Bu çalışma Max Planck Topluluğu tarafından desteklendi.

1. Elektro-yetkili V. parahaemolyticus Hücrelerinin Hazırlanması ve Plasmid DNA&#39;nın Yüzücü Hücrelere Elektroporasyonu NOT: Protokolün aşağıdaki bölümü, elektro-yetkili hücrelerin hazırlanmasına ve ardından plazmid DNA&#39;nın yüzücüler hücrelerine elektroporasyonuna olanak tanır. Floresan proteinler bir plasmidden ektopik olarak eksprese ediliyorsa, bu adım önemlidir. <ol><li> V. parahaemolyticus hücrelerini -80 ° C gliserol stoğundan, 100 μg / mL ampisilin ihtiva eden taze bir LB agar plakasına çekin ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, tek bir V. parahaemolyticus koloni ile 200 mL LB besiyeri inoküle edin ve 0. 600&#39;lük bir OD 600 ulaşana kadar çalkalama koşullarında 37 ° C&#39;de inkübe edin. Hücre kültürünün arzulanan optik yoğunluğa erişmesi genellikle 5-6 saat inkübasyon gerektirir. </li><li> Hücreleri derhal buz ve çevreye aktarınBuz üzerindeki ve 4 ° C&#39;lik ön soğutmalı santrifüjlerdeki diğer tüm adımları izleyin. </li><li> Hücreleri 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 2.000 x g&#39;de hasat edin. </li><li> Süpernatantı boşaltma ile atın ve buz püskürtülmüş 273 mM sükroz çözeltisinin (pH 7.4, KOH ile tamponlanmış) 25 mL&#39;de hücre peletini yeniden askıya alın. </li><li> Hücreleri yeniden 4 ° C&#39;de 10 dakika 2000 x g&#39;de hasat edin. İki kez daha tekrarlayın. </li><li> Yıkanmış hücre topağını buz soğukluğunda 273 mM sükroz çözeltisinin 400 μL&#39;sinde yeniden süspanse edin. Ardından, gliserolü% 15 hacim / hacim bir nihai konsantrasyona ilave edin. Hücreler elektroporasyona hazırdır, ancak daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C&#39;de 70 μL&#39;lik bölümler halinde dondurulabilir. </li><li> Elektroporasyon için, elektro-yetkili hücrelerin 70 uL&#39;lik bir bölümünü 100 - 1,000 ng plazmid DNA&#39;yla karıştırın ve karışımı buz gibi bir elektroporasyon küvetine (0.2 cm elektrot boşluğu) aktarın. Aşağıdaki ayarlarla elektroporasyon yapın: 25 μF, 2400 V ve 200 Ω. </li><li> Askıya alHücrelerini elektroporasyon küvetinde 600 μL LB suyu, 2 mL&#39;lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C&#39;de 3 saat çalkalarken inkübe edin. </li><li> 5 dakika süreyle 2,000 xg&#39;de hücreleri aşağı döndürün ve pelet 100 mcL LB suyu içinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu gerekli antibiyotikleri içeren seçici LB agar plakalarına yayın ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Ertesi gün, plakaları koloni oluşumu açısından kontrol edin. Büyümüş olan koloni, plazmit üzerinde kodlanmış doğru antibiyotik direnç genini taşır ve şimdi daha ileri deneyler için kullanılabilir. </li></ol> 2. Swarmer Hücre Farklılaşmasının Teşvik Edilmesi NOT: Aşağıdaki adımlar, V. parahaemolyticus&#39;un daha yaşlı hücre yaşam döngüsüne nasıl farklılaştıracağını ve katı yüzeylerde proliferasyonun nasıl uyarılabileceğini açıklar. <ol><li> 4 gr kalp infüzyonu (HI) Agar&#39;ı 100 ml ddH2O içinde askıya alıp kuyruk plakalarını hazırlayın. </li><li>Mikrodalga fırında HI agar solüsyonunu dikkatlice kaynatın ve toz çözülene kadar şişeyi sık sık çalkalayın. Otoklav, 121 ° C&#39;de 20 dakika süreyle. </li><li> Otoklavdan sonra, HI agarını 60-65 ° C&#39;ye soğutun. Nihai bir konsantrasyona 50 uM (% 100 etanol içinde 50 mM stok çözeltisi) olan 2,2&#39;-Bipiridil ekleyin. CaCl2&#39;yi son konsantrasyon 4 mM&#39;ye ekleyin (ddH20 içinde 4 M stok solüsyonu). Gerekirse plazmidleri korumak için çözeltiye antibiyotik ekleyin. NOT: İndüklenebilir bir plazmid kullanmayı planlıyorsanız, nihai konsantrasyonuna indükleyici ajan ekleyin. DİKKAT: 2,2&#39;-Bipiridil: Akut toksisite (oral, dermal, inhalasyon). Bu kimyasalla çalışırken eldiven ve koruyucu gözlük kullanın. </li><li> 30 - 35 mL son HI agar solüsyonunu 150 mm&#39;lik yuvarlak bir petri kabına dökün ve agarın katılaşmasına izin verin. </li><li> Hücre kültürünü tespit etmeden hemen önce, agar plakasını 37 ° C&#39;de en az 10 dakika boyunca kurutun (veya herhangi bir sıvı tortunun zedelenmesine kadar)Sağduyulu, fakat artık) sağ-açık ve açık bir kapaklı. NOT: Kuruma süreleri kullanılan kuluçka makinesine büyük ölçüde bağlıdır ve ağır kurutulmuş plakalar V. parahaemolyticus&#39;un toplanmasına izin vermez. (Bu adım çok önemlidir!) Tabaklar taze kullanılmalıdır ve 2 - 3 saatten eski olmamalıdır. Eski plakalar, sürülmeyi teşvik etmek için çok kuru olacaklardır. </li><li> Tek bir koloni kenarından az miktarda hücre 5 mL LB suyu içine inoküle edin. OD 600 = 0.8 olana kadar kültürü 37 ° C&#39;de çalkalayarak inkübe edin, genellikle 2-3 saat sürer. Bundan sonra, hücreler HI swarming agar plakaları üzerinde lekelenmeye hazırdır. </li><li> HI agar swarming plakasının merkezinde 1 μL hücre kültürü yapın ( Şekil 1A ). </li><li> Durun noktasını açın ( Şekil 1B ). </li><li> Plakayı şeffaf plastik bantla kapatın ve sıkıca tutturulduğundan emin olun, aksi takdirde gece kuluçka sırasında ayırın ( Şekil 1C ). NOT: ÖyleMühürün mükemmel olması çok önemlidir. Kabarcık oluşumundan kaçının ve uygulandığında banda katlanır. </li><li> Plakayı gece boyunca 24 ° C&#39;de inkübe edin. Bu, sürü kolonisinin çevresinden uzanan sürü alevleri olan bir V. parahaemolyticus sürü kolonisinin oluşmasına neden olacaktır ( Şekil 2 ). </li></ol> 3. Flüoresan Mikroskopisi için V. parahaemolyticus Swarmer Hücrelerinin Hazırlanması NOT: Aşağıdaki protokol, mikroskopi için tekli swarmer hücreleri elde etmek için mikroskopik agaroz slaytlarının hazırlanması ve ardından bir agaroz pedinin üzerine sürükleyici fişeklerin basılması işlemini anlatmaktadır. <ol><li> Mikroskopi için agaroz slaytlar hazırlamak için,% 20 hacim / hacim PBS ve% 10 hacim / hacim LB çorba solüsyonu 100 mL&#39;ye 1 g agaroz ekleyin. Mikrodalga içindeki çözeltiyi özenle kaynatın ve agarozu çözün ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırırken 65-70 ° C&#39;ye soğumasını bekleyin. </li><li> Ac yerleştirYalın mikroskop lamı, çalışma tezgahının mükemmel seviyede bir bölümüne kaydırın. Sürgüyü iki ucunu genel amaçlı laboratuar etiketleme bandı ile örtün ve slaydı çalışma tezgahına sabitleyin. İki bant arasındaki mesafe yaklaşık 3 cm olmalıdır. NOT: İki bant katman, agaroz pedinin yüksekliğini belirleyecek çok küçük bir yükseklik oluşturur. Hücrelerin mikroskopi analizleri için aynı düzlemde olmasını sağlamak için çalışma alanının düz olması önemlidir. </li><li> Pipet Kaplanmamış cam yüzey üzerine ~ 250 uL önceden hazırlanmış agaroz çözeltisi. </li><li> Şimdi, ikinci bir mikroskop slaydı üstteki alttaki ile aynı yönde yerleştirin ve hafifçe bastırın, böylece artık agaroz yanlara akabilir. </li><li> Agaroz 1-2 dakika katılaşır ve daha sonra yatay bir hareketle alttaki cam slaytını yavaş yavaş çekin. </li><li> Bir neşter kullanarak, içine herhangi bir kalıntı agarozMikroskop kaydırın ve yavaş yavaş mikroskop lamı uçlarından bandı çıkarın. NOT: Agaroz slayt hazırdır ve mümkün olduğunca çabuk kullanılmalıdır, çünkü yavaşça kurumaya başlar. </li><li> Swarmer hücreleri mikroskopi yapmak için, bir swarming koloni ( Şekil 1D ) en dış kenarından ağlayan bir agar ~ 3 mm x 10 mm parçası kesin. Swarmer hücrelerinin mikroskop lamına aktarılmasından hemen önce, kütük plakasının bant sızdırmazlığını kesmemeniz çok önemlidir. Bant kaldırıldıktan sonra, V. parahaemolyticus hücrelerini toplayıp yüzücüler hücrelerine farklılaşmaya başlarlar. NOT: Kesiklikleri, gagalama koloni kenarının dışından koloninin içine doğru yönlendirdiğinizden emin olun ( Şekil 1D ). Bu şekilde, yüzen koloni kenarına &quot;yüzücü kirlenmesini&quot; önleyebilirsiniz. </li><li> Agaroz pa bakan hücreleri ile bir mikroskop agaroz slayt swarming agar parçası aktarınD ( Şekil 1E ). Bu, agaroz pedine kınan hücreleri basar. </li><li> 30 saniye bekledikten sonra, agar parçasını agaroz pedinden dikkatle çıkarın ( Şekil 1F ). </li><li> Hücrelerin basıldığı agaroz pedine bir cam lamel yerleştirin. Hücreler mikroskop için hazır. NOT: Swarmer hücreleri hemen yüzücüye yansıtmak önemlidir, çünkü swarmer hücreleri yavaşça yüzücü durumuna farklılaşma başlatır. </li></ol> 4. Fluoresans Mikroskopisi için V. parahaemolyticus Yüzücünün Hücre Kültürlerinin Hazırlanması NOT: Protokolün bu bölümü, yüzücü hücre tipi üzerinde floresans mikroskopisi yapmak için V. parahaemolyticus kültürü hazırlamayı açıklamaktadır. <ol><li> Tek bir koloni kenarından az miktarda hücre 5 mL LB suyu içine inoküle edin. Kültürü 37 ° C&#39;de çalkalayan 1 saat süreyle veya hafif hücre büyümesi görünene kadar inkübe edin. </li><li> atBu aşamada, gerekirse, ilgilenilen proteinlerin ekspresyonu için indükleyici ajan ekleyin. Bu örnekte, YFP-CheW 9&#39;un ekspresyonunu başlatmak için L-arabinoz, nihai konsantrasyon% 0.2&#39;ye (ağırlık / hacim) ilave edildi. </li><li> Kültürü 37 ° C&#39;de 2 saat ek sallayarak inkübe edin. </li><li> Mikroskopi agaroz slaytları hazırlamak için 3.1-3.7 adımlarını izleyin. </li><li> Agaroz pedinin merkezinde 1 μL hücre kültürü yapın ve kuru olana kadar noktayı inkübe edin. </li><li> Hücrelerin lekeli olduğu agaroz pedine bir cam lamel yerleştirin. Hücreler floresan mikroskop altında görüntülenmeye hazır durumda. </li></ol> 5. Görüntü Analizi Protokolün bu kısmı, görüntü analizi için bir iş akışı, özellikle de demografik analiz için tekli hücrelerin flüoresans verilerini nasıl çıkaracağını açıklıyor. <ol><li> Görüntü analizine başlamadan önce, tüm mikroskopik görüntülerin 16 bit TIF formatında kaydedildiğinden emin olun. </li><li> DIC&#39;yi (veya faz kontrastı) ve ilgili floresan kanalı görüntülerini yazılıma yükleyin. </li><li> &quot;Görüntü / Döşeme görüntüleri&quot; ni seçerek her iki kanalın bir kaplama görüntüsü oluşturun. Resim sayısını (&quot;# Görüntüler:&quot;) iki olarak ayarlayın ve ilk kanaldaki DIC görüntüsünü ve ikinci kanaldaki flüoresan resmi seçin. </li><li> Araç çubuğundan &quot;Multi-Line&quot; aracını seçin ve hücrelerin ortasından bir kutuptan diğerine işaretleyin. Oluşturulan tüm satırların (çizgi nesneleri) listesini elde etmek için &quot;Ölçü / Bölge Ölçümleri&quot; ni açın. Bölge ölçümlerini yalnızca bölge etiketini, mesafeyi ve ortalama yoğunluğu görüntülemek üzere yapılandırın. </li><li> &quot;Ölçü / Kalibrasyon Mesafeleri&quot; altındaki piksel boyutunu, mikroskop kurulumunuza özgü piksel boyutuna ayarlayın ve &quot;Tüm Açık Resimler&#39;e Uygula&quot; yı tıklayın. </li><li> Tüm bölgelerin (çizgi nesneleri) flüoresan kanal görüntüsüne aktarın. &quot;Bölgeler / Transf&quot; altında(Bölünmüş görüntü) ve hedef görüntü (floresan kanal görüntüsü) seçin ve &quot;Tüm Bölgeler&quot; i seçin ve &quot;Tamam&quot; düğmesine basın. NOT: Daha sonra kesin çizgileri (çizgi nesneleri, bölgeleri, ROI) yeniden üretmek için &quot;Bölgeler / Bölgeleri Kaydet&quot; bölümünü açın ve bölgeleri kaydedin. </li><li> &quot;Ölçü / Bölge Ölçümleri&quot; ni açarak ve &quot;Günlüğü Aç&quot; a basarak tüm bölge ölçümlerini elektronik tabloya dışa aktarın. Verileri açmak ve vermek için onaylayın. E-tablo arka planda açıldıktan sonra, verileri &quot;F9: Log Data&quot; tuşuna basarak nazımıza aktarın. </li><li> Hücre boyunca floresan odakların konumunu belirlemek için &quot;Ölçüm / Linescan&quot; açın. &quot;Linescan Width&quot; değerini bir hücrenin tüm genişliği önceden oluşturduğunuz bölge tarafından kapsanacak bir değere ayarlayın. Satır tarama grafiğini sağ tıklatın ve &quot;Grafik Verilerini Göster&quot; i seçin. Fareyi sol tıklayıp çizgiyle tarama çizgisine sürükleyerek&quot;Grafik Verileri&quot; penceresinde iki nokta arasındaki ilgili piksel / mesafe görüntülenir. Mavi vurgulanmış satırı seçin ve ardından içeriği kopyalayın. NOT: Tüm çizgi tarama yoğunluğu profili &quot;Linescan&quot; penceresindeki &quot;Günlük Verileri&quot; ne basarak bir e-tabloya kaydedilebilir. Ayıklanan veriler şimdi grafiklerdeki görselleştirme veya daha ileri istatistiksel analiz için kullanılabilir. Hücre döngüsü üzerindeki yerelleştirme kalıpları, hücre uzunluğu ve hücre gövdesi boyunca bulunan floresan yoğunluklarının demografik bir temsilinde kolaylıkla görselleştirilebilir. Bu gösterimler daha önce seçilen aynı ROI&#39;leri kullanarak elde edilebilir. Aşağıdaki adımlar, Şekil 3C ve 4C&#39;de gösterilenlere benzer demografik bilgilerin nasıl oluşturulacağına ilişkin bir örnek verecektir. <ol><li> Yazılımda daha önce yaratılan Fiji / ImageJ yük bölge işaretleri (.rgn) (5.6. Adımda) &quot;Metamorph &amp; ROI files importover&quot;;. Alternatif olarak, analiz edilecek hücrelerin ilgi alanlarını (ROI&#39;leri) doğrudan inşa edilen &quot;Segmented Line&quot; aracını kullanarak Fiji / ImageJ&#39;de yaratabilirsiniz. </li><li> &quot;Çözümle / Araçlar / ROI yöneticisi&quot; ni açın ve tüm aktif liste girişlerini işaretleyin &quot;. </li><li> Ardından, &quot;Daha Fazla / Çok Çizim&quot; seçeneğini tıklayın ve ardından yeni &quot;Çok Çizim&quot; penceresinde &quot;Liste&quot; yi seçin. Bir tablo girişini tıklayın, ardından seçin ve &quot;Tümünü kopyala&quot; yı seçin. Ardından, yeni bir e-tabloya yapıştırın. NOT: En uzun hücrenin (en çok sayıda satır bulunan iki karşılık gelen X ve Y sütun) verilerin e-tabloda sağdaki son hücre olduğundan emin olun. </li><li> E-tabloyu &quot;CSV (Virgülle sınırlandırılmış) (* .csv)&quot; olarak kaydedin. </li><li> R komut dosyalarını buradan indirin &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; 10. Komut dizileri hücreleri uzunluğa göre sıralamakta ve tüm hücrelerin flüoresan yoğunluk profillerini her hücrenin flüoresan ortalamaları olarak normalleştirmektedire. </li><li> Tüm komut dosyasını &quot;hücre profilleri function.R&quot; dosyasını R [sürüm 3.0.1; 11 ]. </li><li> 30 satırındaki &quot;example plots.R&quot; komut dosyasını, dosya yolu önceden oluşturulmuş .csv dosyasının kaydedildiği klasöre yönlendirilecek şekilde düzenleyin. Ayrıca, 31. satırdaki &quot;profile.csv&quot; dosya adını adım 5.9.4&#39;te oluşturulan .csv dosyası için seçilen dosya adına değiştirin. Daha sonra, demografi analizi oluşturmak için &quot;example plots.R&quot; dosyasını çalıştırın ve &quot;https://github.com/ta-cameron/Cell-Profiles&quot; adresindeki belgeleri ve komut dosyası dosyasındaki yorumları takip edin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+dynamometer+controls+swarmer+cell+differentiation+of+V.+parahaemolyticus.">Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li><li>Kawagishi, I., Imagawa, M., Imae, Y., McCarter, L., Homma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sodium-driven+polar+flagellar+motor+of+marine+Vibrio+as+the+mechanosensor+that+regulates+lateral+flagellar+expression.">The sodium-driven polar flagellar motor of marine Vibrio as the mechanosensor that regulates lateral flagellar expression.</a> Mol. Microbiol. 20 (4), 693-699 (1996).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+swarming+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Induction of swarming in Vibrio parahaemolyticus.</a> Arch. Microbiol. 101 (4), 357-363 (1974).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+temperature,+salts,+pH,+and+other+factors+on+the+development+of+peritrichous+flagella+in+Vibrio+alginolyticus.">Effect of temperature, salts, pH, and other factors on the development of peritrichous flagella in Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (3), 285-288 (1975).</li><li>Ulitzur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+swarming+of+Vibrio+alginolyticus.">The mechanism of swarming of Vibrio alginolyticus.</a> Arch. Microbiol. 104 (1), 67-71 (1975).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Chodur, D. M., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+and+iron+regulate+swarming+and+type+III+secretion+in+Vibrio+parahaemolyticus.">Calcium and iron regulate swarming and type III secretion in Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 192 (22), 6025-6038 (2010).</li><li>McCarter, L., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+regulation+of+swarmer+cell+differentiation+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Iron regulation of swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus.</a> J. Bacteriol. 171 (2), 731-736 (1989).</li><li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence.">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol. Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li><li>Heering, J., Ringgaard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Localization+of+Chemotactic+Signaling+Arrays+during+the+Lifecycle+of+Vibrio+parahaemolyticus.">Differential Localization of Chemotactic Signaling Arrays during the Lifecycle of Vibrio parahaemolyticus.</a> Front Microbiol. 7 (November), 1-12 (2016).</li><li>Cameron, T. A., Anderson-Furgeson, J., Zupan, J. R., Zik, J. J., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+synthesis+machinery+in+Agrobacterium+tumefaciens+during+unipolar+growth+and+cell+division.">Peptidoglycan synthesis machinery in Agrobacterium tumefaciens during unipolar growth and cell division.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li><li>Development Core Team, R. F. F. S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R:+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing.">R: A Language and Environment for Statistical Computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. 1, 2673 (2008).</li><li>Ringgaard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ParP+prevents+dissociation+of+CheA+from+chemotactic+signaling+arrays+and+tethers+them+to+a+polar+anchor.">ParP prevents dissociation of CheA from chemotactic signaling arrays and tethers them to a polar anchor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (2), E255-E264 (2014).</li><li>Ringgaard, S., Schirner, K., Davis, B. M., Waldor, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+ParA-like+ATPases+promotes+cell+pole+maturation+by+facilitating+polar+localization+of+chemotaxis+proteins.">A family of ParA-like ATPases promotes cell pole maturation by facilitating polar localization of chemotaxis proteins.</a> Genes Dev. 25, 1544-1555 (2011).</li><li>Vischer, N. O. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+age+dependent+concentration+of+Escherichia+coli+divisome+proteins+analyzed+with+ImageJ+and+ObjectJ.">Cell age dependent concentration of Escherichia coli divisome proteins analyzed with ImageJ and ObjectJ.</a> Front Microbiol. 6 (JUN), (2015).</li><li>Schneider, C. a., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+subpixel+precision+analysis+of+bacterial+morphogenesis+and+intracellular+spatio-temporal+dynamics.">High-throughput, subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics.</a> Mol. Microbiol. 80 (3), 612-627 (2011).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nat. Microbiol. 1, 16077 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Morales-Soto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+Imaging,+and+Quantification+of+Bacterial+Surface+Motility+Assays.">Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays.</a> J. Vis. Exp. (98), e52338 (2015).</li><li>Paintdakhi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oufti:+An+integrated+software+package+for+high-accuracy,+high-throughput+quantitative+microscopy+analysis.">Oufti: An integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis.</a> Mol. Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).</li><li>de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell+Imaging+of+Bacillus+subtilis+and+Streptococcus+pneumoniae+using+Automated+Time-lapse+Microscopy.">Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (53), e1-e6 (2011).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan edilmedi.

Bu yazıda, V. parahaemolyticus swarmer hücrelerinin mikroskopik görüntülemesi için bir yöntem ve bunun ardından, çalışılan floresanla işaretlenmiş proteinlerin subselüler lokalizasyonunu ve diğer özelliklerini çözmek ve nicelleştirmek üzere akış aşağı analizler sunulmaktadır. Mikroskopi görüntü işleme ve analizi için 14 , 15 , 16 , 17 , <sup ...

Bakteriler sürekli olarak dış ortamlarında değişiklikler yaşarlar ve davranışlarını buna göre değiştirmek ve uyarlamak için çeşitli teknikler geliştirdiler. Böyle bir mekanizma, değişen çevreyi daha iyi tamamlayan farklı hücre türlerine farklılaşmayı içerir. Farklılaşma çoğunlukla hücre döngüsünün düzenlenmesinde, hücre morfolojisindeki ve hücrelerin zamansal organizasyonunda büyük değişiklikler içerir. Farklılaşabilen bir organizma Vibrio parahaemolyticus&#39;tur . V. parahaemolyticus genellikle taze veya tuzlu suda yaşayan bir proteobakteriler ailesi olan Vibrionaceae&#39;ye aittir. Vibrionaceae , çevrede yaygın olarak bulunur ve insanlarda bağırsak yolları enfeksiyonlarına neden olan çeşitli türleri içerir; ayrıca Vibrio cholerae.V de dahildir. Parahaemolyticus dimorfik bir organizmadır ve değişikliklere uyum sağlamak için iki farklı hücre tipine cevap olarak cevap verebilirDış çevre. Sulu ortamlarda, eski hücre direğine yerleştirilmiş tek bir polar flagellum ile kısa çubuk şeklinde bir yüzücü hücre bulunur. Yüzey teması üzerine, daha yapışkan bir hücrede farklılaşma tetiklenir. Swarmer hücre farklılaşması iki önemli değişiklik içerir: hücre bölünmesinin önlenmesi yoluyla swarmer hücre morfogenezi ve ikinci bir flagella sisteminin indüksiyonu. Bu, bölünmüş olayların döl hücreleri hücrelerinde sonuçlandığı veya alternatif olarak yüzücüler hücrelerine geri dönüştürebildiği, kiraz yaşam biçimine devam edebilen, peritrik ve oldukça uzatılmış uzunlamasına çubuk şeklinde bir swarmer hücresinin oluşumuyla sonuçlanır. Swarmer farklılaşmasını başlatan veya etkileyen çeşitli faktörlerin bildirildiği bildirilmiştir. Birincil uyarı, V. parahaemolyticus&#39;un , polar lekeliği, yüzey temasında rotasyonun inhibisyonunu tespit eden bir dokunmatik sensör olarak kullandığı mekanosensing tarafından yönlendirilir gibi görünür; ancak, diğer birçok faktör,Iyi 1 . Laboratuarda, polar flagellumun dönüşü, sodyum kanalına bağlı bayraker rotasyonunu bloke eden fenamil ilavesiyle yapay olarak inhibe edilebilmekte ve böylelikle swarmer diferansiyasyonunu indükleyebilmektedir 2 . Ayrıca, daha önceki bir çalışmada, hücreler berrak plastik bantlarla mühürlenmiş bir Petri kabı içindeki büyüme ortamı üzerinde çoğaldığında Vibrio alginolyticus , katı medyada sürüklenmeye teşvik edildi. Alkali doymuş filtre kağıdı, bu koşullar altında yığılmayı engelledi ve bu nedenle, bir veya daha fazla uçucu asitin, kınlama indüksiyonunda rol oynayabileceğini düşündürdü. Böylece, Petri kabını plastik bant ile sızdırmazlık, plakanın baş alanı içinde, hücresel metabolizmanın yan ürünleri olarak oluşan uçucu asitlerin birikmesine muhtemelen izin verdi. Aynı etki, ortam bileşenlerini hidrolize ederek yapay olarak uçucu asitler üretmek için H2O2 büyütülmüş ortama yapıştırılmamış Petri kaplarında ilave edildiğinde elde edilmiştir <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 3 , 4 , 5 . Bununla birlikte, bu uçucu asitlerin kimliği hala bilinmiyor. Dahası, kalsiyumun aşırı miktarda bulunması 6 ve demir sınırlamanın 7 hem katı yüzeylerde swarmer farklılaşmasını ve çoğalmasını arttırdığı gösterilmiştir. Hücreler, pulverideki farklılaşmayı etkilediği gösterilen büyüme ortamına 2,2&#39;-Bipiridil bileşiği eklenerek demir için aç bırakılabilir 8 . Farklılaşmayı düzenleyen bilinen faktörler, artık V. parahaemolyticus&#39;un swarmer hücrelere diferansiyasyonunu ve katı agar yüzeylerinde proliferasyonunu teşvik eden bir protokolün tasarımında uygulanmaktadır. V. parahaemolyticus farklılaşması, hücre bölünmesinin düzenlenmesinde, hücresel morfolojide ve flagell gibi makromoleküler makinelerin konumlandırılmasında büyük değişiklikler içerirA ve kemotaks aparatları - bunların hepsi, proteinlerin hücre döngüsüne göre spesifik lokalizasyonunu gerektiren süreçler. Dolayısıyla, bu proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti, yukarıda sözü edilen hücresel süreçlerin anlaşılması için gereklidir. Bu tür çalışmaları yapmak için tekli hücrelerde flüoresan mikroskobu gereklidir. Swarmer hücrelerinde olduğu gibi, yoğun bakteri popülasyonlarında bulunan hücreleri görüntülerken bu özellikle zorlayıcı olabilir. Mikroskopi çalışmaları için potansiyel olarak tek hücreler üretebilen sıvı ortamda swarmer farklılaşmasına neden olan girişimler yapılmıştır. Transkripsiyonel bir seviyede bu hücreler kısmen swarmer-differentiation programını başlatmış olsalar da, katı ortam 8 üzerinde yetiştirilen tam olarak ayırt edilmiş swarmer hücreleri gibi aynı morfolojik değişikliklere maruz kalmazlar. Bu makale, swarmer ce&#39;yi indüklemek için sağlam ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır.Bir agar yüzeyinde farklılaşma. Protokol, tek hücreli mikroskopi ve takip eden analiz için kolaylıkla erişilebilen bir swarmer hücreleri popülasyonu hazırlar. Ayrıca, protokol hem yüzücü hem de swarmer hücre türlerinde (bölüm 1, 2, 3, 4) floresan etiketli proteinlerin yerini belirleme çalışmalarını mümkün kılar. Ek olarak, protokol, bakteri toplumlarının demografik analizine olanak tanıyan flüoresan mikroskopi deneylerinden elde edilen verilerin nasıl işleneceği ve analiz edileceği üzerine sonraki iş akışını tanımlamaktadır (bölüm 5).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Roth</td><td>X968.3</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, granulated</td><td>BD</td><td>214510</td><td>For preparation of LB agar with LB medium</td></tr><tr><td>Difco Heart Infusion Agar</td><td>BD</td><td>244400</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Agarose NEEO, ultra quality</td><td>Roth</td><td>2267.3</td><td>For preparation of microscopy agarose pads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additives&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Roth</td><td>5118.3</td><td>Used to induce pBAD derivatives</td></tr><tr><td>2,2`-Bipyridyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305-25G</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Roth</td><td>5239.1</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Roth</td><td>K029.3</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Roth</td><td>3886.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS buffer</td><td>-</td><td>-</td><td>Standard recipe for Phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>D(+) Sucrose</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Roth</td><td>3783.5</td><td>For preparation of electrocompetent cells</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hardware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 mm x 20 mm with cams</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>For preparation of HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>kelvitron t (B 6420)</td><td>Heraeus</td><td>-</td><td>Used for drying HI agar swarming plates</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Microbial System</td><td>BioRad</td><td>1652662</td><td>Used for elctroporation of plasmid DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Offline (version 7.7.5.0)</td><td>Molecular Devices</td><td>-</td><td>Used for microscopy image analysis</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Used for microscopy data analsis</td></tr></tbody></table>

induction of cellular differentiation and single cell imaging of vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells

Proteinlerin hücre içi lokalizasyonunu inceleme kabiliyeti birçok hücresel sürecin anlaşılması için gereklidir. Buna karşılık, bu, bakteri toplulukları içinde varolan hücreleri görüntülerken özellikle zorlayıcı olabilen floresan mikroskopisi için tekli hücreler elde etme yeteneğini gerektirir. Örneğin, insan patojeni Vibrio parahaemolyticus sıvı koşullar altında kısa çubuk şeklindeki yüzücü hücreler olarak bulunur ve yüzey teması üzerine katı yüzeyler üzerinde büyümek için uzmanlaşmış oldukça genişlemiş swarmer hücrelerin bir alt popülasyonuna ayrılır. Bu yazıda V. parahaemolyticus&#39;un iki farklı durumundaki tek hücreli floresans mikroskobu analizini gerçekleştirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, V. parahaemolyticus&#39;un daha canlı bir hücre yaşam döngüsüne çok reproducibly farklılaşmasına neden olur ve katı yüzeyler üzerindeki proliferasyonunu kolaylaştırır. Metod, t lekelerinden uzanan farklı swarmer hücrelerinin fişeklerini üretir.O sürü koloni kenarında. Özellikle, sürü alevlerinin ucunda, daha sürükleyici hücreler, tek bir hücrenin katmanında bulunur; bu da, bir mikroskop lamına kolay aktarılmalarına ve daha sonra tek hücrelerin izlenmesi için flüoresans mikroskobu görüntülemelerine olanak tanır. Ek olarak, bakteri toplumlarının demografik temsili için görüntü analizinin iş akışı sunulmaktadır. Prensip olarak, V. parahaemolyticus&#39;un yüzücü ve swarmer hücrelerindeki kemotaksis sinyal dizilerinin hücre içi lokalizasyonunun analizi açıklanmaktadır.

Farklılaşma ve toplayıcı koloni üretiminin teşvik edilmesi Şekil 1 , V. parahaemolyticus&#39;un toplayıcı kolonilerinin üretilmesiyle ilgili önemli adımların bir şemasını sunmaktadır ( Şekil 1A-C ). Sürücüler kültürü sürü-agar üzerinde gözlendi ve 24 o C&#39;de inkübe edildi, katı agar yüzeyi üzerinde swarmer farklılaşması ve çoğal...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells at JoVE.com

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar.

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu<emVibrio parahaemolyticus</em&gt; Yüzücü ve Swarmer Hücreleri

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

induction-cellular-differentiation-single-cell-imaging-vibrio

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

9.3K Görüntüleme.  Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology.  Bu protokol, farklı olarak farklı Vibrio parahaemolyticus yüzücü ve swarmer hücrelerinin tek hücreli mikroskobu sağlar. Yöntem, tek hücreli analiz için kolayca bulunabilen bir swarmer hücreleri popülasyonu üretir ve hücre kültürlerinin hazırlanmasını, swarmer farklılaşmasının indüksiyonunu, numunenin hazırlanmasını ve görüntü analizini kapsar. 

Video: Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.

The role of assortment (spatial segregation) in evolutionary scenarios can be examined using simple microbial systems in the laboratory that allow controlled adjustment of spatial distribution. By modifying the founder cell density, various assortment levels can be visualized using fluorescently labelled bacterial strains in the colony biofilms of Bacillus subtilis.

Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple ...

Genetik

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

İndükleyici Gradyan Plakaları Üzerindeki Bakteriyel Yüzey Kaynatma Motilitesinin Ölçülmesi

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

Biyokimya

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved oxygen concentration). Nevertheless, the morphology of cells can be a suitable indicator for optimal conditions, since it changes with dependence on the growth state, product accumulation and cell stress. Furthermore, the single-cell size distribution provides not only information about the cultivation conditions, but also about the population heterogeneity. To gain such information, a photo-optical in situ microscopy device1 was developed to enable the monitoring of the single-cell size distribution directly in the cell suspension in bioreactors. An automated image analysis is coupled to the microscopy based on a neural network model, which is trained with user-annotated images. Several parameters, which are gained from the captures of the microscope, are correlated to process relevant features of the cells, like their metabolic activity. Until now, the presented in situ microscopy probe series was applied to measure the pellet size in filamentous fungi suspensions. It was used to distinguish the single-cell size in microalgae cultivation and relate it to lipid accumulation. The shape of cellular particles was related to budding in yeast cultures. The microscopy analysis can be generally split into three steps: (i) image acquisition, (ii) particle identification, and (iii) data analysis, respectively. All steps have to be adapted to the organism, and therefore specific annotated information is required in order to achieve reliable results. The ability to monitor changes in cell morphology directly in line or on line (in a by-pass) enables real-time values for monitoring and control, in process development as well as in production scale. If the off line data correlates with the real-time data, the current tedious off line measurements with unknown influences on the cell size become needless.

In Situ Microscopy for Real-time Determination of Single-cell Morphology in Bioprocesses

A photo-optical in situ microscopy device was developed to monitor the size of single cells directly in the cell suspension. The real-time measurement is conducted by coupling the photo-optical sterilizable probe to an automated image analysis. Morphological changes appear with dependence on the growth state and cultivation conditions.

In Situ Biyoproseslerde Tek Hücreli Morfolojinin Gerçek Zamanlı Tayini İçin Mikroskopi

In situ monitoring in microbial bioprocesses is mostly restricted to chemical and physical properties of the medium (e.g.,pH value and the dissolved ...

Biyomühendislik

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (cytosolic hyper-replication). These different phenotypes of intracellular replication drive to different pathways of pathogenesis, i.e., cytosolic hyper-replication induces inflammatory cell death and extrusion into the gut lumen, while vacuolar replication leads to trans-epithelium penetration and systemic spread. Significant effort was made to create microscopy tools to study the behavior of Salmonella inside invaded cells, such as the pCHAR-Duo fluorescence reporter plasmid that allows discrimination between vacuolar and cytosolic bacteria by differential expression of mCherry and GFP. However, intracellular phenotypes are often manually scored, a time-consuming procedure that limits analysis to a small number of samples and cells. To overcome these limitations, two complementary and automated image analyses were developed using ImageJ, a freely available image analysis software. In the high-throughput protocol, epithelial cells were infected with Salmonella carrying pCHAR-Duo using 96-well plates. Imaging was performed using an automated fluorescence microscope. Then, two image analysis methods were applied to measure the intracellular behavior of Salmonella at different detail levels. The first method measures the overall intracellular bacterial load and the extent of cytosolic hyper-replication. It is fast and allows the scoring of a high number of cells and samples, making it suitable for high-throughput assays such as screening experiments. The second method performs single-cell analysis to determine the percentage of infected cells, the mean vacuolar load of Salmonella, and the cytosolic hyper-replication rate giving greater details about Salmonella behavior inside epithelial cells. The protocols can be performed by specifically designed ImageJ scripts to automatically run batch analyses of the major steps of Salmonella-enterocyte interaction.

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonella invades and replicates inside intestinal epithelial cells both in Salmonella-specific vacuoles and free in the cytosol (hyper-replication). A high-throughput fluorescence microscopy-based protocol is described here to quantify the intracellular phenotypes of Salmonella by two complementary image analyses through ImageJ, reaching single-cell resolution and scoring.

ImageJ Kullanarak Salmonella'nın Hücre İçi Fenotiplerinin Otomatik Analizi

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Bakteriyel Yüzey Motilite Tahliller hazırlanması, Görüntüleme ve miktarının belirlenmesi

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Biyoloji

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do not allow for accurate interpretation of this interplay. Using a quantitative imaging-based approach, we present a high-content protocol for characterizing the dynamic phenotypic responses (i.e. morphology changes, proliferation, apoptosis) of heterogeneous cell populations to changes in environmental stimuli. We highlight our ability to distinguish between cell types based upon either fluorescence intensity or inherent morphology features depending on the application. This platform allows for a more comprehensive characterization of subpopulation response to perturbation while utilizing shorter time, smaller amounts of reagents, and lower likelihood of error than traditional cell biology assays. However, in some cases, cell populations may be difficult to identify and quantitate based on complex cellular features and will require additional troubleshooting; we highlight some of these circumstances in the protocol. We demonstrate this application using response to drug in a cancer model; however, it can easily be applied more broadly to other physiological processes. This protocol allows one to identify subpopulations within a co-culture system and characterize the particular response of each to external stimuli.

We have developed a novel protocol for studying heterocellular population dynamics in response to perturbations. This manuscript describes an imaging-based platform that produces quantitative datasets for simultaneous characterization of multiple cellular phenotypes of heterocellular populations in a robust manner.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers single-cell resolution and long observation times spanning hundreds of generations; unlike agarose pad-based microscopy, it has uniform growth conditions that can be tightly controlled. Because the continuous flow of growth medium isolates the cells in a microfluidic device from unpredictable variations in the local chemical environment caused by cell growth and metabolism, authentic changes in gene expression and cell growth in response to specific stimuli can be more confidently observed. Bacillus subtilis is used here as a model bacterial species to demonstrate a &#34;mother machine&#34;-type method for cellular analysis. We show how to construct and plumb a microfluidic device, load it with cells, initiate microscopic imaging, and expose cells to a stimulus by switching from one growth medium to another. A stress-responsive reporter is used as an example to reveal the type of data that may be obtained by this method. We also briefly discuss further applications of this method for other types of experiments, such as analysis of bacterial sporulation.

Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis

We present a method for the microfluidic analysis of individual bacterial cell lineages using Bacillus subtilis as an example. The method overcomes shortcomings of traditional analytical methods in microbiology by allowing observation of hundreds of cell generations under tightly controllable and uniform growth conditions.

Bacillus subtilis tek hücreli mikrosıvısal analizi

Microfluidic technology overcomes many of the limitations to traditional analytical methods in microbiology. Unlike bulk-culture methods, it offers ...

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, to elucidate the function and assembly of flagellar parts, and to examine and understand patterns of movement. Here we demonstrate a combination of three of these methodologies. Motility in soft agar is the oldest, offering a strong selection for isolating gain-of-function suppressor mutations in motility-impaired strains, where motility is restored through a second mutation. The cell-tethering technique, first employed to demonstrate the rotary nature of the flagellar motor, can be used to assess the impact of signaling effectors on the motor speed and its ability to switch rotational direction. The &#8220;border-crossing&#8221; assay is more recent, where swimming bacteria can be primed to transition into moving collectively as a swarm. In combination, these protocols represent a systematic and powerful approach to identifying components of the motility machinery, and to characterizing their role in different facets of swimming and swarming. They can be easily adapted to study motility in other bacterial species.

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Many bacteria use flagella-driven motility to navigate their environment and colonize favorable surroundings both individually and as a collective. Demonstrated here is the use of three established methods that exploit motility as a selection tool to identify components/pathways contributing to swimming and swarming motility.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

Hücresel Farklılaşma ve Tek Hücreli Görüntüleme İndüksiyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler