Bir araştırma bursu aracılığıyla iş için fon deneyler ve Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gerçekleştirmek için ıslak laboratuvar alanı ve altyapıyı sağlamak için yazar teşekkür Dr. Philipp Selenko (FMP-Berlin) (LI 2402 / 2-1).

Nükleozomlardan 1. Sulandırma Farklı Olarak İzotop etiketli (ve asimetrik Modifiye) ile Kardeş Histonlar NOT: Mevcut protokol farklı olarak izotop işaretli histon H3 ile nükleozom sulandırılması açıklar. Bu amaçla, histon H3 iki havuzu kullanıldı; Bir 15 N-etiketlenmiştir ve N-terminusta bir 6xHis-etiketi içerir ve ikinci 13 C-etiketli ve N-terminalinde kaynaşmış Strep peptidi (WSHPQFEK) ihtiva etmiştir. Her iki etiketler Tütün Etch Virüsü (TEV) proteaz tanıma sitesi ile nativ H3 dizisinden ayrıldı. Ek asimetrik değiştirilmiş nükleozom hazırlamak için, iki H3 havuzlarından biri bir premodified biçimde dahil edilir. Bir histon havuzunun Premodification / reaksiyon kofaktör her türü için gerekli varlığında ilgili histon-modifiye edici enzim ile birlikte PTM Donörler 1 ilgi izotopla işaretli histon reaksiyona sokulması suretiyle gerçekleştirilebilir6. ilgili PTM etkin yerleşimini NMR spektroskopisi ya da kütle spektrometrisi ile tespit edilebilir. Burada kullanılan histonlar / DNA miktarları (260 nm &#39;de bir DNA konsantrasyonu olarak ölçülen) 10 uM bir konsantrasyonda .Bu Nihai verim nispeten kısa toplama süreleri ile kaliteli NMR spektrumunu kaydetme için yeterli olan bir nükleozom preparasyonunu elde edilmesi için kaba öneriler vardır. <ol><li> Farklı şekilde izotop etiketli (modifiye asimetrik ve) histon H3 ile bir histon oktamer Sulandırma Not: Rekombinan histon proteinleri BL21 (DE3) pLysS hücreleri 14 mg miktarlarda üretilebilir. Izotopla işaretli histon elde etmek için, aynı ifade / saflaştırma protokolü 15 N- veya 13 için, bakteri büyümesi için 15 NH4CI ve / veya azot ve karbon kaynağı olarak 13C-glükoz ihtiva eden bir minimal ortam kullanılması dışında takip edildi Cı-etiketleme saygımdanf. Saflaştırılmış histonlar yoğun 5 mM β-merkaptoetanol karşı diyaliz edilir ve kullanımdan önce liyofilize depolanır. <ol><li> tampon açılma 1 mL her bir histon ~ 5 mg, liyofilize histon alikotları çözülür (7 M guanidinyum-HCI, 20 mM Tris pH 7.5, 10 mM DTT). histon H3 her iki türlerini içerir. pipetleme karışım ve vorteks yok. Tam açılma sağlamak için 30 dakika süreyle buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> tampon açılması ve EXPASY portalında ProtParam aracı ile hesaplanmış ekstinksiyon katsayısı kullanılarak karşı 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek, her histon tam konsantrasyonunun belirlenmesi. 15 </li><li> % 50 iki histon H3 havuzlarının her içerecek şekilde akılda tutarak, eşit mol oranları çekirdek histon karıştırın. daha az konsantre histon tüm içeriğini kullanarak başlayın ve buna göre tüm diğerleri ekleyin. </li><li> yaklaşık olarak 1 mg nihai protein konsantrasyonu ayarlama / ml tampon açılma kullanılmıştır. </li><li> transfeR 6 kDa&#39;lık kesme diyaliz membranına karışımı soğutulmuş yeniden katlama tamponu, 4 ° C&#39;de (10 mM Tris pH 7.5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) içinde 1-2 L karşı diyaliz. Diyaliz, 3 saat, en az sürdürüldü sonra en az bir kez bir tampon değiştirme. son diyaliz göre O / N 4 ° C&#39;de gerçekleştirir. </li><li> diyaliz edilmiş malzeme toplamak ve maksimum hızda 4 ° C de 5 dakika süreyle bir mikrofüj içinde santrifüje edilerek bir çökeltileri uzaklaştırmak (normalde hiçbir çökelme dikkat edilmelidir). 280 nm&#39;de absorbans ölçülerek oktamer konsantrasyonunun belirlenmesi. Hesaplamalarda, çift her değere akılda tutarak, histon eklenen tükenme katsayıları kullanın. </li><li> 10 kDa-kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak yaklaşık 2 ml&#39;lik bir nihai hacme konsantre edin. oktamer konsantrasyon ve tahmini kaybı yeniden hesaplayın. Bu noktada, 50 arasında bir oktamer konsantrasyonu - 100 uM elde edilmelidir. </li><li> Bir üzere (Malzeme Tablo belirtilen) jel filtrasyon sütun bağlayınFPLC sistemi ve 0.22 mikron, süzüldü ve 1 ml / dakikalık bir akış oranı ve 0.5 MPa bir basınç sınırında tampon yeniden katlama gazı alınmış ve 2 kolon hacminde (CV) ile dengeye getirin. NOT: jel filtrasyon çalışma soğuk oda veya soğuk bir kabin içinde yapılmalıdır. </li><li> 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranı kullanılarak konsantre edilmiş malzeme enjekte edilir ve 1.0 toplama - 1.5 ml fraksiyonlar. </li><li> kromatografik profili izleyin ve ~ 65 histon oktamer elüsyon gözlemlemek - 68 ml. NOT: elüsyon zirvesinin küçük bir omuz ve ~ 80 mL bir zirve sırasıyla ücretsiz H3-H4 tetramers ve H2A-H2B dimerleri varlığına işaret etmektedir. </li><li> bir% 18 SDS-PAGE jeli her toplanan fraksiyonun 20 uL çalıştırın. NOT: yüksek tuz konsantrasyonunu azaltmak ve böylece, bozulmayı önlemek jeli üzerinde yüklemeden önce, su ile en az 2 olan bir faktörle örnekleri seyreltilir. Aynı tampon yeniden katlama numune daha sonra, SDS-PAGE analizi için geçerlidir. </li><li> Havuz ilgili fralekeli jel üzerinde 4 histon eşit dağılımı tarafından değerlendirilecektir ve (adım 1.1.7) daha önce olduğu gibi konsantrasyonunu belirlemek saf octamers içeren seksiyonlar. </li><li> Bir FPLC sistemi için 1 ml Ni-NTA kolonu (Malzemelerin Tablo) bağlayın ve 0.22 10 CV denge mikron filtre edilmiş ve 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranında tampon yeniden katlama gazı alındı. NOT: Ni-NTA kromatografisi, soğuk oda ya da soğuk bir kabin içinde yapılmalıdır. </li><li> 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranı kullanılarak Ni-NTA arıtıldı oktameri geçirin. </li><li> Flow-through toplayın ve SDS-PAGE / WB analizi için (20 uL ve 4 uL, sırasıyla) örnekleri tutmak. Daha sonra, tampon ya da bir taban sinyali ulaşılana kadar tekrar katlama, 10 CV ile sütun yıkayın. </li><li> 1 ml / dk&#39;lık bir akış oranı kullanılarak, 250 mM imidazol ihtiva eden tampon tekrar katlama, 10 CV ile yıkayın. (20 uL ve 4 uL, sırasıyla) SDS-PAGE / WB analiz için numune tutun. </li><li> AC 1 ml afinite sütunu dengeyeBir toplu / ağırlık akış kurulumu kullanarak 250 mM imidazol içeren 10 CV refolding tamponu ile ommercial streptavidin (Malzeme Tablosu). NOT: Bu kromatografik aşama, soğuk bir odada uygulanmalıdır. </li><li> Ticari streptavidin afinite kolonu içinden Ni-NTA elüsyon geçirin. </li><li> akışı toplamak ve SDS-PAGE / WB analiz için (20 uL, 4 uL, sırasıyla) örnekleri tutmak. Daha sonra, tampon yeniden katlama, 10 CV ile yıkayın. </li><li> 2.5 mM destiobiyotin içeren tampon refolding 10 CV ile Zehir. (Sırasıyla 20 ve 4 uL) SDS-PAGE / WB analizi için numune tutun. </li><li> , Oktamer konsantrasyonu ölçümü 10 kat daha az TEV proteaz ilave edildi ve reaksiyon, standart bir plastik santrifüj tüpü içinde 4 ° C&#39;de bir gece boyunca devam sağlar. NOT: TEV gerekli miktarda tam sindirim (afinite etiketleri kaldırılması) elde etmek üzere (inşa) ve aktivitesi üzerine kökeni bağlıdır (taze yapılmış, rekombinant TEV dahaAktif de uzun süreli depolanabileceklerini göstermektedir bir oranla - 80 ° C). (Protein konsantrasyonları olarak tahmini) oktamer göre başlangıçta ekleyerek 10 kat daha az TEV deneyin ve buna göre ayarlayın. </li><li> önceden karışımın 20 uL çalıştırarak ve% 18 SDS-PAGE jeli üzerinde TEV ilave edildikten sonra etkili sindirim edin. Sindirim tam değilse, daha fazla TEV proteaz ekleyebilir ve 3-4 saat boyunca inkübasyona devam edin. </li><li> TEV proteaz kaldırmak ve tampon kompozisyonu ayarlamak için bir 50 kDa-kesme diyaliz membranı kullanılarak tampon refolding karşı örnek dialyze. </li><li> 1.0-2.0 mL bir hacme (de kullanılabilir aşama 1.1.7 aynı filtre ünitesi), 10 kDa&#39;lık kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak saflaştırılmıştır asimetrik oktameri konsantre edilir. nihai konsantrasyon ölçülür. Her iki durumda da uzun bir süre için, -20 ° C de saklamak için (h / h) gliserol nükleozom sulandırma için kısa bir süre sonra kullanmak ya da 50% ayarlayın. Önceki adımları sırasında en azından% 70 kayıp bekliyor bu noktada ve inci50 uM - E oktamer konsantrasyonu 20 aralığında olmalıdır. </li></ol></li><li> nucleosome sulandırma <ol><li> oktamer% 50 gliserol içinde depolanmıştır ise, nükleozom sulandırma ile devam etmeden önce tampon yeniden katlama karşı 4 ° C de bir gece boyunca diyaliz. </li><li> 5 M NaCI stok solüsyonu kullanılarak 2 M NaCI tuz konsantrasyonu (nükleozom konumlandırma sekansı ihtiva eden) DNA ayarlayın. Not: birden çok istenen dizinin kopya veya içeren bir plazmidin saflaştırmadan sonra izole edilmiş ya da saflaştırılmış bir DNA PCR amplifikasyonu ile sentezlenebilir konsantre saklanmalıdır ~ 50 su içinde uM veya standart Tris-EDTA tamponu. </li><li> küçük ölçekli bir testi belirlenen optimum oranını kullanarak oktameri ve DNA karıştırın. ~ 3.0 mL son hacim ayarlamak için refolding tampon kullanın. Her zaman oktameri ve &lt;2 M tuz konsantrasyonlarında DNA karıştırma ihtimalini önlemek için son oktameri ekleyin. <ol><li> İlk küçük sc gerçekleştirinOptimum nucleosome verimleri yol açar DNA oranı: ale reconstitutions oktamer belirlemek için. 50-100 uL arasında bir hacim içinde oranları oktamer: 1.0, 1.0: 1.0, 1.1: 1.0, DNA Bunun için, 0.9 üç reaksiyonları bir araya getirin. Tipik olarak, 5 uM DNA konsantrasyonu kullanımı. </li><li> (Adım 1.2.4-1.2.8) aşağıda tarif edildiği gibi sulandırma ile devam ve sonunda, 260 nm&#39;de DNA konsantrasyonu ölçülerek ve% 6 nativ-PAGE DNA jel çalıştırarak çözünebilen ve iyi kalitede yeniden nükleozom miktarını tahmin , etidyum bromür, sırasıyla, (Şekil 5A) ile boyanmıştır. </li></ol></li><li> 6 kDa&#39;lık kesme diyaliz membranına karışımı aktarın ve 4 ° C&#39;de bir gece doğallaşım tamponuna 1 L karşı diyaliz. </li><li> 0.85, 0.64, 2 ila adım adım bir şekilde diyaliz tamponu tuz konsantrasyonunu azaltmak ve sırası ile 0.2 M NaCl. en az 3 saat süreyle her bir tampon maddesi içinde örnek tutun. Bazı durumlarda, son geçişten sonra oluşan çökelti. Bu durumda cplanlandığı gibi diyalize ontinue ve bir sonraki aşamada sonunda mikrofüj santrifüj çökeltiyi uzaklaştırmak. </li><li> Deney tamponu (25 mM NaH 2 PO4 / Na 2 HPO 4, pH 6.8, 25 mM NaCI, 2 mM DTT) 4 ° C&#39;de diyaliz O / N devam 1 L bir çanak içinde Aktarım diyaliz membranı. </li><li> örnek toplamak, bir maksimum hıza 4 ° C&#39;de 5 dakika süreyle bir mikrofüj içinde santrifüje adım 1.2.5 oluşan çökelti çıkarın ve ~ 300 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar 30 kDa&#39;lık bir-kesme santrifüj filtre ünitesi kullanılarak konsantre edilir. </li><li> bir% 18 SDS-PAGE protein jeli (örneğin 4 uL) ve birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de% 6 nativ-PAGE DNA jel (örnek 0.2 uL) ve mağaza örnek çalıştırın, 260 nm&#39;de DNA konsantrasyonu ölçülür. nihai konsantrasyon 10-20 uM aralığında olmalıdır. </li></ol></li></ol> İki Kardeş histon&#39;lardaki Modifikasyon Reaksiyonlarının 2. NMR Analizi NOT: DevriNucleosomal histon kuyrukları 2B 1 H 15 N korelasyon spektrumları başvuruları 16, 17, 18 bulunabilir. Ayrıca, CH atamaları 2D lizinlerinin, serin ve treonin grupları x 1 H-13 C korelasyon spektrumları referans 16 bulunabilir. <ol><li> NMR kurulumu ve referans spektrumları kayıt Not: Enzimatik diğer numune hacmi ile 300 K farklı NMR tüpler bir 3 mm&#39;lik NMR tüpü içinde deney tamponu içinde nükleozom numunenin 140 uL kullanılarak yapıldı de kullanılabilir. Söz konusu sıcaklık iyi kalitede nucleosomal histon kuyrukları ve iyi enzimatik faaliyetlerin 1 H 15 N korelasyon spektrumları elde etmek uygundur. 2D-SOFAST-HMQC 1 H-15, N ve 2B-1 H-HSQC 13C spektrumları bir kurulum t, sırasıyla kaydedildişapka benzer satın alma sürelerini bahşeder. Tipik elde etme parametreleri 1.024 (1 H), 128 geçici 1.024 128 (15 N), kompleks sayı ve 32 geçiş X (1H) x 64 (13 ° C) bir korelasyon spektrumları iki farklı kompleks sayı. Her iki 2D spektrumları için, satın alma süresi ~ 30 dakika oldu. <ol><li> spektrometre örnek sıcaklığı 300 K ayarlayın. % 10 ekleme D 2 O (hac / hac) bir numunesi, spektrometre frekansı kilidi için kullanılmak üzere hiç. </li><li> spektrometre örnek yerleştirin ve temel işlemleri (kilitleme, tuning, layneri) gerçekleştirin. Buna ek olarak, en iyi puls uzunlukları genel toplama parametrelerini belirler. </li><li> Kayıt 1D ve 2D 1 H 15 N ve 1 H-13 C referans spektrumları. </li><li> Süreç referans spektrumları ve sinyaller değişiklik reaksiyonları haritalanması için kullanılacak sağlamak iyi çözülmüş ve iyi yoğunlukları vardır. </li><li> örnek kurtarmak ve i aktarmakmikrofüj tüpüne t. </li></ol></li><li> Enzimatik reaksiyon, NMR izleme ve kantitatif analiz Kur <ol><li> Kopya ve aralıklı 2D 1 H 15 N ve 1 H-13 C spektrumları bir dizi düzenliyoruz. birkaç saatlik bir Toplam tarama süresi için Amaç ve birinci tepkimesinden elde edilen enzimsel oranlar temel alan yeni vadede buna göre ayarlanır. </li><li> Modifikasyonu reaksiyonun her türü için örnek gerekli kofaktörlerle ekleme (1 mM ATP / 2 mM fosforilasyonu için MgCl2, asetilasyon 1 mM asetil-CoA, metilasyon 1 mM SAM, vb.). </li><li> , Pipetleme karışım, ilgilenilen enzimi ekle spektrometre (hızlı bir şekilde bu işlemleri gerçekleştirmek) geri NMR tüpü ve daha sonra örnek aktarmak. NOT: beklenen enzimatik aktivite konusunda hiçbir veri yoksa, substrat-to-enzim 10 molar oranı ayarlayın: 1. İlk deneme çalışması yapmak ve buna göre ayarlamakGerçek çalıştırın. </li><li> hızlı otomatik shimming gerçekleştirin ve referans spektrumları parametrelerin geri kalanını kullanın. </li><li> Boş yaprak eklenmiş 2D 1 H-15 K, 1 H-13C spektrumları dizi olguyu başlatmaktadır. </li><li> gerçek zamanlı olarak reaksiyonun ilerlemesini takip edildi ve reaksiyon tamamlamayı veya arzu edilen bir seviyeye ulaştığında satın durdurun. </li><li> aynı parametrelerle eskisi gibi süreç spektrumları. </li><li> korelasyon spektrumları iki tür için farklı bir satın alma siparişi kullanarak tüm çalıştırmak tekrarlayın. İlk deneyde 1 H 15 N korelasyon dizisinin ilk olduysa, bir 1 H-13 C korelasyon şimdi başlayın. Bu her iki spektrumları aynı edinim süresine sahip olarak, arsa ve aynı zaman ölçeğinde, her iki farklı olarak, izotopla işaretli histon üzerindeki PTM reaksiyonları karşılaştırmak mümkündür. Ayrıca, ortalamalar ve arsa hata çubukları hesaplamak mümkündür. NOT: Bir thorougNMR sinyal analizi ve enzimatik reaksiyonlar daha sonra ölçümü için yöntemler H açıklaması burada 19 bulunabilir. </li><li> reaksiyonun ilerlemesini rapor her zaman ders NMR spektrumundan NMR sinyalleri seçin ve NMR spektrumları için bir görselleştirme ve analiz yazılımı kullanılarak göreceli sinyal yoğunlukları hesaplamak. değiştirilmemiş yanı sıra modifiye durumlarını rapor sinyaller için bunu yapın. modifikasyon seviyelerini ayıklayın. </li><li> Reaksiyon zamana karşı modifikasyon seviyelerinin hesaplanan değerleri çizilir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution:+Determinants,+Mechanisms,+and+Functions.">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes.">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li><li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers.">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li><li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications.">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li><li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Language+of+Histone+Crosstalk.">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li><li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events.">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li><li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetrically+Modified+Nucleosomes.">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li><li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality.">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li><li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications.">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li><li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection,+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy.">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li><li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+&#945;-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites.">Intracellular repair of oxidation-damaged &#945;-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251 (2016).</li><li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds.">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling,+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy.">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li><li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA.">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li><li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ExPASy+:SIB+bioinformatics+resource+portal.">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li><li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy.">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li><li>St&#252;tzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails.">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li><li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H4+K16Q+Mutation,+an+Acetylation+Mimic,+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome.">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts.">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li><li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins.">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li><li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy.">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li><li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes.">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li><li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells.">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

Nucleosome yeniden oluşturulmak üzere, mevcut protokol 601-Widom nucleosome konumlandırma dizisini 20 içeren bir 165 bp uzunluğunda DNA şablonu kullanır, ancak benzer performans DNA şablonları değişik uzunluklarda kullanılarak bekleniyor. protokol histon H3 asimetrik türlerini kullanarak tasarlanmış ve kullanılmıştır. Aynı ilke ile, yöntem, diğer çekirdek histon için de uygulanabilir ve buna ek olarak farklı bir izotop etiketli iki farklı çekirdek histon taşıyan kompl...

Ökaryotik DNA sıkıca kromatin içine hücre çekirdeğinde içinde paketlenir. kromatin temel yapı taşı iki nüsha dört çekirdek histon her (H3, H4, H2A, H2B) oluşan bir oktamerik kompleks sarılı DNA ~ 147 bp içerir nucleosome çekirdek parçacık olduğunu. Histon proteini post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) bir bolluk barındırırlar. Bu kovalent ikameler, hem doğrudan hem de sistemin fiziksel kimya etkileyerek dolaylı kromatin remodeling faaliyetleri, 1, 2, 3 alımı ile kromatin yapısındaki değişiklikler neden olur. Bu sayede, histon PTMS Bu nedenle, tüm DNA bazlı hücresel fonksiyonları 4 düzenleyen, kromatin ulaşmak ve kontrol. PTMS ağırlıklı nucleosome-dahil çekirdek histo yapılandırılmamış N-terminal kesimleri (kuyrukları) üzerine histon modifiye enzim sistemleri tarafından yüklenirnes. Nedeniyle histon kuyrukları nispeten kısa dizisi birçok değişiklik sitelerine, PTMS uyaran veya sonradan değişiklik reaksiyonları, modifikasyon çapraz konuşma 5 olarak bilinen bir etkisi bloke ederek birbirini etkilemektedir. Çünkü nükleozom genel simetrik mimarisi, modifikasyon reaksiyonları ve karışma mekanizmaları her nucleosomal histon (kardeş histon) iki nüsha üzerine benzer oluştuğu düşünülüyordu. Bu kavram son zamanlarda meydan ve sonradan yalanlandı. Özellikle, serbest histon H3 kuyruk peptidler ve nükleozom in vitro enzimatik deneyler, H3 kinazlar bir dizi asimetrik bir şekilde 6 fosforilasyonu ortaya olduğunu göstermiştir. Ek olarak, afinite arıtma tabanlı LC-MS / MS analizi ökaryotik hücreler 7 çeşitli tipler, asimetrik H3-metillenmiş nükleozom varlığını ortaya çıkarmıştır. Böylece, asimetrik değiştirilmiş nükleozom yeni türler oluşturur vearaçları kendi oluşumunu kontrol ve bu asimetri uygulamak olabilir karışma etkilerini analiz etmek mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gereklidir. Genel olarak, Western Blot (WB) ve kütle spektrometrisi (MS) analizi histon PTMS tespit etmek için kullanılmıştır. Kolay uygulama olmasına rağmen, WB özgünlüğü / çapraz reaktivite sorunlardan muzdarip. Bunun üzerine, bu aynı anda birden fazla PTM analiz ve modifikasyon reaksiyonları 8 doğrudan ölçümü gerçekleştirme yeteneğinde değildir. Öte yandan, MS analizi üst düzey eğitim gerektirir sofistike aletler kullanılır, ancak birden PTMS 9 yüksek özgüllük yanı sıra eşzamanlı haritalama ve ölçümü sağlar. &#160; Bununla birlikte, her iki yöntem de yıkıcı ve nükleozomal kompleksleri histon ve / veya histon türevi peptitlerin karışımına yol açan, analizden önce ayrışmış. Bu manipülasyon bağımsız ayırt yeteneği kaldırırİki kardeş histon her biri üzerinde meydana gelen ve nucleosomal histon kopyası özgü değişiklik durumunu bildirmek için modifikasyon reaksiyonları. PTM tepkileri eşleştirmek için alternatif bir yöntem olarak gelişti Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi. NMR, 11 yıkıcı olmayan ve bu nedenle de yeniden karışımlarında gerçek zamanlı bir şekilde PTM etkinlikleri izlenmesine olanak sağlar ve hatta, sağlam hücreler 10. 2D göre, hızlı veri toplama için rutinleri yanı sıra, yüksek çözünürlüklü eşleme geliştirme izotopla işaretli (15 N ve / veya 13 ° C) örneklerinin heteroatom nükleer korelasyon yöntemleri 12, bu PTMS farklı eşzamanlı eşleme izin serin / treonin / tirozin fosforilasyonu, lizin asetilasyon / metilasyon ve arginin metilasyonu 13 olarak. Soruşturma altında PTM bağlı olarak, 15 N veya 13 C-etiketleme protocols bir değişiklik muhabir olarak hizmet veren protein fonksiyonel grubu işaretlemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, PTM yerleştirme araçları kimyasal madde ortamında Değişiklik &quot;algılama&quot; tekabül eden fonksiyonel grup karakteristik kimyasal kayma yer değiştirme izleyerek gerçekleştirilebilir. Çoğu durumda, NH ve CH kimyasal grupların her iki ilgi PTM evrimini bildirmek için kullanılabilir. Geçerli protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom üretimini tarif. NMR spektroskopisi esnekliği seçilmiş yeniden histon komplekslerinin saflaştırılması için farklı protein afinite etiketleri kullanımı ile hem 1 H 15 N ve 1 H-13 C korelasyon spektrumları kullanılarak PTMS eşleştirmek için bir araya getirir. Bu protokol nükleozom sulandırma için belirli histon iki farklı havuzları kullanmaktadır. Bu havuzlar farklı şekilde izotop işaretli (tek ile vardır <sup&gt; 15 N, 13 ° C, diğer), ve sırası ile bir polihistidin ve bir streptavidin afinite etiketi için eritilerek birleştirilir. Ni-NTA ve streptavidin bazlı kromatografi ile tandem afinite saflaştırma şeması, ilk Voigt ve arkadaşları tarafından kullanılır. 7 simetrik meslektaşları (Şekil 1A), asimetrik tür saflaştırmak için kullanılır. Asimetrik histon octamers standart tuz diyaliz yöntemi 14 ile eşdeğer nükleozomal kompleksleri (Şekil 1B) tekrar oluşturmak için, daha sonra kullanılır. Buna ek olarak, modifiye edilmiş önceden aynı prosedür aracılığıyla ve histon havuzları birine sahip olarak, bir PTM elde nükleozom üzerine asimetrik dahil edilebilir. Histon modifiye enzimler ve modifikasyon olayların ardından NMR-haritalama ile bu yüzeylerin reaksiyonu (her ikisi de-cis (premodified histon kopya) ve trans unmodifi karışma mekanizmalarının karakterizasyonu sağlayacaked histon kopya) (Şekil 1C).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Unfolding Buffer</td>
			<td>7M guanidinium HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>20mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>10mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refolding Buffer</td>
			<td>10mM Tris pH7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2M NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>1mM EDTA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Buffer</td>
			<td>25mM NaxHxPO4 pH6.8</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>25mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>2mM DTT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidinium HCl</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A14199</td>
			<td>Use high quality Gu-HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>27810.364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d-Desthiobiotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1034557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-Tactin Superflow</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1207-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>His-probe antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strep-tactin conjugated HRP</td>
			<td>IBA</td>
			<td>2-1502-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Load 16/600 Superdex 200pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9893-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-8kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 1, 132650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50kDa dialysis membrane</td>
			<td>Spectrumlabs</td>
			<td>spectra/por 7, 132129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30kDa centrigugal filter unit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>UFC903024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution-state NMR spectrometer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reconstitution of nucleosomes with differentially isotope-labeled sister histones

Asimetrik modifiye nükleozom post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) belirgin setleri ile dekore edilmiş bir histon iki kopyasını (kardeş histon) içerirler. Onlar yeni kurulması ve işlevsel etkileri bilinmeyen yollarla türler tanımlanır. Güncel analitik yöntemler nucleosomal kardeş histon üzerinde PTMS kopya özgü oluşumunu algılamak için yetersiz kalmaktadır. Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom in vitro Sulandırma için bir biyokimyasal yöntem sunmaktadır. Oluşturulan kompleks, histon subcomplexes tekrar katlama esnasında premodified histon havuz sonra da asimetrik değiştirilmiş olabilir. Bu asimetrik nükleozom preparatlar kolaylıkla olarak, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi kullanılarak asimetrik ön dahil PTM tarafından uygulanan modifikasyonu çapraz konuşma ile ilgili mekanizmaların çalışılmasına histon değiştirici enzimler ile de reaksiyona sokulabilir. özellikle, modifikasyon reaksiyonlarıGerçek zamanlı, ilgili izotop türü için özel NMR korelasyon deneyleri farklı, yaparak iki kardeş histon bağımsız eşlenebilir. Bu metodoloji nucleosomal kompleksleri üzerinde asimetrik PTM desen oluşumu ve yayılımı katkıda karışma mekanizmaları incelemek için araçlar sağlar.

Düzgün şekilde yeniden katlanmış oktamerik türlerin bir jel filtrasyon kolonu boyunca yeniden oluşturma karışımının bir çalışma (Şekil 2) sonra izole edilir. octamers üç farklı türde ihtiva oktamerik yeniden havuzu tandem afinite saflaştırma şeması tabi tutulur. Örnekler Tüm adımlar toplandı ve WB SDS-PAGE ile ve daha sonra analiz edilir. Asimetrik türünün izolasyonu ile sonuçlanan protokolünün doğru bir şekilde yapılması doğrulanma...

Watch this Scientific Journal Video about Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones at JoVE.com

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

reconstitution-nucleosomes-with-differentially-isotope-labeled-sister

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K Görüntüleme.  Leibniz Institute of Molecular Pharmacology (FMP-Berlin).  Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir...

Video: Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Biyokimya

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and sensitivity for DNA. In order to determine if the DNA molecules are full length after the completion of the experiment, a method is required to determine if the stained molecules are full length by digesting DNA with restriction enzymes. However, stained DNA may inhibit the enzymes, so a method is needed to determine what enzymes one could use for fluorochrome stained DNA. In this method, DNA is stained with a cyanine dye overnight to allow the dye and DNA to equilibrate. Next, stained DNA is digested with a restriction enzyme, loaded into a gel and electrophoresed. The experimental DNA digest bands are compared to an in silico digest to determine the restriction enzyme activity. If there is the same number of bands as expected, then the reaction is complete. More bands than expected indicate partial digestion and less bands indicate incomplete digestion. The advantage of this method is its simplicity and it uses equipment that a scientist would need for a restriction enzyme assay and gel electrophoresis. A limitation of this method is that the enzymes available to most scientists are commercially available enzymes; however, any restriction enzymes could be used.

Staining DNA molecules for fluorescence microscopy allows a scientist to view them during an experiment. In the method presented here, DNA molecules are pre-stained with fluorescent dyes and digested with methylation and non-methylation sensitive restriction enzymes.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Benchtop Immobilized Metal Affinity Chromatography, Reconstitution and Assay of a Polyhistidine Tagged Metalloenzyme for the Undergraduate Laboratory

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become the most widely used protein purification method in the modern literature. But, the application of affinity chromatography to metal binding proteins, especially those with redox sensitive metals such as iron, is often limited to laboratories with access to a glove box - equipment that is not routinely available in the undergraduate laboratory. In this article, we demonstrate our benchtop methods for isolation, IMAC purification and metal-ion reconstitution of a poly-histidine tagged, redox-active, non-heme iron binding extradiol dioxygenase and the assay of the dioxygenase with varied substrate concentrations and saturating oxygen. These methods are executed by undergraduate students and implemented in the undergraduate teaching and research laboratory with instrumentation that is accessible and affordable at primarily undergraduate institutions.

Here we present a protocol for the benchtop immobilized metal affinity chromatography purification and subsequent reconstitution of a polyhistidine tagged, non-heme iron binding dioxygenase suitable for the undergraduate teaching laboratory.

Benchtop Metal benzeşme kromatografi, sulandırma immobilize ve bir Polyhistidine tahlil Metalloenzyme Lisans Laboratuvarı etiketli.

Benchtop immobilized metal affinity chromatography (IMAC), of polyhistidine tagged proteins is easily mastered by undergraduate students and has become ...

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such systems allows for detailed studies of their underlying mechanisms which would not be feasible in vivo. Here, we provide a protocol for the in vitro reconstitution of the MinCDE system of Escherichia coli, which positions the cell division septum in the cell middle. The assay is designed to supply only the components necessary for self-organization, namely a membrane, the two proteins MinD and MinE and energy in the form of ATP. We therefore fabricate an open reaction chamber on a coverslip, on which a supported lipid bilayer is formed. The open design of the chamber allows for optimal preparation of the lipid bilayer and controlled manipulation of the bulk content. The two proteins, MinD and MinE, as well as ATP, are then added into the bulk volume above the membrane. Imaging is possible by many optical microscopies, as the design supports confocal, wide-field and TIRF microscopy alike. In a variation of the protocol, the lipid bilayer is formed on a patterned support, on cell-shaped PDMS microstructures, instead of glass. Lowering the bulk solution to the rim of these compartments encloses the reaction in a smaller compartment and provides boundaries that allow mimicking of in vivo oscillatory behavior. Taken together, we describe protocols to reconstitute the MinCDE system both with and without spatial confinement, allowing researchers to precisely control all aspects influencing pattern formation, such as concentration ranges and addition of other factors or proteins, and to systematically increase system complexity in a relatively simple experimental setup.

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

We provide a protocol for in vitro self-organization assays of MinD and MinE on a supported lipid bilayer in an open chamber. Additionally, we describe how to enclose the assay in lipid-clad PDMS microcompartments to mimic in vivo conditions by reaction confinement.

Vitro Sulandırma Protein kalıpları üzerinde desteklenen Lipid Bilayers kendi kendini düzenleme

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Microemulsions boş hücre Xenopus yumurtanın hücre döngüsü salınımlarını sulandırma ayıklar

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Rekombinant Drosophila , lipid karıştırıcılar Için lipozomlar halinde deterjan destekli yeniden yapılanma

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...