JBB King&#39;in İngiltere Kalp Vakfı Merkezi&#39;nde Kariyer Kuruluş üyesidir. AA İngiliz Kalp Vakfı Üst üyesidir (FS / 13/2/29892). Çalışmamız bir mükemmellik girişimi tarafından desteklenmiştir (Yetkinlik Merkezleri Mükemmel Teknolojileri - COMET) Avusturya Araştırma Promosyon Ajansı FFG ait: &quot;Damar Mükemmeliyet Araştırma Merkezi Yaşlanma - Tirol, VASCage&quot; (K-Proje numarası 843536) ve NIHR Biyomedikal Araştırma King College Hastanesi ortaklığında Guy ve St Thomas&#39; Ulusal Sağlık Servisi Vakfı Güven ve King College London&#39;da tabanlı Merkezi.

Çalışma Wandsworth Yerel Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı (referans numarası: 06 / Q0803 / 37) araştırma ve geliştirme dairesinden alınan kurumsal onayı. Tüm hastalar yazılı izin verdi. Ekstrasellüler Matriks Proteinleri 1. Ekstraksiyon NOT: Bu deneyler için kullanılan insan atriyal dokular sadece kalbin kardiyoplejik tutuklanmasının ardından, kardiyopulmoner bypass esnasında atriyal eklerle elde edilmiştir. Tüm numuneler St George Hastanesi, Londra, İngiltere toplandı. Tüm doku numuneleri -80 ° C &#39;de dondurulur. Örneğin paraformaldehid gibi fiksatif, korunmuş örnekleri kullanmak çapraz bağlanma proteinleri bu verme. <ol><li> Ekstraksiyon aşamaları arasında zamanı en aza indirmek için, Tablo 1 &#39;deki gibi, deney öncesinde her ekstraksiyon tampon hazırlayın. sıcaklık-kontrollü bir ortamda, oda sıcaklığında (RT) her inkubasyon gerçekleştirmek(Yani, ~ 20 ° C) ekstraksiyon arasında tutarlılığı sağlamak için. </li><li> doku 20-50 mg tartılır. çeşitli örnekleri, ekstre kesilir ve bunları tek tek ağırlık edilecek ise dokuların tamamen çözülme önlemek için. Bir neşter kullanılarak, 3-4 küçük parçalar (örneğin, 2-3 mm) halinde doku zar ve 1.5 ml tüpler içinde bir araya yerleştirmek. </li><li> (PBS; Tablo 1 ve Malzemelerin Tablo) buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su, 500 ul ilave edin ve kan kirlenmesini en aza indirmek için, beş yıkama yapar. </li><li> Ekstraksiyon Aşama 1: NaCI Tamponu ile inkübasyon <ol><li> PBS ile yıkandıktan sonra, vida kapaklı 1.5 ml tüpler içine örnekleri yer. NaCI tampon ekleme doku ağırlığı: 10 kere (h) (Tablo 1 e bakınız). Girdap minimum hızda (yani, 600 rpm) 1 saat boyunca oda sıcaklığında borular. NOT: Düşük girdap hızı bu adımı sırasında doku mekanik kesintileri önlemek için çok önemlidir.ekstraksiyon sırasında tüm tüpler yerleştirmek için bir köpük adaptörü kullanın. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika 16,000 x g&#39;de yeni tüplere ve santrifüj özler aktarın. kullanılana kadar -20 ° C &#39;de özleri saklayın. Kısaca, taze NaCI tamponu ile kalan doku peletleri yıkayın. Tampon aynı tip (örneğin, NaCI tamponu, 100 uL) Yıkama için farklı çözünürlüklere (NaCI ile ekstre değil, yani, protein) birlikte olan diğer proteinlerin çıkmasını önlemek için. </li><li> Yıkama işleminden sonra, bir sonraki ekstraksiyon adımları ile protein içeriği örtüşme en aza indirmek için tampon tam olarak çıkarılmasının sağlanması. yıkama için kullanılan NaCl tamponu atılır. Not: tampon hacmi ve doku ağırlığı arasındaki oran, bir yeniden üretilebilir ekstraksiyon için önemlidir. 10: 1 oranında (hacim: ağırlık) NaCI ve SDS ekstraksiyon için ve 5: 1 GuHCl adımı için tampon doyurmaksızın proteinin yeterli miktarda bulunur. Protein konsantrasyonları, yaklaşık ext sonra 1-2 ug / ml olanreaksiyona karşı. </li></ol></li><li> Ekstraksiyon Adım 2: SDS Tamponu ile Hücresizleştirme <ol><li> On kat (hacim: ağırlık) SDS tamponu (Tablo 1) ilave doku ağırlığı; Düşük SDS konsantrasyonlarda (yani,% 0.1) kullanımı, hücresizleştirme esnasında ECM protein kaybını önlemek için önemlidir. Girdap minimum hızda (yani, 600 rpm) 16 saat boyunca oda sıcaklığında borular. NOT: Düşük girdap hız ECM mekanik bozulması en aza indirir. </li><li> Yeni tüplere özler aktarın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüje tabi tutulur; kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklayın. Kısaca SDS&#39;yi temizlemek için dd, H2O ile geri kalan doku peletleri yıkayın. Yıkama sonrası sıvının tam olarak çıkarılmasının sağlanması. </li></ol></li><li> Ekstraksiyon Adım 3: GuHCl Tamponu ile inkübasyon <ol><li> (: H) doku ağırlığı beş kez GuHCl tamponu (Tablo 1) ekleyin. Vorteks yani maksimum hızda 72 saat (oda sıcaklığında tüpler </em&gt; 3,200 rpm); kuvvetlice vorteksleme ECM mekanik bozulması kolaylaştırır. </li><li> Yeni tüplere özler aktarın. kullanılana kadar -20 ° C &#39;de 10, 4 ° C&#39;de dakika ve mağaza 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li></ol></li></ol> 2. Protein Niceleme ve Yağış Not: deterjanların varlığı nedeniyle, SDS tampon maddesi 280 nm&#39;de absorbans ölçümlerinden göre doğrudan protein miktar ile uyumlu değildir. Tekrarlanabilir ölçümü sağlamak için, tüm protein ekstrelerinin 17 için kolorimetrik tahlilleri kullanabilir. <ol><li> Niceleme. <ol><li> Seri uygun ekstraksiyon tamponu (yani, NaCl, SDS veya GuHCl) 17 içinde seyreltilmiş sığır serum albümini (BSA) kullanılarak bir kalibrasyon eğrisi için standartlar hazırlayın. Bu süre boyunca, örnek özler Çözülme. </li><li> içindeki konsantrasyonlarını elde etmek için ekstraksiyon tamponu örnekleri seyreltinabsorbans lineer aralığı; 1:10 seyreltisi (hacim: hacim) tatmin edici sonuçlar elde edilir. Kolorimetrik deney&gt; 4 M GuHCl konsantrasyonları ile uyumlu olmadığı için, GKD 2 miktarının belirlenmesi için O eşit miktarda GuHCl örnekleri seyreltin. </li><li> Bir bisinkoninik asit (BCA) kullanarak 96-yuvalı plakalar içinde deneyleri için, imalatçının talimatları izlenerek, kolorimetrik tahlil 17 (Malzemelerin Tablo) tabanlı; en azından yinelenen ölçümler yapmak için tavsiye edilir. </li><li> 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakıldıktan sonra, BSA standart kalibrasyon eğrisi 17 kullanılarak protein konsantrasyonu hesaplamak için 570 nm bir dalga boyunda emme ölçümleri alır. </li></ol></li><li> Protein Yağış <ol><li> Çözülme GuHCl oda sıcaklığında ayıklar. Kısım yeni borulara her bir numune için protein 10 ug. doğrudan bir glikopeptit analizi için, kısım 50 ug. etanol ve incu 10 kat hacim ekleyinkesmek gece boyunca -20 ° C&#39;de karıştırıldı. NOT: GuHCl ileri enzimatik reaksiyonlar ve en elektroforetik uygulamalarla uyumlu değildir. GuHCl çıkarılması deglikozilasyon ve tripsin sindirim önce gereklidir. Etanol içinde GuHCl ve çözünürlüğünün, proteinlerin düşük çözünürlüğü yaklaşık proteinleri 18% 98&#39;lik bir iyileşme elde edilir ise GuHCl etkili bir şekilde çıkarılması için izin verir. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüj örnekleri ve süpernatan aspire. çöktürülmüş pelet rahatsız etmemek için özen gösterin. Oda sıcaklığında bir vakum konsantre edici (Malzemelerin Tablo) kullanılarak 15 dakika boyunca pelet kurutulur. Not: Protokol burada durdurulabilir ve kurutuldu peletler kullanılana kadar -20 ° C&#39;de saklandı. </li><li> İsteğe bağlı olarak, (İlave Yöntemler, QC) kalite kontrolü gibi bir jel elektroforezi çalıştırın. </li></ol></li></ol> 3. Sıralı deglikosilasyonN-glikosilasyon Sitesi Kişiler Değerlendirilmesi <ol><li> Numune kurutulmuştur (adım 2.2.2 bakınız) sırasında, Tablo 1 &#39;deki gibi, deglikosilasyon debranşlı enzimler içeren deglikosilasyon tampon hazırlanması. Ürün detayları için Malzemelerin Tablo bakınız. </li><li> Her bir örnek için enzimler ihtiva eden deglikosilasyon tampon maddesi, 10 ul ekle. Hızlı bir girdap ve numunelerin Spin-down gerçekleştirerek uygun pelet tabanda sağlamak. Not: dallara ayrılmayı giderme enzimi kullanılarak şeker monomerlerinin çıkarılması O-bağlı kompleks sakkaritlerin sonraki ve tamamen uzaklaştırılması için gerekli olan ve PNGaz-F ile N-bağlı şekerlerin daha sonra bölünme kolaylaştırır. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar sıcaklıkta II.Increase heparinaz heparan sülfatın uzaklaştırılması için izin ve hafif çalkalama ile 36 saat boyunca inkübasyona 25 ° C&#39;de 2 saat süreyle inkübe edin. Not: düşük reaksiyon hacimleri ve uzun inkübasyon süreleri, kullanım kuluçka Shakers göz önüne alındığında ve sıkı bir şekilde birden fazla 1.5 mL küvet paketiyaklaşık 45 ° &#39;de inkübatör içinde dayanan bir 50 mL konik tüp içine es. </li><li> 36 saat sonra, 16,000 x g&#39;de 1 dakika için örnekleri santrifüj ve buharlaşması Yaklaşık 45 dakika boyunca oda sıcaklığında bir vakum konsantratör kullanılarak örneklerinden H2O. </li><li> 50 U / ml PNGaz F, ihtiva eden H, 2 18 O 10 uL ile kurutuldu örnekleri tekrar süspansiyon olarak bölen bir deamidasyon reaksiyonunun tüm asparajin bağlı glikanları. Not: Elde edilen aspartik asit MS analizi sırasında, N-glikosilasyon varlığının göstergesidir 2.98 Da&#39;lık bir fazla kütle, taşır. </li><li> kuluçka çalkalayıcı içinde sabit çalkalama altında 37 ° C&#39;de 36 saat inkübe edilir. </li></ol> 4. olarak çözeltisi tripsin Sindirim Not: Bu adım (her ikisi de-deglikosile (yani doğrudan glikopeptid analizi için kullanılan) ve deglikosile numuneler için gerçekleştirilmiştir olmalıdır, yani, glıkan oc değerlendirilmesi için kullanılancupancy). <ol><li> N-glikosilasyon sitesi doluluk değerlendirilmesinde (bir önceki aşamada gösterildiği gibi) için toplam proteinin 10 ug kullanın. Doğrudan glikopeptid analiz için tasarlanmıştır numuneler için, başlangıç ​​miktarı gibi proteinin 50 ug kullanılır. Not: Aşağıdaki adımları proteinin 10 ug tarif edilmiştir. Gerekli olan inci evolumes (yani, 5 kez 50 ug için) ölçeğinin. </li><li> Sırasıyla 6 M üre, 2 M tioüre, nihai konsantrasyonları ile, 9 M üre ve 3 M thiourea kullanılarak her numune tam bölünür üzerinde proteinleri denatüre (10 uL numunesi için, örneğin, üre / tiyoüre 20 uL). </li><li> 100 mM ditiotreitol (: 10 mM DTT, 3.33 uL, nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle proteinler azaltır. 240 rpm&#39;de çalkalanarak 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> (50 mM son konsantrasyon 3.7 uL,), 0.5 M iodoasetamid ekleyerek alkilasyonu gerçekleştirmeden önce oda sıcaklığına örnekleri soğutun. 1 saat boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> -20 (önceden soğutulmuş kullanın° C) aseton (örnek 6 kat hacim) 20 ° C&#39;de bir gece boyunca inkübe etmek örnekleri. 4 ° C&#39;de 25 dakika boyunca 14,000 x g&#39;de santrifüj ile hızlandırabilir. </li><li> Süpernatant aspire. çöktürülmüş pelet rahatsız etmemek için özen gösterin. Oda sıcaklığında 30 dakika için bir vakum konsantratör kullanılarak protein pelet kurutulur. </li><li> 0.1 M trietilamonyumbikarbonat (TEAB) tampon, pH 8.2, 20 uL içinde süspanse içeren tripsin (0.01 ug / ml) ve 37 ° C&#39;de ve 240 rpm&#39;de gece boyunca sindirimi. </li><li> (% 1 TFA bir son konsantrasyon için TFA, 2 uL),% 10 trifloroasetik asit ile örnekleri asitleştirilerek sindirim durdurun. </li></ol> C18 sütunlar kullanma 5. Peptid Temizleme Not: sindirim sonra peptid karışımı kirletici maddeleri müdahale çıkarılması iyon bastırma azaltır ve sinyal-gürültü oranları ve dizi kapsamı artırır. Bu aşama, hem sigara deglikosile ve deglikosile sa yapılmalıdırörnek olarak şunlar verilebilir. <ol><li> 1 dakika için 1000 x g&#39;de oyuk ve santrifüj başına metanol 200 uL kullanılarak C18 eğirme plakası üzerinde reçinesi (Malzemelerin Tablo) aktif hale getirin. </li><li> 1 dakika için 1000 x g&#39;de H2O Santrifüj içinde% 80 asetonitril (ACN) ve% 0.1 TFA, oyuk başına 200 uL eklenmesiyle yıkayın. </li><li> 1 dakika için 1000 x g&#39;de H2O Santrifüj içinde% 1 ACN ve% 0.1 TFA, oyuk başına 200 uL eklenmesiyle dengelenmesi. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 1 dakika için 1500 x g&#39;de reçine ve santrifüj içeren kuyu içine Aşama 4&#39;deki örnekleri (tüm hacim) yükleyin. akış yoluyla ikinci kez yükleyin ve santrifüjleme tekrarlanır. </li><li> 1 dakika için 1500 x g&#39;de H2O Santrifüj içinde% 1 ACN ve% 0.1 TFA, oyuk başına 200 uL eklenmesiyle yıkayın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 1 dakika için 1500 x g&#39;de H2O Santrifüj içerisinde% 50 ACN,% 0.1 TFA içerisinde oyuk başına 170 uL numune Zehir. önceki adımı tekrarlayınve toplanan elüatı birleştirir. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca vakumlu bir konsantratör kullanılarak eluatın kurutun. hemen kullanılan değilse, kullanıma kadar, -80 ° C de kurutulur örnekleri tutmak. Not: Protein belirlenmesi için tasarlanmıştır Deglikolize örnekler sadece bu aşamadan sonra, LC-MS / MS için kullanıma hazırdır. Adım 6 ve 7, bu örnekler için gerekli değildir. </li><li> Çözülme ve 0.5 ug / uL nihai bir protein konsantrasyonuna kadar H2O içinde% 2 ACN ve% 0.05 TFA içinde deglikosile örnekleri tekrar süspansiyon. olmayan deglikosile numunelerin doğrudan glikopeptid analizi Aşama 6 devam edin. </li><li> İsteğe bağlı olarak, önceden, tandem kütle etiketleri (TMT) ile etiketleme peptidler filtre; Peptid soma için ek Yöntemler. </li></ol> TMT 6. Etiketleme (doğrudan glikopeptit Analiz için sadece) <ol><li> Çözülme ve 1 ug / ml bir konsantrasyon elde etmek için, 50 mM TEAB 50 uL kurutulmuştur pelet tekrar süspansiyon. </li><li> Resusped TMT Sıfır 0.8-mg tüp ACN 41 uL tepkime maddesi (TMT 0, Malzemeler Tablo). yeniden süspanse edilmesi için üreticinin recommendantions izleyin. </li><li> (TMT 0 20,5 uL, peptidlerin, yani, 50 uL), 0.4 mg TMT 0 50 ug peptidlerin bir oranda peptid örnekleri etiketleyin. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bir oranda 6% 5 hidroksilamin ilave etiketleme reaksiyonu söndürün: 100 (% 5 hidroksilamin, yani, 4.23 uL). 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bir vakum konsantratör kullanılarak oda sıcaklığında 1 saat için TMT 0 -etiketli peptid örnekleri kurutun. GKD 2 O 10 uL içinde süspanse Not: nedeniyle glıkan kalıntılarına bağlı olarak, glikopeptidler glikosile peptidler daha yüksek bir moleküler kütleye gösterir. TMT 0 glikopeptitlerin şarj durumunu arttırır. Bu (m / z) oranı şarj etmek için nispi ağırlığını azaltır ve ETD parçalanma kolaylaştırır. </li></ol> 7. gLİKOPEPTİT Zenginleştirme <ol><li> Kiti (Malzemelerin Tabloya bakınız) sağlanan reaksiyon tampon kullanın. </li><li> Adım 6.5 her biri 10 uL numuneye bağlama tamponu 50 uL ekleyin. homojen hale gelinceye kadar glycocapture reçine çözeltisi karıştırın. 15 yakalama merkezli bir zwitteriyonik hidrofilik interaksiyon sıvı kromatografisi (Zici HILIC) kullanın. </li><li> Yeni 1.5 ml tüpler reçine süspansiyonu kısım 50 uL. 2.500 x g&#39;de 1 dakika için Spin ve supernatant çıkarın. Örnek 60 uL ekleyin (yani, bağlanma tampon maddesi ile numunesi) reçine peletleri içeren tüplere. bir pipet kullanılarak karıştırılır ve 1.200 rpm&#39;de çalkalama içinde 20 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> 2.000 x g&#39;de 2 dakika süre ile santrifüj ve yeni tüplere süpernatant aktarın. Tüpleri tutun. Reçine tüplerine yıkama tamponu 150 uL ekleyin. bir pipet kullanılarak karıştırılır ve 1.200 rpm&#39;de çalkalama içinde 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 2.500 x g&#39;de 2 dakika süre ile spin. transfer(Adım 7.4) aynı tüplere yüzer. Yıkama adımları iki kez tekrarlayın. </li><li> elüsyon tamponu 75 uL ekleyin ve bir pipet kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1200 rpm&#39;de karıştırın ve daha sonra 2,500 x g&#39;de 2 dakika süre ile tüpler santrifüj. Yeni 1.5 ml tüpler için süpernatanlar aktarın. Yıkama adımları tekrarlayın, sonra aynı tüp eluat süpernatant aktarın. </li><li> X g, 2,500 2 dakika boyunca eluatın (örneğin glikopeptidler) içeren tüpler santrifüjleyin. Önceki adımlardan kalan reçine kaldırılmasını sağlamak için yeni tüplere süpernatant aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında yaklaşık 2 saat boyunca vakumlu bir konsantratör kullanılarak sıyırma sıvısı, toplam 150 uL kurutun. GKD 2 O içinde% 2 ACN 15 uL ve% 0.05 TFA içinde kurutuldu aşağı glıkopeptıtlerı yeniden süspanse </li><li> glikopeptid karakterizasyonu için HCD ve ETD parçalanma kullanılarak ECM protein bileşimi analiz etmek için HCD parçalanma kullanılarak LC-MS / MS gerçekleştirmek için devam edilir ve LC-MS / MS. bölüm 8 bakınız. </li></ol&gt; 8. kütle spektrometri analizi <ol><li> ECM protein bileşimi analiz etmek için HCD parçalanma kullanılarak LC-MS / MS gerçekleştirir; Ayrıntılar için Ek Yöntemleri bkz. </li><li> (Daha fazla bilgi için ek Yöntemler) glikopeptid karakterizasyon için HCD ve ETD parçalanma kullanılarak LC-MS / MS gerçekleştirir; zenginleştirilmiş örnek olmayan zenginleştirilmiş giriş maddesinin 15 karşılaştırılmalıdır. Not: dolaylı glikopeptid analizi, doğrudan glikopeptid analizi ve veritabanı arama için LC-MS / MS yöntemleri ayrıntılı tanımları İletişim Yöntemleri verilmiştir. Kütle spektrometrisi kullanılarak ECM protein ve glıkan kompozisyonunu tanımlama ile ilgilenen araştırmacılar önceki yayınların 3, 11, 15 bakınız için teşvik edilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Porter, K. E., Turner, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts:+at+the+heart+of+myocardial+remodeling.">Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling.</a> Pharmacol. Ther. 123 (2), 255-278 (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+analysis+of+cardiac+extracellular+matrix+remodeling+in+a+porcine+model+of+ischemia/reperfusion+injury.">Proteomics analysis of cardiac extracellular matrix remodeling in a porcine model of ischemia/reperfusion injury.</a> Circulation. 125 (6), 789-802 (2012).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomics+reveals+decorin+peptides+with+anti-myostatin+activity+in+human+atrial+fibrillation.">Glycoproteomics reveals decorin peptides with anti-myostatin activity in human atrial fibrillation.</a> Circulation. 134 (11), 817-832 (2016).</li><li>Lynch, M., Barallobre-Barreiro, J., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+proteomics+in+metabolic+and+cardiovascular+diseases.">Vascular proteomics in metabolic and cardiovascular diseases.</a> J. Intern. Med. 280 (4), 325-338 (2016).</li><li>Varki, A., Lowe, J. B., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Roles+of+Glycans.">Biological Roles of Glycans.</a> Essentials of glycobiology. 2nd ed. , (2009).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., Lynch, M., Yin, X., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+-+opportunities+and+challenges:+The+application+of+proteomics+to+study+the+cardiovascular+extracellular+matrix.">Systems biology - opportunities and challenges: The application of proteomics to study the cardiovascular extracellular matrix.</a> Cardiovasc. Res. , (2016).</li><li>Agnetti, G., Husberg, C., Van Eyk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divide+and+conquer:+the+application+of+organelle+proteomics+to+heart+failure.">Divide and conquer: the application of organelle proteomics to heart failure.</a> Circ. Res. 108 (4), 512-526 (2011).</li><li>Mason, R. M., Mayes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+cartilage+protein-polysaccharides+with+inorganic+salt+solutions.">Extraction of cartilage protein-polysaccharides with inorganic salt solutions.</a> Biochem. J. 131 (13), 535-540 (1973).</li><li>Vogel, K. G., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+proteoglycans+from+tendon.">Isolation of proteoglycans from tendon.</a> Methods. Mol. Biol. 171, 9-17 (2001).</li><li>Wilson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+profiling+of+cartilage+extracellular+matrix+formation+and+maturation+using+sequential+extraction+and+label-free+quantitative+proteomics.">Comprehensive profiling of cartilage extracellular matrix formation and maturation using sequential extraction and label-free quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (6), 1296-1313 (2010).</li><li>Barallobre-Barreiro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+remodeling+in+response+to+venous+hypertension:+proteomics+of+human+varicose+veins.">Extracellular matrix remodeling in response to venous hypertension: proteomics of human varicose veins.</a> Cardiovasc. Res. 110 (3), 419-430 (2016).</li><li>Didangelos, A., Yin, X., Mandal, K., Baumert, M., Jahangiri, M., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+characterization+of+extracellular+space+components+in+the+human+aorta.">Proteomics characterization of extracellular space components in the human aorta.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9 (9), 2048-2062 (2010).</li><li>Didangelos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+composition+and+remodeling+in+human+abdominal+aortic+aneurysms:+a+proteomics+approach.">Extracellular matrix composition and remodeling in human abdominal aortic aneurysms: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Grandoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+biglycan+enhances+thrombin+generation+in+apolipoprotein+E-deficient+mice:+Implications+for+inflammation+and+atherosclerosis.">Loss of biglycan enhances thrombin generation in apolipoprotein E-deficient mice: Implications for inflammation and atherosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 36 (5), e41-e50 (2016).</li><li>Yin, X., Bern, M., Xing, Q., Ho, J., Viner, R., Mayr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoproteomic+analysis+of+the+secretome+of+human+endothelial+cells.">Glycoproteomic analysis of the secretome of human endothelial cells.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12 (4), 956-978 (2013).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+N-linked+glycoproteomics+of+myocardial+ischemia+and+reperfusion+injury+reveals+early+remodeling+in+the+extracellular+environment.">Quantitative N-linked glycoproteomics of myocardial ischemia and reperfusion injury reveals early remodeling in the extracellular environment.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10 (8), (2011).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Pepinsky, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+precipitation+of+proteins+from+guanidine+hydrochloride-containing+solutions+with+ethanol.">Selective precipitation of proteins from guanidine hydrochloride-containing solutions with ethanol.</a> Anal. Biochem. 195 (1), 177-181 (1991).</li><li>de Castro-Br&#225;s, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Texas+3-step+decellularization+protocol:+looking+at+the+cardiac+extracellular+matrix.">Texas 3-step decellularization protocol: looking at the cardiac extracellular matrix.</a> J. Proteomics. 86, 43-52 (2013).</li><li>Naba, A., Clauser, K. R., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+extracellular+matrix+proteins+from+tissues+and+digestion+into+peptides+for+mass+spectrometry+analysis.">Enrichment of extracellular matrix proteins from tissues and digestion into peptides for mass spectrometry analysis.</a> J Vis Exp. (101), e53057 (2015).</li><li>Decaris, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+altered+extracellular+matrix+turnover+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis.">Proteomic analysis of altered extracellular matrix turnover in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 13 (7), 1741-1752 (2014).</li><li>Zhang, H., Li, X. J., Martin, D. B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+quantification+of+N-linked+glycoproteins+using+hydrazide+chemistry,+stable+isotope+labeling+and+mass+spectrometry.">Identification and quantification of N-linked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry.</a> Nat. Biotechnol. 21 (6), 660-666 (2003).</li><li>Parker, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+glycan-peptide+analysis+for+determination+of+N-glycoproteome+heterogeneity.">Site-specific glycan-peptide analysis for determination of N-glycoproteome heterogeneity.</a> J. Proteome Res. 12 (12), 5791-5800 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+glycosylated+and+sialylated+prostate-specific+antigen+revealing+differential+distribution+of+glycosylated+prostate-specific+antigen+isoforms+in+prostate+cancer+tissues.">Simultaneous analysis of glycosylated and sialylated prostate-specific antigen revealing differential distribution of glycosylated prostate-specific antigen isoforms in prostate cancer tissues.</a> Anal. Chem. 83 (1), 240-245 (2011).</li><li>Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+extracellular+matrix:+an+ever-changing+and+diverse+entity.">Myocardial extracellular matrix: an ever-changing and diverse entity.</a> Circ. Res. 114 (5), 872-888 (2014).</li></ol>

Bu proteomik protokol laboratuvarımızda son birkaç yıldır optimize edilmiştir. Burada, kardiyak dokuyu kullanılır, ancak sadece küçük ayarlamalar diğer dokularda için uygulanması gerekli olabilir. Örneğin, ekstraksiyon protokolü dikkate doku selülarite atmalıdır. Kardiyak dokusu vasküler doku ile karşılaştırıldığında yüksek selüler bir. Vasküler doku kullanıldığında, SDS konsantrasyonu düşük (yani% 0.08) olabilir ve hücresizleştirme süresi daha kısa (yani 4 saat), 11, 12, 13&#39;tür. deglikosilasyon enzimlerin kullanımı ECM bileşimin LC-MS / MS analizi için çok önemlidir. Bununla birlikte, inkübasyon süreleri farklı doku türleri için ayarlanması gerekebilir. (Örneğin Agrîn, perlekan) (veriler gösterilmemiştir) bazal membran protein açısından zengin olan cilt gibi örnekleri kullanarak, örneğin, 25 ° C &#39;de II gerekir uzatılmış inkübasyon sürelerini heparinaz. Doğrudan glikopeptid analizi kültürde 15 hücrelerden şartlı ortamın üzerinde gerçekleştirilebilir. Zenginleştirme adımlar Bu basitleştirilmiş subproteome analizi için gerekli olmayabilir. GuHCl özler benzer şekilde, NaCI ekstreleri, küçük değişikliklerle Glycoproteomics analiz için uygundurlar. ECM proteinlerinin zenginleştirilmesi için diğer ekstraksiyon protokolleri ECM glikopeptitler 19, 20 tanımlamak için adapte edilebilir. Glikosilasyon en karmaşık PTM 5&#39;tir. Glikopeptid dolaylı tanımlanması NXT / S sequon de dahil 18 O ile deamidatlı Asn tespiti ile elde edilir. Diğer pozisyonlarda Deamide Asn yanlış pozitif temsil edebilir. Benzer bir şekilde, N-glikosilasyon proteini ontolojilerinin bağlamında dikkate alınması gerekir: bir NXT / S sequon ihtiva eden hücre-içi proteinler glikosile edilmeyecektir ancak yanlış pozitif sebebiyet verebilir. Geçerli Searc olarakh algoritmaları önceden belirlenmiş dizileri sadece (NXT / S yani Asn) en PTMS taranması için izin vermez, verilerin manuel filtreleme gereklidir. Bu pozisyonlarda glikosilasyon varlığı / yokluğu tespit edilmesi hastalık ve kontrol numuneleri arasındaki karşılaştırılabilir. (Treonin veya serin ile bir kütle kayma sokulması örneğin) O-Deglikosilasyondan için PNGaz F enzimsiz eşdeğer bulunmaktadır. Bu nedenle, O-glikosilasyon tanıma doğrudan glikopeptid analizi ile sınırlandırılmıştır. Doğrudan glikopeptid analiz proteinlere bağlı şekerlerin bileşim bilgileri elde etmek için kullanılan, fakat glikan yapısal bilgi sağlamaz. Ayrıca, glıkan bir bileşim salgılanmasından sonra glıkan sentezi ve işlenmesi bir sonucudur. ECM proteinleri için 3 aşamalı çıkarma yöntemi ( &quot;İngilizce Quickstep&quot;) 6 kardiyovasküler dokularda çeşitli ECM karakterize izin verdi. doku FraksiyonuBaşka bir yerde 6 ele alındığı gibi çeşitli özler içerisine basit bir ECM Proteomun elde etmek için gereklidir. Hücre içi proteinleri başka şekilde daha az bol ECM proteinlerinin tanımlanmasına engel olacaktır özler içinde protein bolluğu aşırı dinamik aralığına katkıda bulunacaktır. Ayrıca, hücre içi protein, ECM glikopeptid zenginleştirme ve daha sonra MS analizleri karmaşık hale getireceği O-glikosilasyonları 5 taşır. Diğer yazarlar, ancak bunlar glikosilasyon analiz takip etmedi, örneğin akciğer 21 ve kıkırdak dokunun 10 karakterize etmek için benzer ekstraksiyon yöntemleri uygulanır. Glikosilasyon Önceki analizi, sadece glycosites belirlenmesi üzerinde yoğunlaşmıştır protein çekirdekten glıkan çıkarılmasını gerektirebilir, ve O-glikosilasyon 22, 23 değerlendirmek değildir. Lektin diziler ve kimyasal zenginleştirme glikan typ değerlendirilmesi için kullanılabilirBiyolojik numuneler üzerinde es kendi bağlanma özgünlükleri dayalı, ancak bu teknikler belirli proteinlerin 24 glikan türlerini atanamıyor ne de glikozilasyon yerleri değerlendirebilir. Başlangıçta, önceden ECM proteinlerinin LC-MS / MS, jel elektroforezi kullanılmıştır. Eğer jel ayrılması LC-MS / MS analizi için uygun basitleştirilmiş protein fraksiyonları elde faydalı olsa da, son alet hızlı tarama hızları vardır. Bu nedenle, elektroforetik ayırma aşaması atlanabilir. jel üstünde tutulan büyük ECM proteinleri, daha verimli bir şekilde analiz edilmiştir gibi bu ilave bir avantaj da sağlar. Ancak, bozulmamış proteinlerin Mw ilgili bilgileri kaybolur. PNGaz F Deglikosilasyondan önce buharlaştırma adımı yanlış negatifler en aza indirmek için normal H2 O tamamen kaldırılmasını sağlar. Şeker kalıntısı (yani, değişken glıkan kütleleri) LC ile ayırma müdahale ve MS / MS ile takip eden peptid kimlik bozar. pbir-deglikosilasyon protokolü, glikozilasyon odaklanmamış ECM proteinlerinin proteomik analizi için tavsiye edilir. Proteomiks ECM içine görülmemiş bilgiler sağlayabilir. Yapısal destek ötesinde, ECM bağlı glikanlar konukçu-patojen etkileşimi, hücre-hücre iletişimine ve immün yanıt 25, organ naklinden sonra, yani allograft reddi için esastır. Glycoproteomics glikobiyolojide önemli bir araç olacaktır.

Fibrozis birçok hastalığın bir özelliğidir. Fibroblastlar çoğalır ve hücre dışı matrisi (ECM) 1 artmaktadır, sekresyon ve birikmesi ile bağlantılı olan yüksek sentetik fenotipleri doğru farklılık göstermektedir. Aşırı ECM çökeltme işlevsel bozukluklara neden ilk yaralanma kaybolana sonra bile devam edebilir. Kullanma proteomik, daha önce 150&#39;den ECM tanımlamışlardır ve kardiyak doku 2, 3 proteinleri ECM ile ilişkili. Bunlar, sürekli yeniden modellenmesi ve kalp dinamik uyum katkı sadece yapısal proteinler, aynı zamanda matricellular proteinleri ve proteazlardır. Özellikle, bir çok ECM proteinleri 4 glikosile olmaktadır. Bu post-translasyonel modifikasyon (PTM) bazı amino asit pozisyonlarına şeker kalıntılarının eklenmesini içerir ve bağlayıcı, protein katlanmasını, çözünürlüğünü etkiler ve bozunma 5 </s&gt; Yukarı. memelilerde meydana iki ana glikosilasyon türü vardır. (1) N-glikosilasyon Xaa, prolin hariç herhangi bir amino asittir konsensüs dizisi, Asn-Xaa-Thr / Ser, içindeki asparagin kalıntılarının (Asn) arasında karboksamido, nitrojen meydana gelir. (2) O-glikosilasyon olarak, şeker artıkları hidroksiproline ve hidroksilisin için, çok daha az ölçüde serin ve treonin kökleri (Ser, Thr) ya da, ekleyin. O-glikosilasyon proteini çeşitli gruplar ortaya çıkarabilirler, N-glikosilasyon salgılanan proteinler veya zar proteinleri 5 hücre dışı alan ile sınırlandırılmıştır. ECM okuyan bu N-glikosilasyon çekici bir hedef yapar. Proteomiks hastalığında protein değişikliklerinin analizi için yeni bir standart ayarlar. Bu zamana kadar en proteomik çalışmalar, hücre içi proteinlerin 6 üzerinde yoğunlaşmış bulunmaktadır. Bu, aşağıdaki nedenlerden kaynaklanmaktadır. İlk olarak, çok hücre içi proteinlerdir IDENTI engelkıt ECM bileşenlerinin Zehirsizleştirilmesi. Bu mitokondriyal ve Myofilament proteinler protein içeriğinin 7&#39;nin büyük bir bölümünü oluşturmaktadır ki burada kalp dokusunda, özellikle önemlidir. İkinci olarak, yekpare ECM proteinleri büyük ölçüde çapraz bağlı ve çözündürülmesi zordur. Son olarak, bol PTMS (örneğin glikozilasyon) varlığı ayırma ve sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) ile kimlik etkileyecek, moleküler kütle, yükü ve peptidlerin elektroforetik özelliklerini değiştirir. Son yıllarda, geliştirdik ve daha sonraki kütle spektrometrisi (MS) analizi ile uyumlu ECM proteinleri için ardışık çıkarma ve zenginleştirme yöntemini sunmaktır. strateji olarak inkübasyonlarla dayanır. İlk adım, NaCl, ECM ile ilişkili ve gevşek bağlı ECM proteinlerinin çıkarma, hem de yeni sentezlenmiş ECM proteinlerini kolaylaştıran bir iyonik tampon ile gerçekleştirilir. Bu idaha fazla biyokimyasal tahlillerde 8 hücre membranlarının bozucu olmayan şekilde ve müsait s deterjan içermeyen, denatüre edici olmayan,. Daha sonra, hücresizleştirme sodyum dodesil sülfat (SDS) ile elde edilir. Bu adımda, düşük SDS konsantrasyonu zar destabilizasyonunu ve daha çözünür entegre olmayan ECM bileşenlerinin bozulmasını önlemek iken, hücre içi proteinlerin salgılanmasını sağlar. Son olarak, ECM proteinleri bir guanidin hidroklorür tamponu (GuHCl) ile ekstre edilmiştir. GuHCl tendon 9, kıkırdak 10, damar 11, 12, 13 ve kalp 2, 3 gibi dokulardan yoğun çapraz bağlı proteinler ve proteoglikanlar ayıklanması etkilidir. Biz kardiyovasküler hastalık 2&#39;de ECM yenileme keşfetmek için LC-MS / MS ile birlikte, bu biyokimyasal ayrımlaştığını uygulanan <sup&gt;, 3, 11, 12, 13, 14. MS son gelişmeler intakt glikopeptidler 3, 15 doğrudan analizi için izin yüksek enerjili çarpışma ayrışma (HCD) ve elektron aktarım ayrışma (ETD) kombinasyonları gibi yeni parçalanma yöntemler bulunur. Burada protein bileşimi, glikosilasyon mevkilerini belirlenmesine ve glıkan formları karakterizasyonu analiz sağlar MS analizi için ECM&#39;nin hazırlanması için bir yöntem tarif eder. ECM, glikosilasyon 16 önceki analizler ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, MS kullanılarak bir site-spesifik bir şekilde glikosilasyon profillerinde bileşik değişikliklerinin doğrudan değerlendirilmesi için izin verir. Biz kardiyovasküler dokulara bu yöntemi uyguladık. Bununla birlikte, mümkün arkböylece diğer doku örneklerinde ECM&#39;nin çalışma, minör modifikasyonlarla uygulanabilir ECM biyolojisi benzeri bilgiler sağlayabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;A. Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, MS-grade&amp;nbsp;(ACN, C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;N)</td><td>Thermo Scientific</td><td>51101</td><td>5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Cocktail of proteinase inhibitors</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>1.3,&amp;nbsp; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Disodium phosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Dithiotreitol (DTT, C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>4.3</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, C&lt;sub&gt;10&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;16&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>1.3,&amp;nbsp; 1.4.1, 1.5.1, 1.6.1</td></tr><tr><td>Ethanol (C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;O)</td><td>VWR</td><td>437433T</td><td>2.2.1</td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride (GuHCl, CH&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3272</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Glycerol (C&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros organics</td><td>158920025</td><td>Suppl 1.1</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O LC-MS Cromasolv</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39253-1L-R</td><td>Throughout the protocol</td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;O</td><td>Taiyo Nippon Sanso</td><td>FO3-0027</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HA, H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;NO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td>6.4</td></tr><tr><td>Iodoacetamide (IAA, C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;INO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3221</td><td>4.4</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS), 10x</td><td>Lonza</td><td>51226</td><td>1.3</td></tr><tr><td>Sodium acetate (C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;NaO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7545</td><td>1.6.1</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>1.4.1, 3.2</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS, NaC&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;25&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466143</td><td>1.5.1</td></tr><tr><td>Triethylammonium bicarbonate (TEAB, C&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;17&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11268</td><td>4.7, 6.1</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA, C&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HF&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T62200</td><td>4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3</td></tr><tr><td>Thiourea (CH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8656</td><td>4.2</td></tr><tr><td>Tris-hydrochloride (Tris-HCl, NH&lt;sub&gt;11&lt;/sub&gt;C&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;[HCl])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>1.4.1, Suppl 1.</td></tr><tr><td>Urea (CH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>4.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;B. Enzymes&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;2-3,6,8,9-Neuraminidase (Sialidase)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0012)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&amp;beta;1,4-Galactosidase</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0004)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>&amp;beta;-N-Acetylglucosaminidase</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0013)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Chondroitinase ABC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3667</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Endo-&amp;alpha;-N-acetylgalactosaminidase (O-glycosidase)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0011)</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Heparinase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6512</td><td>3.1</td></tr><tr><td>Keratanase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6920</td><td>3.1</td></tr><tr><td>PNGase-F (N-Glycosidase F)</td><td>EDM Millipore</td><td>362280 (KP0001)</td><td>3.5</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Scientific</td><td>90057</td><td>4.7</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;C. Reagent kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO spin filters&amp;nbsp;</td><td>Amicon, Millipore</td><td>10256744</td><td>5.9, Suppl 2</td></tr><tr><td>Macro SpinColumn C-18, 96-Well Plate</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5657</td><td>5.1</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels</td><td>Thermo-Scientific</td><td>NP0322PK2</td><td>Suppl 1</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>2.1.3</td></tr><tr><td>ProteoExtract Glycopeptide Enrichment Kit</td><td>Merk Millipore</td><td>72103</td><td>7</td></tr><tr><td>Tandem mass tag 0 (TMT&lt;sup&gt;0&lt;/sup&gt;)</td><td>Thermo Scientific</td><td>900067</td><td>6.2, 6.3</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;D. Equipment and software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acclaim PepMap100 C18 Trap, 5 mm x 300 &amp;micro;m, 5 &amp;micro;m, 100 &amp;Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>160454</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 &amp;micro;m, 3 &amp;micro;m, 100 &amp;Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>164570</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Byonic Search Engine</td><td>Protein Metrics</td><td>Version 2.9.30</td><td>Suppl 5</td></tr><tr><td>Dionex UltiMate 3000 RSLCnano</td><td>Thermo Scientific</td><td>n/a</td><td>Suppl 3, 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray Ion Source&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES081</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>EASY-Spray PepMap RSLC C18,&amp;nbsp; 50 cm x 75 &amp;micro;m, 2 &amp;mu;m, 100 &amp;Aring;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ES803</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Mascot Search Engine</td><td>Matrix Science</td><td>Version 2.3.01</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Suppl 4</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer Software</td><td>Thermo Scientific</td><td>Version 2.1.1.21</td><td>Suppl 3, 5</td></tr><tr><td>Picoview Nanospray Source</td><td>New Objective</td><td>550</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBFZ</td><td>Suppl 3</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11</td></tr><tr><td>Scaffold Software</td><td>Proteome Software&amp;nbsp;</td><td>Version 4.3.2</td><td>Suppl 3</td></tr></tbody></table>

glycoproteomics of the extracellular matrix: a method for intact glycopeptide analysis using mass spectrometry

Fibroz birçok kardiyovasküler hastalık bir özelliğidir ve hücre dışı matrisi (ECM) şiddetli bir sekresyon ve birikimi ile bağlantılıdır. Kullanma proteomik, daha önce 150&#39;den ECM belirledik ve kardiyovasküler dokularda protein ECM ile ilişkili. Özellikle, bir çok ECM proteinler glikosillenmiş. Bu post-translasyonel modifikasyon, protein katlanması, çözünürlük, bağlanması ve bozulmasını etkiler. Biz daha sonra sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi sağlam glıkopeptıtlerın (LC-MS / MS) analizi ile uyumlu ECM proteinleri için ardışık çıkarma ve zenginleştirme bir yöntem geliştirdik. strateji ECM proteinlerinin çözünürleştirilmesi için doku hücresizleştirme ve guanidin hidroklorid NaCl, SDS ile sıralı inkubasyon dayanır. LC-MS / MS son gelişmeler bu olanak yüksek enerjili çarpışma ayrışma kombinasyonları (HCD) ve elektron aktarım ayrışma (ETD) gibi parçalanma yöntemler bulunurECM proteinlerinin glıkopeptıtlerın doğrudan kompozisyon analizi. Mevcut yazıda, doku örneklerinden ECM&#39;nin hazırlanması için bir yöntem tarif eder. yöntem, protein profili, aynı zamanda, MS analizi ile değerlendirme ve glikosilasyon karakterize edilmesine imkan verir, sadece.

Protokol şematik bir iş akışı, Şekil 1 &#39;de sağlanmıştır. ECM, ekstraksiyon protokolü ekstraksiyon etkinliği alikoları Bis-Tris akrilamid jelleri üzerinde her ekstratının oluşturulması çalışan ve görselleştirme için gümüş boyama kullanılarak izlenebilir. Şekil 2A, NaCI, SDS tamamlayıcılığı göstermektedir GuHCl sıralı özütleme sonrasında ayıklar. Bu QC örneğin aşırı protein yıkımı numunenin kalitesine sahip olası sorunların tanımlanması için gereklidir. Ekstraksiyon işleminden sonra, ECM glikoproteinler GuHCl ekstreleri (Şekil 2B) bol miktarda bulunmaktadır. deglikozilasyon deglikozilasyondan verimliliğini değerlendirmek için, olmayan bir deglikosillenmiş kontrol pa içinde çalıştırılmalıdırrallel. Deglikosilasyon kez Şekil 3A&#39;da örneklendiği gibi, şeker kalıntılarının tam ve homojen bir kaldırma ulaşmak için uygun olması gerekmektedir. Şekil 3B, etkin bir şekilde daha küçük bir N- ve O-bağlı oligosakkaritlerin hedef GAG çıkarma ve deglikosilasyon enzimleri için enzim ilave edilerek, deglikosile numune temsili bir örneğini göstermektedir. Glycoproteomics NXT / S sequons doluluk değerlendirilmesi için protokol, MS (Şekil 3C) sonra, ECM glikoproteinler için protein sekansı kapsamı artırır ve glikoproteinlerin varlığının bir başlangıç tarama sağlar. veritabanları önceden belirlenen glikoproteinler içerecek şekilde özelleştirilebilir gibi bu glikopeptidler için arama süresini azaltmak için yardımcı olur. HCD-ETD parçalanma ECM g bağlı oligosakaritlerin tanımlanması ve kompozisyon karakterizasyon için kullanılır<html> lycoproteins. Şekil 4A, deglikosilasyon (dolaylı glikopeptid analizi) sonra 18 O ile etiketlenmiş bir peptit için elde edilen temsili bir spektrumunu gösterir. Şekil 4B, ECM ekstrelerinden sağlam glikopeptidler (doğrudan glikopeptid analizi) analizinden sonra elde edilen bir spektrumunu temsil eden bir örnektir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55674/55674fig1.jpg" /> Şekil 1: Yöntem genel bir bakış. (A), ECM proteinleri için sıralı zenginleştirme işlemlerinden sonra, LC-MS / MS analizleri deglikosile özleri üzerinde gerçekleştirilir. (B) Buna alternatif olarak, sigara deglikosillenmiş ECM ekstraktlar daha glikopeptidler için zenginleştirilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55674 / 55674fig2.jpg&quot; /&gt; Şekil 2: ECM proteinlerinin çıkarımı. (A), sıralı özütleme prosedürü ( &quot;İngilizce Quickstep&quot;) 3 farklı ekstreler protein içeriğinde tamamlayıcıdır. SDS ayrıkları hücre içi proteinleri açısından oldukça zenginleşmiş iken, GuHCl ekstreler ECM proteinlerinin çoğunluğu ihtiva etmektedir. Başarılı fraksiyonasyon farklı gümüş boyama paterni ile görüntülenir. (B), ECM proteinleri, küçük lösin açısından zengin proteoglikanlar dekorin, biglikan ve mimecan ağırlıklı olarak, SDS ve NaCl ekstrelerinde küçük varlığı ile, GuHCl özütlerinde görülmüştür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55674/55674fig3.jpg" /> Şekil 3. glisin Analiziosylation. (A), uygun inkübasyon süreleri tamamen Deglikosilasyondan için gereklidir. Örnek glikoprotein dekorin gelen glikozaminoglikan zincirleri çıkarılması sırasında inkübasyon süresi etkisini göstermektedir. (B), ECM glikoproteinler büyük ve glikozaminoglikan tekrarlanan zincir ve kısa ve çeşitli N- ve O-bağlı oligosakkaritlerin süslenmiştir. imüno her biri üzerinde Şerit 1 tedavi edilmemiş kalp özler temsil eder. Şerit 2 glikozaminoglikanların sindirmek enzimleri ile muamele özler ihtiva etmektedir. şerit 3 numuneler ek olarak, N- ve O-bağlı oligossacharides çıkarılması için enzimleri içerir. Galektin-1 böylece protein boyutunda bir kayma olduğunu, glikosile değildir. Lynch M, ve diğ uyarlanmıştır. H2 18 O mevcudiyetinde PNGaz F ile muamele edilmiş 4 (C) &#39;de, LC-MS / MS analizi, örnekler olmayan deglikosile numunelerine kıyasla (sağ tarafta%) daha iyi bir dizi kapsam temin edebilir. DArk yeşil alan LC-MS / MS ile sekans kapsama temsil eder. Kırmızı, noktalı çizgiler, amino asit konumunu gösteren numaraları ile, glycosites temsil eder. Pozisyonda dekorin glikosilasyon Algılama 211, Asn (N, kalın olarak gösterilmiştir), Şekil 4&#39;te, örnek olarak ayrıntılı olarak gösterilmiştir <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig3large.jpg" target="_blank">, bu şekil büyük halini görüntülemek için tıklayın.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55674/55674fig4.jpg" /> Şekil 4. MS ile glikopeptit analizi. (A), ECM zenginleştirilmiş ekstrelerin bir av tüfeği proteomik yaklaşımı kullanarak, glikopeptidler NXT / S sequons içinde deamidatlı asparajinlere mevcudiyeti ile tanımlanır ve 18 O ile etiketlenebilir örneğin içeren dekorin bir peptit için bir HCD MS / MS spektrumunu gösterir Daha önce Asn 211 glikosillenir. Elde edilen veriler kullanılabilirECM glikoproteinlerinin özelleştirilmiş veritabanı oluşturmak için. (B) HCD-ETD parçalanma glikopeptid zenginleştirilmiş ECM özü analiz etmek için kullanılır. ETD MS / MS spektrumudur glıkan bileşimin karakterizasyonu sağlar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55674/55674fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> A. stok çözeltileri </td><td></td></tr><tr><td> DTT (Ditiyotreitol, Cı-4H 10 O 2S 2) </td><td> GKD 2 100 mM DTT O. 1 </td></tr><tr><td> EDTA (Etilendiamintetraasetik asit, C 10 H 16 N2 O 8) </td><td> 250 GKD 2, O, pH 8.0 mM EDTA. </td></tr><tr><td> GuHCl (Guanidin hidroklorid, CH 6 ClN 3) </td><td> 8 M GuHClGKD 2 O </td></tr><tr><td> IAA (Iyodoasetamid C2 H4 INO) </td><td> GKD 2 O 1,2 500 mM IAA </td></tr><tr><td> Na asetat (sodyum asetat, C2-H3 NaO 2) </td><td> GKD 2, O, pH 5.8 içinde 1 M Na-asetat. </td></tr><tr><td> NaCI (sodyum klorür, NaCl) </td><td> GKD 2 O. içinde 1 M NaCI </td></tr><tr><td> Na fosfat dibazik (disodyum fosfat, Na 2H 2PO 4) </td><td> Dd, H2O, pH 6.8 içinde 1 M Na-fosfat dibazik. </td></tr><tr><td> SDS (sodyum dodesil sülfat, NaCl 12H 25 SO 4) </td><td> GKD 2 O 3% 1 SDS (35 mM) </td></tr><tr><td> TFA (trifloroasetik asit, C2H F3 O 2) </td><td> % 10 GKD 2 O TFA (1.2 M) </td></tr><tr><td> TEAB (Trietilamonyum bikarbonat, Cı-7H 17 </alt&gt; NO 3) </td><td> ddH2O, pH 8.5 içinde 1 M TEAB </td></tr><tr><td> Tioüre (Tiyoüre, CH4, N 2S) </td><td> GKD 2 O. içinde 3 M tiyoüre </td></tr><tr><td> Tris-HCI (Tris-hidroklorür (NH 11C 4 O 3 [HCI]) </td><td> 100 GKD 2, O, pH 7.5 içinde mM Tris-HCI. </td></tr><tr><td> Üre (Üre, CH4 N2 O) </td><td> GKD 2 O. 9 M üre </td></tr><tr><td> B. Reaksiyon tamponlar </td><td></td></tr><tr><td> C18 temizlik dengeleme tamponu </td><td> % 1 ACN,% 0.1 TFA GKD 2 O </td></tr><tr><td> C18 temizleme kolonu yıkama tamponu </td><td> H2O içinde% 80 ACN,% 0.1 TFA </td></tr><tr><td> C18 temizlik elüsyon tamponu </td><td> GKD 2 O içinde% 50 asetonitril,% 0.1 TFA </td></tr><tr><td> Deglikosilasyon tampon (4x) </td><td> 600 mM NaCI ve GKD 2, O, pH 6.8&#39;de 200 mM Na fosfat. </td></tr><tr><td> GuHCl tamponu 4 </td><td> 4 M guanidin hidroklorür, 50 mM Na-asetat ve GKD 2, O, pH 5.8, 25 mM EDTA. 100 (v: v) ekleme 1 proteinaz inhibitörü kokteyl kullanımından önce. </td></tr><tr><td> NaCI tamponu 4 </td><td> 0.5 M NaCI, 10 mM Tris-HCI ve GKD 2 O, 25 mM EDTA, pH 7.5 olarak değişmiştir. 100 (v: v) ekleme 1 proteinaz inhibitörü kokteyl kullanımından önce. </td></tr><tr><td> PBS (1 x) </td><td> 1.7 mM KH2 PO 4, 5 mM Na2 HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7.4 ile yıkanmıştır. 25 mM EDTA ve 1 ekleyin: 100 (hacim: hacim) proteinaz inhibitörleri kokteylinin kullanımından önce. </td></tr><tr><td> Numune tamponu (4x) </td><td> 100 mM Tris,% 2 SDS, GKD 2, O, pH 6.8 içinde% 40 Gliserol,% 0.02 bromofenol mavisi. Kullanmadan önce% 10 ß-merkaptoetanol ekleyin. </td></tr><tr><td> SDS tamponu 4 </td><td> 100:% 0.1 SDS ve GKD 2, 25 mM EDTA, O 1 ekleyin (hacim: hacim) proteinaz inhibitörleri kokteylinin bef arasındacevher kullanımı. </td></tr><tr><td> C. Enzimler </td><td></td></tr><tr><td> Kondroitinaz ABC 5 </td><td> 0.5 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> keratanaz 5 </td><td> 0.1 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> Heparinaz II 5 </td><td> 0.1 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> α2-3,6,8,9-Nöraminidaz (sialidaz) 5 </td><td> 0.025 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> β1,4-Galaktosidaz 5 </td><td> 0.015 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> p-N-Asetilglukosaminidaz 5 </td><td> 0.25 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> Endo-α-N-asetilgalakto (O-glikosidaz) 5 </td><td> 0.013 U deglikosilasyon tampon maddesi içinde / ml (1 kez) </td></tr><tr><td> PNGaz F (N-glikosidaz F) 6 </td><td> 5H 0 U / mL 2 18 O </td></tr><tr><td> Tripsin </td><td> TEAB tamponu içinde 0.01 ug / ml </td></tr><tr><td> Tablo NOTLAR. </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 1. -20 ° C&#39;de dondurulmuş stok çözeltisi tutun. </td></tr><tr><td colspan="2"> 2 IAA ışıktan korunmalıdır tutulmalıdır. </td></tr><tr><td colspan="2"> 3, SDS kolaylıkla &lt;20 ° C &#39;de kristalize olur. % 1 SDS (stok çözelti) çözünmesini kolaylaştırmak amacıyla, sıcak musluk suyu altında tampon ısıtın. </td></tr><tr><td colspan="2"> 4 Ekstraksiyon tampon oda sıcaklığında saklanabilir. kullanımdan önce belirtildiği gibi proteinaz inhibitörlerinin geniş spektrumlu kokteyl ekleyin. </td></tr><tr><td colspan="2"> 5 Bu enzimler, birinci deglikosilasyon aşaması sırasında ilave edilmelidir. </td></tr><tr><td colspan="2"> 6 PNGaz F sadece ikinci deglikosilasyon aşaması sırasında ilave edilmelidir. </td&gt; </tr></tbody></table> Tablo 1: Stok Çözümleri Reaksiyon Tamponlar ve Enzimler. Bu tablo, MS analizi öncesinde kardiyak ECM proteinlerinin ekstraksiyon ve (enzimatik sindirim dahil) sonraki işlem için gerekli olan her bir stok çözeltisi ve reaksiyon tamponu bileşimi listeler.

Watch this Scientific Journal Video about Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry at JoVE.com

Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM&#39;nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir.

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Fibrosis is a hallmark of many cardiovascular diseases and is associated with the exacerbated secretion and deposition of the extracellular matrix (ECM). ...

glycoproteomics-extracellular-matrix-method-for-intact-glycopeptide

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Extracellular Matrix in Animals

SCIENTISTS IN ACTION

12.2K Görüntüleme.  King's College London.  Bu kağıt, ECM protein bileşiminin (1) analizi, glikozilasyon yerleri (2) tespit edilmesi ve glıkan formlarının (3) yapısal karakterizasyon için sağlar, MS analizi için kardiyovasküler doku örnekleri hazırlamak için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu metodoloji, diğer dokularda ECM'nin çalışma, minör modifikasyonlarla, uygulanabilir. 

Video: Glycoproteomics of the Extracellular Matrix: A Method for Intact Glycopeptide Analysis Using Mass Spectrometry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass determination allows one to evaluate the correctness of protein primary sequences, the presence of mutations and/or post-translational modifications, the possible protein degradation, the sample homogeneity, and the degree of isotope incorporation in case of labelling (e.g. 13C labelling).
Electrospray ionization (ESI) mass spectrometry (MS) is widely used for mass determination of denatured proteins, but its efficiency is affected by the composition of the sample buffer. In particular, the presence of salts, detergents, and contaminants severely undermines the effectiveness of protein analysis by ESI-MS. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is an attractive alternative, due to its salt tolerance and the simplicity of data acquisition and interpretation. Moreover, the mass determination of large heterogeneous proteins (bigger than 100 kDa) is easier by MALDI-MS due to the absence of overlapping high charge state distributions which are present in ESI spectra.
Here we present an accessible approach for analyzing proteins larger than 100 kDa by MALDI-time of flight (TOF). We illustrate the advantages of using a mixture of two matrices (i.e. 2,5-dihydroxybenzoic acid and &#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid) and the utility of the thin layer method as approach for sample deposition. We also discuss the critical role of the matrix and solvent purity, of the standards used for calibration, of the laser energy, and of the acquisition time. Overall, we provide information necessary to a novice for analyzing intact proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Accurate mass measurement represents an important step during the investigation of proteins. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) can be used for such determination and its key advantage is the tolerance to salts, detergents and contaminants. Here we illustrate an accessible approach for the analysis of proteins larger than 100 kDa by MALDI-MS.

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

Kimya

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and extracellular events. Many pathological conditions, notably cancer, affect gene expression, which can in turn deregulate the relative abundance and activity levels of glycoside hydrolase and glycosyltransferase enzymes. Unique aberrant whole glycans resulting from deregulated glycosyltransferase(s) are often present in trace quantities within complex biofluids, making their detection difficult and sometimes stochastic. However, with proper sample preparation, one of the oldest forms of mass spectrometry (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) can routinely detect the collection of branch-point and linkage-specific monosaccharides ("glycan nodes") present in complex biofluids. Complementary to traditional top-down glycomics techniques, the approach discussed herein involves the collection and condensation of each constituent glycan node in a sample into a single independent analytical signal, which provides detailed structural and quantitative information about changes to the glycome as a whole and reveals potentially deregulated glycosyltransferases. Improvements to the permethylation and subsequent liquid/liquid extraction stages provided herein enhance reproducibility and overall yield by facilitating minimal exposure of permethylated glycans to alkaline aqueous conditions. Modifications to the acetylation stage further increase the extent of reaction and overall yield. Despite their reproducibility, the overall yields of N-acetylhexosamine (HexNAc) partially permethylated alditol acetates (PMAAs) are shown to be inherently lower than their expected theoretical value relative to hexose PMAAs. Calculating the ratio of the area under the extracted ion chromatogram (XIC) for each individual hexose PMAA (or HexNAc PMAA) to the sum of such XIC areas for all hexoses (or HexNAcs) provides a new normalization method that facilitates relative quantification of individual glycan nodes in a sample. Although presently constrained in terms of its absolute limits of detection, this method expedites the analysis of clinical biofluids and shows considerable promise as a complementary approach to traditional top-down glycomics.

This article presents an enhanced form of a novel bottom-up glycomics technique designed to analyze the pooled compositional profile of glycans in unfractionated biofluids through the chemical breakdown of glycans into their constituent linkage-specific monosaccharides for detection by GC-MS. Potential applications include early detection of cancer and other glycan-affective disorders.

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Synthesized in a non-template-driven process by enzymes called glycosyltransferases, glycans are key players in various significant intra- and ...

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Biyokimya

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal infectivity of pathogenic species. Due to this, there is increasing interest in characterizing bacterial glycosylation and a need for high-throughput analytical tools to identify these events. Although bottom-up proteomics readily enables the generation of rich glycopeptide data, the breadth and diversity of glycans observed in prokaryotic species make the identification of bacterial glycosylation events extremely challenging.
Traditionally, the manual determination of glycan compositions within bacterial proteomic datasets made this a largely bespoke analysis restricted to field-specific experts. Recently, open searching-based approaches have emerged as a powerful alternative for the identification of unknown modifications. By analyzing the frequency of unique modifications observed on peptide sequences, open searching techniques allow the identification of common glycans attached to peptides within complex samples. This article presents a streamlined workflow for the interpretation and analysis of glycoproteomic data, demonstrating how open searching techniques can be used to identify bacterial glycopeptides without prior knowledge of the glycan compositions.
Using this approach, glycopeptides within samples can rapidly be identified to understand glycosylation differences. Using Acinetobacter baumannii as a model, these approaches enable the comparison of glycan compositions between strains and the identification of novel glycoproteins. Taken together, this work demonstrates the versatility of open database-searching techniques for the identification of bacterial glycosylation, making the characterization of these highly diverse glycoproteomes easier than ever before.

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

Open searching enables the identification of glycopeptides decorated with previously unknown glycan compositions. Within this article, a streamlined approach for undertaking open searching and subsequent glycan-focused glycopeptide searches are presented for bacterial samples using Acinetobacter baumannii as a model.

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological matrices is often necessary due to their low stoichiometry in comparison to non-modified analytes. Most enrichment workflows of PTMs on peptides in bottom-up proteomics workflows, where proteins are enzymatically digested before the resulting peptides are analyzed, only enrich one type of modification. It is the entire complement of PTMs, however, that leads to biological functions, and enrichment of a single type of PTM may miss such crosstalk of PTMs. PTM crosstalk has been observed between protein glycosylation and phosphorylation, the two most common PTMs in human proteins and also the two most studied PTMs using mass spectrometry workflows. Using the simultaneous enrichment strategy described herein, both PTMs are enriched from post-mortem human pancreatic tissue, a complex biological matrix. Dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography is used to separate various forms of glycosylation and phosphorylation simultaneously in multiple fractions in a convenient spin tip-based method, allowing downstream analyses of potential PTM crosstalk interactions. This enrichment workflow for glyco- and phosphopeptides can be applied to various sample types to achieve deep profiling of multiple PTMs and identify potential target molecules for future studies.

Post-translational modifications (PTMs) change protein structures and functions. Methods for the simultaneous enrichment of multiple PTM types can maximize coverage in analyses. We present a protocol using dual-functional Ti(IV)-immobilized metal affinity chromatography followed by mass spectrometry for the simultaneous enrichment and analysis of protein N-glycosylation and phosphorylation in pancreatic tissues.

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Mass spectrometry can provide deep coverage of post-translational modifications (PTMs), although enrichment of these modifications from complex biological ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Kolorektal Kanser Dokularının Glikomikler Kılavuzluğunda Glikoproteomik Kullanılarak Profillenmesi

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Hücre dışı Matrix Glycoproteomics: Kütle Spektrometresi kullanarak Sağlam GLİKOPEPTİT Analizi için Bir Yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Uçuş lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman sağlam proteinler (MALDI-TOF) kütle spektrometrik analizi Matris destekli daha büyük 100 kDa

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

İnsan pankreas dokularından N-glikopeptitler ve fosfopeptitlerin eşzamanlı analizi için spin-tip zenginleştirme stratejisi

Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

Bakteriyel Glikoproteinler için Spesifik Olmayan Proteoliz Tabanlı Glikomik Stratejisi

Ekstrasellüler polisakkaritler Oligo Kitle Profil (Olimp)

Glikomik kılavuzluğunda glikoproteomikler, karmaşık tümör mikro ortamlarında glikoproteomun kapsamlı profilini kolaylaştırır