücre duvarında, yarı selüloz ile çapraz-bağlanır. Lignin-hemiselüloz karmaşık ikincil hücre duvarına bütünlüğü ve mukavemeti veren karmaşık bir matris oluşturan, hidrojen bağları yoluyla, selüloz mikro-iplikçiklerinin bağlanır. Bitki hücre çeperlerinin mekanik mukavemeti büyük ölçüde li türüne göre belirlenirgnin 3-5 alt birimleri. Daha önceki çalışmalarda, lignin alt birimlerinin oranlarını değiştirerek enzimatik sindirilme 6-11 net bir eğilim göstermiştir. Ancak, lignin içeriğine azalma genel olarak dönüşüm 12,13 bir gelişme olduğunu göstermektedir ve endocellulases, selobiyohidrolazlar ve B-glukosidazlar β 14 de dahil olmak üzere hidrolitik enzimler ile bitki malzemesinin sindirilebilirliğini artan bir anahtar olabilir. Transkript ekspresyon seviyesini düzenlemek için genetik mühendisliği yaygın ürün özelliklerini geliştirmek için tatbik edilmiştir. Anti-sense ve 15 ortak bastırma teknolojileri, 16 dahil olmak üzere gelişmiş teknikleri, aşağı-regülasyonu, hedef genlerin etkili sağlar. Tam gen knock-out ayrıca bir saç tokası yapısı 17, intron-eklenmiş RNA &#39;yı kodlayan gen yapısı kullanılarak elde edilmiştir. Ayrıca, çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği örneğin, güçlü ve etkili bir gen ekspresyonu ortamhedefleme transkript veya bozunma için baskı ya da çalışır tor, hedef mRNA 18 bastırma etkileri geniş bir yelpazede indüklemek için güçlü bir yol temin etmektedir. Gen susturma teknikleri çeşitli sınırlamalar göstermektedir. Bu teknikler tam transkripsiyon seviyesini düzenler yok ve diğer homolog genlerin beklenmedik susturulması etkilere neden olabilir. Bu yöntemde, biz dsRNAi mısır genomu içine inşa gerçekleştirmek için partikül bombardımanı kullanılabilir. Bugüne kadar, bitki türlerinin geniş bir dizi başarılı bir partikül bombardımanı, Agrobacterium&#39;un aracılık ettiği dönüşüm, elektroporasyon, mikro-enjeksiyon ve yöntemlerle dönüştürülmüştür. Bu en etkili olduğu için, mısır genetik transformasyonu olarak, partikül bombardımanı yöntemi, tüm diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Partikül bombardımanı bakteri bağımlı değildir, bu yöntem, böyle bir genin gen türünün büyüklüğü ya da biyolojik kısıtlamaların serbesttirigin, ya da bitki genotipi. Fiziksel transgen dağıtım sistemi, yüksek transformasyon verimi 19 at, kloroplast içine bitki genomlarına ve bazı durumlarda tanıtılan yüksek molekül ağırlıklı DNA ve çoklu genleri sağlar. Yaprak orta nervürün vasküler sistemdeki lignin azalma numunelerin topografya ve bileşimin incelemek için yararlı olan, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile görselleştirilebilir. Mısır bitkilerinde, sinamoil-CoA redüktaz iki (ZmCCR1: X98083 ve ZmCCR2: Y15069) genlerin mısır genomunda 20 bulundu. Sinamoil-CoA redüktaz sinnamil aldehid içine hidroksisinamoil-CoA esterleri dönüşümünü katalize eder. Gen, tüm lignifying dokularda ifade edilir, çünkü bu enzim aşağı regüle etmek üzere ZmCCR1 geni seçtik. Dizileri olduğu ortaya çıktı, çünkü ZmCCR1 geninin 3 &#39;terminalinde 523 nükleotid, bir dsRNAi oluşturmak için seçilmiştirZmCCR2 olanlar ile karşılaştırıldığında daha farklı. Böylece, yapı, tam dsRNAi 21 susturma hedef dışı kaçınarak, sadece ZmCCR1 bağlamak olacaktır. A ZmCCR1_RNAi yapı içinde sitoplazmik ifade sistemi ImpactVector1.1-etiketine tasarlanmış (IV 1.1), yeşil doku spesifik promotör ihtiva eden, ribuloz-1, 5-bifosfat karboksilaz oksijenaz (Rubisco). DsRNAi transgenik bitkileri üzerinde inşa etme etkilerini araştırmak için, lignin içeriği hesaplandı. Klason (asitte çözülmeyen) lignin ölçümü 22 ligninin bazı çözünür asit lignin miktar deterjan yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha doğru olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, Klason lignin transjenik mısır sapı ölçülmüştür. Bu prosedür, çözünür monosakaritler 23 içine polimerik karbonhidrat dönüştüren iki aşamalı bir asit hidrolizi oluşur. Hidrolize biyokütle sonra asit çözünür ve çözünmez Materi içine kısımlara ayrılmıştırals ve asit çözünmeyen lignin önceki çalışmalara 23,24 göre ölçülmüştür. İdeal olarak, lignin analiz öncesi sonuçlar engelleyebilir çözünür maddeleri uzaklaştırmak amacıyla, hidroliz aşaması, ve tortu içinde mevcut olan herhangi bir kül hesaba lignin tortusunun bir post-yanma hidroliz için su ve etanol ile ekstraksiyon içermelidir. Bu adımlar olmadan, numunenin lignin içeriği yapay şişirilmiş olabilir. Tam bir yöntem ancak bizim deneyler için biz nedeniyle test için mevcut malzemenin küçük bir hacimde bu adımların hem de gerçekleştirmek için koyamadık, burada sunulmaktadır Diğer iki hücre duvarı bileşenleri, selüloz ve hemiselüloz da lignin aşağı-regüle transgenik mısır hatları analiz edilmiştir. Bu rapor edilmiş olduğu, ya da fenilalanin amonyak-liyaz (PAL) 25, 4-kumarat aşağı-regüle edilmiş transjenik bitkiler: CoA ligaz (4CL) 26, bir ya da sinamillcohol dehidrogenaz (CAD) 27 diğer hücre duvarı yapısal bileşenlerinde bir artış göstermektedir. Çalışmalarımızda, bir ilk adım olarak, kristalin selüloz Updegraff yöntemi 28 kullanılarak ölçülmüştür. Bu yöntem, ilk olarak selülolitik bakteri ve mantar çok sayıda selüloz belirlenmesi için geliştirilmiştir. Hemiselüloz, lignin ve xylosans çıkarmak için kısa bir süre, öğütülmüş mısır stokları Updegraff maddesi (su: nitrik asit asetik asit) ile muamele edilmiştir. Kristalin selüloz tamamen SO 4 H 2 eklenerek Saeman hidrolizi yoluyla glikoza hidrolize edildi. Kristalin selüloz daha sonra kolorimetrik anthrone yöntemi 29 kullanılarak analiz edilmiştir. Hemiselüloz içeriği değiştirilmiş olmadığını doğrulamak için, öğütülmüş saplarından monosakarit ekstreler trifloroasetik asit kullanılarak hidroliz alditol asetat yöntemi kullanılarak derivatize edilir ve daha sonra gaz kromatografisi (GC) 30 ile analiz edilmiştir. Kristal cel için detaylı prosedürlerlulose içeriği ve matris polisakaritler bileşim analizleri Foster vd de tarif edilmektedir. (2010) 31. Burada, lignin için kullanılan prosedürleri açıklamaktadır aşağı-regülasyonu bir RNAi teknolojisi, partikül bombardımanı dönüşüm ve biyoyakıt için fermentabl şekerlerin içine mısır lignocellulosic biyokütle hızlandırılmış yapı sökümüne lignin analizi ile mısırda.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td>Chemical compositions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6OSM</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Osmotic medium)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6E</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Callus induction)</td>
			<td>1 ml/l (1000X) N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.76 g/l proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/l sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N6S media</td>
			<td>4 g/l N6 salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Selection media)</td>
			<td>1 ml/l N6 vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2 mg/l 2,4-D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/l myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0.69 g/L proline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L casein hydrolysate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l sorbitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>36.4 g/l mannitol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2.5g/l gelrite, pH 5.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized silver nitrate (25uM) after autoclaving</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L (1000X) MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>60 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3 g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Add filter sterilized bialaphos (3 mg/L) added after autoclaving.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rooting medium</td>
			<td>4.3 g/L MS salts</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1 ml/L MS vitamin stock</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>100 mg/L myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>30 g/L sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>3g/L gelrite, pH 5.8 (100x25 mm petri-plates).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specific materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-top high pressure tubes</td>
			<td>Pressure tube (#8648-27); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Plug (#5845-47); Ace Glass, Vineland, NJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral buffered formalin&#160;</td>
			<td>100ml of formalin</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(1 liter)</td>
			<td>900ml of ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>4.0 g of Sodium dihydrogen phosphate, monohydrate&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(NaH2PO4.H2O)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad PSD-1000/He Particle Delivery device (Hercules, CA, United States)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss PASCAL confocal laser scanning microscope (Carl Zeiss, Jena, Germany)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelsior ES Tissue Processor (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCentre III Embedding Station (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Microtome Model Reichert 2030 (Reichert, Depew, NY, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emscope Sputter Coater model SC 500 (Ashford, Kent, England)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL JSM-6400V Scanning Electron Microscope (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitzpatrick JT-6 Homoloid mill; Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MA35 Moisture Analyzer; Sartorius</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critical point dryer, Balzers CPD (Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, United States)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lignin down-regulation of zea mays via dsrnai and klason lignin analysis

Biyolojik dönüştürme işlemleri sırasında alternatif biyoenerji kaynak gibi lignoselülozik biyokütle kullanımını kolaylaştırmak için, ön-muamele aşaması, hücre duvarı karbonhidrat örgütleri, bitki hücre duvarının yapısını açmak için gereklidir. Lignin, bir çok hücre duvarı tiplerinde mevcut olan bir polifenolik madde, enzim erişmek için önemli bir engel olarak bilinir. Bitkinin yapısal bütünlüğü ve savunma sistemi ile karışmaz bir düzeye lignin içeriğine azalma biyoetanol üretim maliyetlerini azaltmak üzere önemli bir adım olabilir. Bu çalışmada, genetik olarak, iki iplikçikli bir RNA girişimi tekniği ile linyin biyosentez-ilişkili genlerin biri, sinamoil-CoA redüktaz (ZmCCR1) aşağı-regüle var. ZmCCR1_RNAi yapısı, partikül bombardımanı yöntemiyle mısır genomuna entegre edildi. Transgenik mısır bitkileri içinde olmadan vahşi tipli kontrol bitkileri ile karşılaştırıldığında normal büyüdütransgenik bitkiler, yaprak orta kaburga, kabuklar kahverengi-renklenmenin görüntüleme hariç, biyokütle büyümesi ya da savunma mekanizmaları ile terfering ve kaynaklanıyor. Mikroskobik analizler, histolojik analiz ile bağlantılı olarak, yaprak sklerenkima elyaf inceltilmiş, ancak diğer büyük damar sistemi bileşenlerinin yapısı ve boyutu değiştirilmediğini olduğunu ortaya çıkardı. Transjenik mısırda lignin içeriği% 7-8,7 azaltıldı, kristalli selüloz içeriği lignin azalmaya karşılık olarak artan ve yarı selülozlar değişmedi. Analizler karbon akış selüloz biyosentezlerine linyin kaymıştır olabilir gösterebilir. Bu makalede, RNAi teknolojisi ile mısırdaki lignin içeriği aşağı regüle etmek için kullanılan prosedürleri çizer, ve hücre duvarı kompozisyon hücre duvarı yapısına değişikliklerin etkisini doğrulamak için kullanılır analizleri.

Biz, RNAi ile mısır bitkilerinde lignin içeriğinde bir azalma göstermiştir. Partikül bombardımanı bir dönüştürme yöntemi yaklaşık% 30 trnasformation verimi vermiştir. ZmCCR1 gen susturma sürekli T0-T2 kuşak gözlenmiştir. Lignin azaltılmış transgenikler yaprak orta kaburga, kabuğu ve kök kahverengi renklenme görüntülenmesi dışında Yabanitip mısır bitkilerine benzer büyüdü. Histolojik deney, mutant çizgiler mısır yaprak orta nervür 18 sklerenkima liflerin hücre...

Watch this Scientific Journal Video about Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis at JoVE.com

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Bir çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği mısır sinamoil koenzim alt bitki lignin içeriğine A redüktaz (ZmCCR1) geni aşağı regüle etmek için kullanılır. Lignin hücre duvarından aşağı-regülasyon mikroskopik analiz ile görselleştirilmiştir ve Klason yöntemi ile ölçülür. Yarı selüloz ve kristalin selüloz içinde Bileşim değişiklikler analiz edilmiştir.

Lignin Aşağı düzenleme<em&gt; Zea mays</em&gt; DsRNAi ve Klason Lignin Analizi ile

To facilitate the use of lignocellulosic biomass as an alternative bioenergy resource, during biological conversion processes, a pretreatment step is ...

lignin-down-regulation-zea-mays-via-dsrnai-klason-lignin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

13.3K Görüntüleme.  University of Arizona.  Bir çift sarmallı RNA girişimi (dsRNAi) tekniği mısır sinamoil koenzim alt bitki lignin içeriğine A redüktaz (ZmCCR1) geni aşağı regüle etmek için kullanılır. Lignin hücre duvarından aşağı-regülasyon mikroskopik analiz ile görselleştirilmiştir ve Klason yöntemi ile ölçülür. Yarı selüloz ve kristalin selüloz içinde Bileşim değişiklikler analiz edilmiştir. 

Video: Lignin Down-regulation of Zea mays via dsRNAi and Klason Lignin Analysis

Contrast Ultrasound Targeted Treatment of Gliomas in Mice via Drug-Bearing Nanoparticle Delivery and Microvascular Ablation

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the microvasculature are controlled by varying ultrasound pulsing parameters.  Specifically, we are testing whether such approaches may be used to treat malignant brain tumors through drug delivery and microvascular ablation.  Preliminary studies have been performed to determine whether targeted drug-bearing nanoparticle delivery can be facilitated by the ultrasound mediated destruction of "composite" delivery agents comprised of 100nm poly(lactide-co-glycolide) (PLAGA) nanoparticles that are adhered to albumin shelled microbubbles. We denote these agents as microbubble-nanoparticle composite agents (MNCAs). When targeted to subcutaneous C6 gliomas with ultrasound, we observed an immediate 4.6-fold increase in nanoparticle delivery in MNCA treated tumors over tumors treated with microbubbles co-administered with nanoparticles and a 8.5 fold increase over non-treated tumors. Furthermore, in many cancer applications, we believe it may be desirable to perform targeted drug delivery in conjunction with ablation of the tumor microcirculation, which will lead to tumor hypoxia and apoptosis. To this end, we have tested the efficacy of non-theramal cavitation-induced microvascular ablation, showing that this approach elicits tumor perfusion reduction, apoptosis, significant growth inhibition, and necrosis. Taken together, these results indicate that our ultrasound-targeted approach has the potential to increase therapeutic efficiency by creating tumor necrosis through microvascular ablation and/or simultaneously enhancing the drug payload in gliomas.

Insonation of microbubbles is a promising strategy for tumor ablation at reduced time-averaged acoustic powers, as well as for the targeted delivery of therapeutics. The purpose of the present study is to develop low duty cycle ultrasound pulsing strategies and nanocarriers to maximize non-thermal microvascular ablation and payload delivery to subcutaneous C6 gliomas.

Kontrast Ultrason Gliomlar, Tedavi Hedeflenen İlaç-Rulman Nanopartikül Teslimat ve Mikrovasküler Ablasyon ile Fare

We are developing minimally-invasive contrast agent microbubble based therapeutic approaches in which the permeabilization and/or ablation of the ...

Biyomühendislik

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biyomalzemelerin Yüksek Verimli Discovery için Polimer Mikroarray&#39;ler

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

Parametrized Diyastolik Dolum Biçimcilik yoluyla Transmitral Akışının Modellenmesi Kinematik tabanlı Analizi ile Küresel Diyastolik Fonksiyonu Kantitasyonu

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Studying Soft-matter and Biological Systems over a Wide Length-scale from Nanometer and Micrometer Sizes at the Small-angle Neutron Diffractometer KWS-2

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. The instrument is optimized for the exploration of the wide momentum transfer Q range between 1x10-4 and 0.5 &#197;-1 by combining classical pinhole, focusing (with lenses), and time-of-flight (with chopper) methods, while simultaneously providing high-neutron intensities with an adjustable resolution. Because of its ability to adjust the intensity and the resolution within wide limits during the experiment, combined with the possibility to equip specific sample environments and ancillary devices, the KWS-2 shows a high versatility in addressing the broad range of structural and morphological studies in the field. Equilibrium structures can be studied in static measurements, while dynamic and kinetic processes can be investigated over time scales between minutes to tens of milliseconds with time-resolved approaches. Typical systems that are investigated with the KWS-2 cover the range from complex, hierarchical systems that exhibit multiple structural levels (e.g., gels, networks, or macro-aggregates) to small and poorly-scattering systems (e.g., single polymers or proteins in solution). The recent upgrade of the detection system, which enables the detection of count rates in the MHz range, opens new opportunities to study even very small biological morphologies in buffer solution with weak scattering signals close to the buffer scattering level at high Q.
In this paper, we provide a protocol to investigate samples with characteristic size levels spanning a wide length scale and exhibiting ordering in the mesoscale structure using KWS-2. We present in detail how to use the multiple working modes that are offered by the instrument and the level of performance that is achieved.

Here, we present a protocol to investigate soft matter and biophysical systems over a wide mesoscopic length scale, from nm to &#181;m that involves the use of the KWS-2 SANS diffractometer at high intensities and an adjustable resolution.

Küçük açılı Nötron Difraktometre KWS-2 de Nanometre ve Mikrometre Boyutları bir geniş uzunluk ölçekli üzerinde yumuşak madde ve Biyolojik Sistemleri incelenmesi

The KWS-2 SANS diffractometer is dedicated to the investigation of soft matter and biophysical systems covering a wide length scale, from nm to &#181;m. ...

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging applications. This increased specificity can have significant clinical implications, including decreased side effects and lower dosages with higher potency. Furthermore, the in situ targeting and controlled modulation of specific cell subsets can enhance in vitro and in vivo investigations of basic biological phenomena and probe cell function. Unfortunately, the required expertise in nanoscale science, chemistry and engineering often prohibit laboratories without experience in these fields from fabricating and customizing nanomaterials as tools for their investigations or vehicles for their therapeutic strategies. Here, we provide protocols for the synthesis and scalable assembly of a versatile non-toxic block copolymer system amenable to the facile formation and loading of nanoscale vehicles for biomedical applications. Flash nanoprecipitation is presented as a methodology for rapid fabrication of diverse nanocarriers from poly(ethylene glycol)-bl-poly(propylene sulfide) copolymers. These protocols will allow laboratories with a wide range of expertise and resources to easily and reproducibly fabricate advanced nanocarrier delivery systems for their applications. The design and construction of an automated instrument that employs a high-speed syringe pump to facilitate the flash nanoprecipitation process and to allow enhanced control over the homogeneity, size, morphology and loading of polymersome nanocarriers is described.

Nanomaterials provide versatile mechanisms of controlled therapeutic delivery for both basic science and translational applications, but their fabrication often requires expertise that is unavailable in most biomedical laboratories. Here, we present protocols for the scalable fabrication and therapeutic loading of diverse self-assembled nanocarriers using flash nanoprecipitation.

Ölçeklenebilir, Hızlı montaj ve biyoaktif proteinler ve Immunostimulants yükleme yolu ile birden parlamak Nanoprecipitation çeşitli sentetik Nanocarriers içine

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in live-cell imaging and high-throughput microscopy techniques. This led to a constant increase in the amount and complexity of the microscopy data for a single experiment. Because manual analysis of microscopy data is very time consuming, subjective, and prohibits quantitative analyses, automation of bioimage analysis is becoming almost unavoidable. We built an informatics workflow called Substructure Analyzer to fully automate signal analysis in bioimages from fluorescent microscopy. This workflow is developed on the user-friendly open-source platform Icy and is completed by functionalities from ImageJ. It includes the pre-processing of images to improve the signal to noise ratio, the individual segmentation of cells (detection of cell boundaries) and the detection/quantification of cell bodies enriched in specific cell compartments. The main advantage of this workflow is to propose complex bio-imaging functionalities to users without image analysis expertise through a user-friendly interface. Moreover, it is highly modular and adapted to several issues from the characterization of nuclear/cytoplasmic translocation to the comparative analysis of different cell bodies in different cellular sub-structures. The functionality of this workflow is illustrated through the study of the Cajal (coiled) Bodies under oxidative stress (OS) conditions. Data from fluorescence microscopy show that their integrity in human cells is impacted a few hours after the induction of OS. This effect is characterized by a decrease of coilin nucleation into characteristic Cajal Bodies, associated with a nucleoplasmic redistribution of coilin into an increased number of smaller foci. The central role of coilin in the exchange between CB components and the surrounding nucleoplasm suggests that OS induced redistribution of coilin could affect the composition and the functionality of Cajal Bodies.

We present a freely available workflow built for rapid exploration and accurate analysis of cellular bodies in specific cell compartments in fluorescence microscopy images. This user-friendly workflow is designed on the open-source software Icy and also uses ImageJ functionalities. The pipeline is affordable without knowledge in image analysis.

Alt Yapı Analizörü: Floresan Mikroskopi Görüntülerinde HücreCisimlerinin Hızlı Araştırılması ve Doğru Analizi için Kullanıcı Dostu İş Akışı

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

Biyolojik Dokuların Uyarılması için Elektrikli ve Manyetik Alan Cihazları

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&#8242;-Phosphate

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can be generated from FMN photolysis upon irradiation with visible light. The ROS generated from FMN photolysis are harmful to microorganisms, including pathogenic bacteria such as Staphylococcus aureus (S. aureus). This article presents a protocol for deactivating S. aureus, as an example, via photochemical reactions involving FMN under visible light irradiation. The superoxide radical anion (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" />) generated during the FMN photolysis is evaluated via nitro blue tetrazolium (NBT) reduction. The microbial viability of S. aureus that is attributed to reactive <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63531/63531eq01v3.png" style="margin: auto;" /> species was used to determine the effectiveness of the process. The bacterial inactivation rate is proportional to FMN concentration. Violet light is more efficient in inactivating S. aureus than blue light irradiation, while the red or green light does not drive FMN photolysis. The present article demonstrates FMN photolysis as a simple and safe method for sanitary processes.

Inactivation of Pathogens via Visible-Light Photolysis of Riboflavin-5&amp;#8242;-Phosphate

Here, we present a protocol to inactivate pathogenic bacteria with reactive oxygen species produced during photolysis of flavin mononucleotide (FMN) under blue and violet light irradiation of low intensity. FMN photolysis is demonstrated to be a simple and safe method for sanitary processes.

Riboflavin-5′- Fosfatın Görünür Işık Fotolizi ile Patojenlerin İnaktivasyonu

Riboflavin-5&#39;-phosphate (or flavin mononucleotide; FMN) is sensitive to visible light. Various compounds, including reactive oxygen species (ROS), can ...

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions between mannosylated peptides and CV-N's high-affinity binding site. Virus envelope spikes gp120, HA, and Ebola glycoprotein (GP) 1,2 have been reported to bind both high- and low-affinity binding sites on dimeric CVN2. Dimannosylated HA peptide is also bound at the two low-affinity binding sites to an engineered molecule of CVN2, which is bearing a high-affinity site for the respective ligand and mutated to replace a stabilizing disulfide bond in the carbohydrate-binding pocket, thus confirming multivalent binding. HA binding is shown to one high-affinity binding site of pseudo-antibody CVN2 at a dissociation constant (KD) of 275 nM that further neutralizes human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) through oligomerization. Correlating the number of disulfide bridges in domain-swapped CVN2, which are decreased from 4 to 2 by substituting cystines into polar residue pairs of glutamic acid and arginine, results in reduced binding affinity to HA. Among the strongest interactions, Ebola GP1,2 is bound by CVN2 with two high-affinity binding sites in the lower nanomolar range using the envelope glycan without a transmembrane domain. In the present study, binding of the multispecific monomeric CV-N to severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) glycoprotein is measured at KD = 18.6 &#181;M as compared with nanomolar KD to those other virus spikes, and via its receptor-binding domain in the mid-&#181;-molar range.

Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance

The present protocol describes new tools for SPR binding assays to examine CV-N binding to HA, S glycoprotein, related hybrid-type glycans, and high-mannose oligosaccharides. SPR is used to determine the KD for binding either dimeric or monomeric CV-N to these glycans.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Surface plasmon resonance (SPR) is used to measure hemagglutinin (HA) binding to domain-swapped Cyanovirin-N (CV-N) dimer and to monitor interactions ...