Bu protokol, diğer tek molekül tekniklerine uygun olmayan AFM'nin tüm önemli özelliklerini kullanır. Sonuç olarak, nükleozomun yapısını nano ölçekte çözebiliyoruz. Daha da önemlisi, nükleozomların doğrudan görselleştirilmesi fizyolojik koşullarda yapıldı.
AFM tekniğimizi kullanarak, son zamanlarda tüm sentromer işlevinde rol oynayabilecek sentromer nükleozomunun benzersiz özelliklerini ortaya çıkardık. Gösterilecek yöntem şu anda laboratuarımızda amiloid agregalarının oluşumu ile ilişkili proteinlerin kendi kendine biraraya getirmek için uygulanmaktadır. Bu protein agregaları Alzheimer ve Parkinson gibi yıkıcı hastalıkların gelişimini tetikler.
Basit hazırlama yöntemleri, DNA çoğaltma makineleri gibi büyük sistemler de dahil olmak üzere diğer protein-DNA kompleksleri için de geçerlidir. Bazı değişiklikler gerekli olmasına rağmen. Statik ve zaman atlamalı atomik kuvvet mikroskobu kullanarak tek molekül düzeyindenükleozom parçacıkları karakterize etmek için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi nükleozomların arındırılması, birleştirilmesi ve doğrulanması ile başlar.
Daha sonra, statik AFM görüntüleme için mika yüzeyini hazırlayın. Bunu yapmak için, ilk deiyonize suda elli milimolar APS stok çözeltisi hazırlamak. Bu çözeltinin bir mililitrelik aliquotlarını ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın.
Stok çözeltisinden, 50 mikromolar APS stokunun 50 mikrolitresini 15 mililitre distile deiyonize suda eriterek mika modifikasyonu için çalışan bir APS çözümü hazırlayın. Çözeltiyi karıştırın ve sonra çözelti ile bir cuvette doldurun. Sonra, yüksek kaliteli mika levhalar mika üç santimetre şeritler bir kes.
Bir cuvette çapraz yerleştirildiğinde parça uygun olup olmadığını kontrol edin. Daha sonra, her iki taraf taze beşli kadar mika katmanları cleave, ve parça olarak ince 0.1 milimetre. Mika parçasını hemen APS dolu cuvette'ye yerleştirin ve mikayı 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Mika parçasını distile deiyonize su yla dolu bir çiviye aktarın ve 30 saniye bekletin. Daha sonra, APS mika şeridinin her iki tarafını da tamamen kurutmak için argon kullanın. Birkaç manyetik diskler için çift yüzlü yapışkan bant uygulayın ve yan yerleştirin.
Daha sonra, APS mika alt tabakasını bir santimetre kare ile bir santimetreye kesin ve bunları temiz bir Petri kabına kapatın. Daha sonra, 10 milimolar hepes ve 7,5 PH dört milimolar magnezyum klorür içeren bir 0.22 mikron filtreli tampon kullanarak monte nükleozomların üç seyreltme hazırlamak. Nükleozomların kaybını sınırlamak için, düşük son konsantrasyonda seyreltme APS mikasının birikmeden hemen önce teker teker yapılmalıdır.
Aps mika parçasının ortasına her nükleozom numunesinin 5 ila 10 mikrolitresini yatırın ve iki dakika kuluçkaya yatırmalarını bekleyin. Daha sonra, tampon bileşenleri kaldırmak için iki ila üç mililitre distile deiyonize su ile numuneyi hafifçe durulayın. Ve biriken numuneyi argon ışığı altında kurutun.
Başlamak için, AFM kurulumunun uç tutucuya bir ipucu takın. Ardından, ilk örneği AFM sahnesine monte edin ve numune yüzeyine temas etmemeye dikkat edin. Lazeri, toplamı maksimum olana kadar kantilin üzerinde konumlandırın ve dikey ve yanal sapma değerlerini sıfıra yakın ayarlayın.
Ardından, rezonans frekansını bulmak, sürücü genliğini ayarlamak ve görüntü boyutunu 100'e 100 nanometreye ayarlamak için AFM sondasını ayarlayın. Ayarlandıktan sonra, yaklaşmaya başlamak için meşgul düğmesini tıklatın. Yaklaşım tamamlandığında, numunenin yüzeyi açıkça görülene kadar genlik ayar noktasını kademeli olarak optimize edin.
Ardından, tazyik boyutunu bir mikrona, çözünürlüğü 512'ye 512 piksele yükseltin. Son olarak, görüntü edinimi başlatmak için yakalama düğmesini tıklatın. AFM tarayıcı aşamasına bir cam çubuk takmak için cam çubuk tarayıcı tutkal kullanın.
Bu en az 10 dakika kurumasını bekleyin. Bu arada, daha büyük bir mika levha onları delerek 1,5 milimetre çapında mika 0.1 milimetre kalınlığında dairesel parçalar yapmak. Yüksek hızlı AFM mika cam çubuk tutkal yüksek hızlı AFM üzerinde cam çubuk bu mika parçası eklemek için kullanın ve kurur ise en az 10 dakika boyunca dokunulmamış kalmasını bekleyin.
Daha sonra, yüksek bir katmanlı bant üzerinde görülene kadar bir basınca duyarlı bant kullanarak mika katmanları cleave. Daha sonra, 500 mikromolar APS çözeltisi yapmak için distile deiyonize su 99 mikrolitre 50 milimolar APS stok 50milimolar APS stok bir mikrolitre seyreltmek. Çözeltinin 2,5 mikrolitresini taze olarak aralanmış mika yüzeyine yatırın ve yüzeyin 30 dakika işlevsel hale gelsin.
Kuluçkadan sonra, mikayı üç mikrolitre durulama uygulayarak distile deiyonize su ile birkaç kez durulayın. Mikanın kenarına dokuma olmayan bir mendil yerleştirerek her durulamayı takip eden suyu tamamen çıkarın. Son durulandıktan sonra, üç mikrolitre distile deiyonize su yüzeyine yerleştirin ve özel olarak bağlı olmayan APS'yi çıkarmak için en az beş dakika boyunca oturun.
Ardından, prob'u yüksek hızlı AFM tutucuya yerleştirin ve ucu yukarı bakacak şekilde tutucuyu AFM sahnesine yerleştirin. Tutucuyu 100 mikrolitre distile deiyonize su kullanarak durulayın ve ardından 0,22 mikron filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponunun 100 mikrolitrelik iki durulayın. Durulamalar yapıldı, ucu batırarak, nükleozom görüntüleme tampon 100 mikrolitre ile oda doldurun.
Lazerle vurulana kadar cantilever pozisyonunu ayarlayın. Daha sonra, durulama başına dört mikrolitre kullanarak, filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tamponu ile APS mika beş kez durulayın. Bir nanomolar son nükleozom konsantrasyonu için filtrelenmiş nükleozom görüntüleme tampon 250 mikrolitre içine nükleozom montaj stok bir mikrolitre seyreltin.
Yüzeye bu seyreltme 2,5 mikrolitre mevduat ve iki dakika boyunca oturup sağlar. Kalabalığı önlemek için dört mikrolitre nükleozom görüntüleme tamponu yla yüzeyi iki kez durula. Son durulama dan sonra, yüzeyi görüntüleme tamponuyla kaplı bırakın.
Tarayıcıyı ve örneği uç tutucunun üstüne ayarlayın, böylece örnek yüz üstü olacak. Yaklaşmaya başlamak için, otomatik yaklaşım işlevini serbest salınım genliğine yakın ayar noktası genliği yle kullanın. Yüzey iyi izlenene kadar ayar noktasını ayarlayın.
Daha sonra, görüntüleme çerçevesi başına yaklaşık 300 milisaniye veri toplama hızı ile 200 tarafından 200 nanometre 150 ile 150 nanometre etrafında görüntü alanı ayarlayın. Montaj ve biriktirme kontrolü olarak H3 mononükleozomları statik AFM kullanılarak hazırlandı ve görüntülendi. Bu görüntü nükleozom popülasyonunun nüselozomların başarılı bir şekilde bir araya getirildiğini doğrulayan birikimin hemen öncesinde var olduğu gibi bir anlık görüntüsünü sağlar.
H3 kontrol tertibatının başarılı olması yla birlikte, sunulan yöntemler daha sonra CENP-A nükleozomlarının çalışmasına uygulandı. Bu örneğin Statik AFM görüntüleme simontajı bir başarı olduğunu ortaya koymuştur. Statik AFM görüntülerinden mononükleozomların yüksekliği ve dönüş sayısı karakterize edilebilir.
Serbest DNA kolları arasındaki açı ve serbest DNA kollarının uzunluğu, tek tek nükleozomdaki DNA dönüşlerinin sayısını belirlemek için kullanılır. Buna karşılık, nükleozomların zaman atlamalı AFM görüntülemenü nükleozomların genel spontan açma davranışını görselleştirmek için kullanılabilir. Nükleozomun dönüş sayısı azaldıkça, nükleozom çekirdek hacminde de bir azalma gözlenir.
Normal zaman atlamalı görüntülemeye ek olarak, yüksek hızlı zaman atlamalı AFM, standart zaman atlamalı görüntüleme kullanılarak kaçırılan daha karmaşık nükleozom dinamiklerini araştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin dinamikleri uzun bir süre boyunca yakalayabilme yeteneği, 1200 kare boyunca yakalanan bir CENP-A nükleozom çekirdeğinin uzun mesafe translokasyonunun görüntülenmesi için gerekliydi. Bu teknik aynı zamanda bir CENP-A nükleozom çekirdeğinin bir DNA substratından diğerine nadir transferini yakalamada da kritik öneme sahiptir.
Hızlı görüntü yakalama hızı, bu dinamik olayın görselleştirilmesini mümkün kıldı, çünkü tamamlanması sadece birkaç kare aldı. Geniş kromatin alanında liger histones ve kromatin dinamiklerinin histon büyütme rolleri ile ilgili önemli sorular bir dizi vardır. Tüm bu sorular bizim tekniğimizle cevaplanabilir.
