Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri gm118085 ve kısmen Robert Welch Vakfı (R.M.H.'ye F-1811 hibesi) tarafından desteklendi.

1. Hareketlilik eksikliği olan suşlarda baskılayıcı mutantların izolasyonu
NOT: Hareketlilik kusurunun genel doğasını tanımlamak için bu yöntemi geniş bir 'catch-all' olarak kullanın.
<ol><li>Yumuşak-agar plaka hazırlığı NOT: Yumuşak-agar, motility- veya yüzme-agar olarak da adlandırılır, düşük yüzdeli bir agardır (~0.2-0.35% w / v), uzun zamandır kemotaksi31,32'yi test etmek için kullanılır.<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 3 g bacto-agar (%0,3 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O (çift damıtılmış su) ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki çubuk/ plakayı kullanarak hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Sıcaklık yaklaşık 50 ° C'ye ulaştığında, steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve erimiş agarın 16 saat içinde kullanılmak üzere en az 1 saat boyunca kapakla ayarlanabilmesini sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Baskılayıcı mutantların kültür hazırlığı, aşılanması ve izolasyonu NOT: Yumuşak agar ile katılaşmış besin zengini medyanın merkezinde aşılanan E. coli, besinleri yerel olarak tüketerek takip ettikleri bir besin gradyanı oluşturur. Dışa doğru ilerledikçe, bakterilerin yanıt verdiği belirli kemoattantlarla ilişkili tanımlanmış 'halkalar' ortaya çıkar (Şekil 1A). Kemotaksi sistemindeki veya flagella motorunun yapısal bileşenlerindeki kusurlar bu testte performansı tehlikeye atabilir. Genellikle, hareketlilik avantajı olan mutantlar tarama sırasında ortaya çıkar ve halkanın çevresi boyunca tek veya birden fazla noktadan, 'alevlendikleri' yerden ortaya çıktığı görülebilir (Şekil 1C). Yüzme cephesinin en dış kenarının, kavunlanmamış bakire yumuşak agar'a karşı kolayca zıt olduğunu fark edecektir.<ol>
<li>Yatay sallama (220 r.p.m.) ile 30 °C'de 5 mL Lennox Suyunda (LB; 10 g/L tripto, 5 g/L maya özü ve 5 g/L NaCl, Malzeme Masası)istenen hareketlilik eksikliği olan suşun geceleme kültürlerini büyütün. Ertesi gün, taze LB'de alt kültür (1:100 seyreltme), üstel faza aynı koşullar altında büyür(OD 600 / 0.6).</li>
		<li>Kültürün 6 μL'sini pipet kullanarak yumuşak bir agar plakasının (1.1) ortasına aşılayın, yüklü steril ucu içeriği hafifçe dışarı çıkarmak için ağar içine itin. 30 °C'ye aktarın ve kuluçkaya yatırın (Şekil 1B), hareketlilik 'parlamaları' belirgin olana kadar, aşılama noktasından veya hareketlilik halkalarının çevresinden, tipik olarak 24-36 saat(Şekil 1C)olarak yayılana kadar. NOT: Hareketlilik tahlillerinde, karşılaştırma için mutant izolelerinin yanında vahşi tip bir suşu aşılar. Bu vahşi tip suş karakteristik eşmerkezli kemotaktik halkaları gösterecektir (Şekil 1A) ve plakayı 8-10 saat içinde dolduracaktır.</li>
		<li>Hücreleri 'parlama' bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri bir LB sert agar plakasına arındırmak için çizgi kullanın (LB yukarıdaki gibi hazırlanmış, 15 g/L bacto-agar ile katılaştırılmış).</li>
		<li>Steril bir tel halkası kullanarak çizgi plakasından tek kolonileri seçin ve 'saf' bir koloni izolesinin izolasyonu için tek koloniler için çizgi çizerek yeniden arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bastırıcı mutantların onaylanması ve karakterizasyonu
	<ol>
<li>İzole bastırılmış mutantların hareketliliği geri yüklediğini onaylayın. Yumuşak agar plakaları (1.1) ve kültürleri, vahşi tip ve karşılaştırma için başlangıç 'hareketlilik eksikliği' suşu da dahil olmak üzere ilgi suşları (1.2.1'de olduğu gibi) için hazırlayın.</li>
		<li>Plakaları aşılayın (1.2.2'de olduğu gibi) ve 8-10 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>En dıştaki halkanın çapını (dairenin kenarı) kaydedin ve hangi izolelerin hareketliliği önemli ölçüde geri yüklediğini belirlemek için karşılaştırın. NOT: Plakaların deneyin zaman dilimi boyunca fotoğraf edilmesi önerilir. En iyi sonuçlar için, yüzme kolonisinin çapını ölçmek ve sömürgeleştirilmemiş agardan ayırt etmek için daha iyi aydınlatma için bir ışık kaynağının üzerine dijital kamera monte edildiği bir "ışık kovası" cihazı30kullanın.</li>
		<li>Denek, WGS'ye gerektiği gibi izole edilerek, vahşi tip fonksiyonu geri getiren mutasyonları pozitif olarak tanımlamak için yeterli 'sıra kapsamı' sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Flagella motor davranışını hücre bağlama ile ölçme
NOT: Normal çalıştırma-takla davranışı (kemotaksi) tehlikeye atılmış gibi göründüğünde bu yöntemi kullanın.
<ol><li>
Kültür hazırlama ve flagella makaslama
	<ol>
<li>Adım 1.2.1'de açıklandığı gibi, ilgi gerginliğinin üstel bir faz kültürünü hazırlayın.</li>
		<li>Pellet 10 mL hücre, 10 mL filtre sterilize Motility Buffer (MB) ile yeniden canlandırmadan önce 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleme ile hücre; 10 mM potasyum fosfat tamponu [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOT: MB hareketliliğidestekler, ancak bakteri üremeyi desteklemez</li>
		<li>Son peletin 1 mL MB olarak yeniden sünülene kadar 2.1.2 adımını iki kez daha yineleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 1 mL şırıngaya aktarın ve sonuna 23G iğne takın. Aynı şırınga/iğne aparatını monte edin ve ikisini her iğne ucuna sıkıca sarılmış 6 inç polietilen boru (iç çapı 0,58 mm) ile birbirine takın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu bir şırıngandan diğerine 50x'e hafifçe geçirerek flagellayı kesin (kırılgandırlar ve kolayca kırılırlar) ve her 10 geçiş arasında 1 dakika duraklama olur.</li>
		<li>Yamulmuş hücreleri 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj edin ve 500 μL MB'lık son hacimde yeniden biriktirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slayt hazırlama ve hücre bağlama
	<ol>
<li>Çift taraflı bantla ayrılmış 3 inç x 1 inç x 1 mm cam mikroskop kaydırağı üzerine 18 mm x 18 mm kapak örtüsü istifleyerek bir hücre sabitleme odası hazırlayın (Şekil S1).</li>
		<li>Haznenin üstüne uygulayarak hazneyi %0,01 (w/v) polilizin çözeltisi ile yıkayın. Çözeltinin hazneden(Şekil S1)çiz çekilmesine yardımcı olmak için alt kenarı (kapak altlığı mikroskop kaydırağıyla yıkama) bir görev silecekine (kağıt mendil) eğin. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>2.2.2 adımında açıklandığı gibi 40 μL MB ile hazneyi üç kez yıkayın</li>
		<li>Odanın üstüne 40 μL yamluk hücre süspansiyonu ekleyin (yukarıda hazırlanmıştır) ve hücrelerin kapak kapağına takılmasını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Eklenmemiş hücreleri çıkarmak için hazneyi 2.2.3'te olduğu gibi 40 μL MB ile hafifçe yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre dönüşü kaydı ve nicelleştirme
	<ol>
<li>Bağlı hücrelerle yüklenen mikroskop kaydırağı mikroskop aşamasına aktarın.</li>
		<li>Faz kontrastlı mikroskopi ve 100x hedefi kullanarak, popülasyonu yerinde sabitlenmiş hücreler için tarayın ve tek bir eksende döndürün, yani hücrenin odak içinde ve dışında hareket ettiği bir açıda sunmak yerine sabit bir noktada düzgün dönüşler (Video 1).</li>
		<li>Ticari bir mikroskop ve ilişkili kamera kullanın. İlişkili yazılımı açın, ilgi çekici hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika (saniyede 10 kare veya daha yüksek) kaydetmek için video alımını tıklayın.</li>
		<li>Video oynatmadan, dakikadaki tam döndürme sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını (anahtarlama sıklığı) ölçün. NOT: Dönme hızları ve anahtarlama frekansı gözle ölçülemeyecek kadar hızlı olabilir, bu nedenle yavaş / ince oynatma sunan veya dönme modellerini ölçmek için otomatik bir yazılım sistemi benimseyen video yazılımı kullanılması önerilir33. Bir alternatif, daha hızlı bakterilerin dönüşünü yavaşlatmaya ve çözmeye yardımcı olmak veya düşük kare hızlarına sahip kameralar kullanımda olduğunda telafi etmek için metil selüloz (veya benzeri bir ajan) kullanarak MB'nin viskozitesini artırmak olacaktır.</li>
		<li>İlgi popülasyonunun bir temsilini derlemek için biyolojik çoğaltmalarla 2.3.2 adımını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sınır kapısında sürülerin hazırlanması
NOT: Bir mutasyonun veya durumun grup hareketliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için bu yöntemi kullanın. Swarm-agar, yüzdenin genellikle yumuşak agardan daha yüksek olduğu agarı ifade eder. Yumuşak agarda (%0.3), hücreler agarın içinde ayrı ayrı yüzer. Sürü agarında (%0,5 ve üzeri), hücreler yüzeyde bir grup olarak hareket eder. Sürü plakalarının burada ayrıntılı olarak kullanılması gerekirken, yüzme plakaları daha uzun raf ömrüne sahiptir ve birkaç gün kullanılabilir. Kişisel tercihimiz 1-2 gün içinde kullanmaktır.
<ol><li>
Sürü agar hazırlanması
	<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 5 g Eiken agar (%0,5 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki gibi çubuğu / plakayı kullanarak hava kabarcıklarını önlemek için hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Yaklaşık 50 °C olduğunda, % 0,5'lik son konsantrasyon için filtre sterilize edilmiş glikoz ekleyin.</li>
		<li>Steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve oda sıcaklığında en az 14 saat ve en fazla 20 saat ayarlayın. İleride kullanmak üzere saklamayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sürü plakalarının aşılanması ve inkübasyonu
	<ol>
<li>Asgarın üzerine tespit larak orta üssel bir kültürün (1.2'de olduğu gibi hazırlanan) 6 μL'yi aşıla.</li>
		<li>Kapağı 5-10 dakika bekletin ve inoculum agar yüzeyine kuruduğu zaman değiştirin.</li>
		<li>8 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın. Agarın kurumasına katkıda bulunacağı ve kaynamayı bozacağı için kapağı çıkararak sürü ilerlemesini inceleme cazibesinden kaçının. NOT: Kuluçka süresi gerinim fenotipine bağlı olarak değişebilir. Bazı izole mutasyonlar kaynama yeteneğini engelleyebilir ve daha az agar yüzdesi veya daha uzun bir kuluçka süresi gerektirecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sınır geçişi tahlil plakalarının hazırlanması NOT: Bu tahlil, plastik bir bölmenin (kenarlık) bir yerine iki odacık oluşturduğu modifiye edilmiş bir Petri kabı kullanır (Şekil 2A). Her oda diğer odadan bağımsız olarak hazırlanabilir ve ikisini 'bağlamadan' önce kaynama için farklı koşullar sunar. Deneysel tasarıma bağlı olarak, ilk oda (solda belirtilen) yüzme agarı (%0,3 w/v) veya sürü agar (%0,5 w/v) ile hazırlanabilir, burada bakteriler sınır boyunca sürü agar +/- gerekli herhangi bir takviye veya zorluk (örneğin, antibiyotikler) içeren sağ odaya göç edebilir. Her iki agar üzerindeki göç tipik olarak, orijinal aşılama noktasından en geniş bakteri kolonizasyonu çapı (kenardan kenara) kaydedilerek ölçülür/karşılaştırılır.<ol>
<li>Gerekirse 1.1'de açıklandığı gibi yüzme agarı hazırlayın.</li>
		<li>3.1'de açıklandığı gibi sürü agar hazırlayın.</li>
		<li>Çift bölmeli petri kabının (100 mm x 15 mm) sağ odasına, odalar arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olan, ancak sola taşmayan noktaya kadar ~30 mL sürü agar (gerekirse istenen takviye ile) dökün (Şekil 2B).</li>
		<li>Agar sertleştikten sonra, sol odayı ~ 30 mL yüzme veya sürü agar ile doldurun, yine plastik bölme ile temas noktasına (Şekil 2C). Ayarlmadan önce, iki tarafı bölmenin tüm uzunluğunu kapsayan ~1 mm yüksekliğinde bir agar köprüsüne bağlamak için agar'ı yavaşça sınır boyunca sürüklemek için steril bir pipet ucu kullanın (Şekil 2D).</li>
		<li>Plakanın oda sıcaklığında (3,1) kurumasını bekleyin. NOT: Köprü oluşturmanın alternatif bir yöntemi, sol oda agarının kurumasına ve daha sonra iki oda arasında köprü oluşturmak için plastik bölücü boyunca ~100 μL erimiş sürü agarının yavaşça pipetlemesine izin vermektir (3,4). Yüzme (1.2.2) veya sürü (3.2) agar için yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmış olarak, 12-16 saat boyunca 30 ° C'de kuluçkaya yatırmadan önce veya sürüler ilgi gerginlikleri arasında karşılaştırmalara izin vermek için sağ oda üzerinde yeterli ilerleme sağlayana kadar sol odadaki plakaları aşılayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Baskılayıcı mutasyonların izolasyonu ve karakterizasyonu, kemotaksi sistemi 35,36,37'nin ve motor makinelerinin kendisinin38,39,40'ıntemel bileşenlerinin tanımlanmasına başarıyla katkıda bulunmuştur. Protokol 1'i kullanırken, hareketlilik kaybını telafi edebilecek büyük bir olası mutasyon spektrumunun izolasyonu sağla...

Bakteriler ekolojik nişlerinde hareket ve dağılım için birçok uzantılar istihdam eder1. Flagella tahrikli hareketlilik bunların en hızlısıdır, çevre sinyallerine yanıt olarak elverişli yerellerin kolonileşmesini teşvik eder ve bazı türlerin patojenik yeteneğine önemli ölçüde katkıda bulunan2,3. Flagellated bakteriler toplu sıvı içinde ayrı ayrı yüzebilir veya yarı katı bir yüzey üzerinde kolektif olarak sürünebilir4. Hücre dışıflagella, dönüş1, 2 ,4,5,6,7,8'e neden olan tork oluşturmak için iyongradyanlarınıngücünden yararlanan membrana gömülü döner motorlara takılır ve tahrik edilir. Motorları sabit tork9'daçalışan E. coli'demotor çıkışı, dönme hızı ve rotorun saat yönünün tersine (CCW) ve saat yönünde (CW) yönler arasında değiştirilmesi açısından kategorize edilebilir. CCW dönüşü, hücreyi ileriye doğru iten tutarlı bir flagellar demetin oluşumunu teşvik ederken (çalıştır), dönme yönünde (CW) geçici bir anahtar, demetin kısmen veya tamamen10'usökmesine ve hücrenin yüzme yönünü yeniden yönlendirmesine (yuvarlanma) neden olur. E. coli genellikle bir saniye koşar ve saniyenin onda biri için yuvarlanır. Rotorun veya 'takla önyargısının' anahtarlama frekansı kemotaksi sinyal sistemi tarafından kontrol edilir, burada transmembran chemoreceptors harici kimyasal sinyalleri algılar ve çekicilere yanıt olarak çalıştırmaları uzatmak veya toksik kimyasallara yanıt olarak bastırmak için fosforelay ile flagellar motora iletir11,12. Yüzme hareketliliği% 0.3 yumuşak agarda test edilir.
Kaynama sırasında bakteriler, bakteri paketlerinin sürekli dönen bir hareketle aktığı yoğun bir kolektif olarak yarı katı bir yüzeyde gezinirken2,13,14,15. E. coli sürüleri, dökme sıvıda yüzen hücreler üzerinde değiştirilmiş kemosentezör fizyoloji (daha düşük yuvarlanma önyargısı), daha yüksek hızlar ve antimikrobiyallere karşı daha yüksek tolerans sergiler16,17. Swarmers, yüzey aktif madde üretimi, hiperflagellasyon ve hücre uzaması2dahil olmak üzere harekete yardımcı olan çok sayıda stratejinin dağıtımında değişir. Swarming bakterilere hem ekolojik hem de klinik ortamlarda rekabet avantajı sunar18,19,20. Kaynayan bakterilerin iki kategorisi vardır: sadece% 0.5-0.8 agar ile katılaşmış medyaya sürülebilen ılıman sürüler ve daha yüksek agar konsantrasyonlarında gezinebilen sağlam sürüler21.
Yüzme hareketliliğini ve düzenlemesini sorgulamak için çeşitli tahliller mevcuttur. Mutasyonlar veya çevresel koşullar nedeniyle bozulduğunda, hareketliliğin kendisi fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonları tanımlamak için güçlü bir seçim sunar. Bu bastırıcılar, orijinal mutasyonun gerçek geri dönüşleri veya ikinci bir mutasyonun işlevselliği geri yüklediği sözde geri dönüşler olabilir. Bu tür mutantlar tüm genom dizilimi (WGS) ile tanımlanabilir. Tarafsız baskılayıcı seçimine bir alternatif, önyargılı hedefli bir mutajensis stratejisidir (örneğin, PCR mutajensis). Bu metodolojiler genellikle hareketlilik aparatının işlevine veya çevre düzenlemesine ışık tutar. Amaç motor fonksiyonu incelemekse, yumuşak agarda ölçülen vahşi tip hareketliliğin restorasyonu mutlaka vahşi tip motor çıkışının restorasyonunu göstermeyebilir. Hücrelerin tek bir flagellum tarafından cam yüzeye tutturulduğu ve hücre gövdesinin dönüşünün daha sonra izlendiği hücre bağlama tahlili, motor davranışı değerlendirmek için tercih edilen ilk test olabilir. Motor özelliklerini izlemek için artık daha sofistike metodolojiler mevcut olsa da, hareket analizi için gerekli yüksek hızlı kamera kurulumu ve yazılım paketlerinin uygulanması yaygın kullanımlarını sınırlar22,23,24,25. Hücre bağlama tahlili sadece flagellanın yamumasını gerektirir, bu da kısa filamentlerin cam bir slayda bağlanmasına izin verir ve ardından hücre gövdesinin dönüşünü videoya ekler. Kaydedilen motor hızları, hücre gövdesinin flagellum üzerinde uyguladığı yüksek yük nedeniyle bu testte düşük olsa da, bu test yine de kemotaktik yanıtlar26 , 27,28,29hakkında değerli içgörülere katkıda bulunmuştur ve aşağıda tartışıldığı gibi geçerli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir.
Kaynayan hareketlilik araştırmacılar için farklı zorluklar doğurur. fonksiyon kazancı bastırıcıların seçimi sadece bol miktarda yüzey aktif madde üreten ve kolayca sürü13. E. coli gibi yüzey aktif olmayan üreticiler, agar seçimi, medya bileşimi ve ortamın nemi ile ilgili titizdir2,13,14,21. Kaynama koşulları belirlendikten sonra, sınır geçişi tahlil17, bir sürünün yeni / zorlu koşullarda gezinme yeteneğini sorgulamak için yararlı bir metodolojidir. Aşağıda sunulan protokoller E. coliile ilgili olsa da, diğer türlerde uygulama için kolayca uyarlanabilirler.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

Hareketlilik birçok bakteri türünün hayatta kalması ve başarısı için çok önemlidir. Sinyal yollarını anlamak, flagellar parçaların işlevini ve montajını aydınlatmak ve hareket kalıplarını incelemek ve anlamak için hareketlilik yararlanmak için birçok metodoloji vardır. Burada bu metodolojilerden üçünün bir kombinasyonunu gösteriyoruz. Yumuşak agardaki hareketlilik en eskidir ve hareketliliğin ikinci bir mutasyonla geri yüklendiği hareketlilik bozulmuş suşlarda fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonlarını izole etmek için güçlü bir seçim sunar. İlk olarak flagellar motorun döner doğasını göstermek için kullanılan hücre bağlama tekniği, sinyal efektörlerinin motor hızı üzerindeki etkisini ve dönme yönünü değiştirme yeteneğini değerlendirmek için kullanılabilir. "Sınır geçişi" tahlilleri, yüzme bakterisinin topluca sürü olarak hareket etmeye geçiş için astarlanabileceği daha yenidir. Birlikte, bu protokoller hareketlilik makinelerinin bileşenlerini tanımlamak ve yüzme ve kaynaşma farklı fasetlerindeki rollerini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Diğer bakteri türlerinde hareketliliği incelemek için kolayca uyarlanabilirler.

Hareketlilik sinyal molekülü c-di-GMP'nin yüksek seviyeleri tarafından bozulan bir E. coli suşundaki sözde geri dönüşlerin izolasyonu, laboratuvarımızdan yapılan son çalışmalarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır34. Bu suş (JP1442) iki mutasyon barındırır:Δ yhjH ve ΔycgR. YhjH, E. coli'dec-di-GMP'yi düşüren en aktif fosfodiesterazdır. YhjH'nin yokluğu c-di-GMP seviyelerinin yükselmesine ve hareketliliğin inhibisyona yol açar. Yc...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.6K Görüntüleme.  The University of Texas at Austin. Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Biyomühendislik

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Biyoloji

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu<em&gt; PilG</em&gt; &#39;de<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Biyokimya

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Motilite ve Büyüme Çalışması için Hidrojel Matrislerinde Bakterilerin Biyo-Baskısı

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. However, the majority of previous work has focused on studies of cells in bulk liquids or at flat surfaces, which do not fully recapitulate the complexity of many natural bacterial habitats. Here, this gap in knowledge is addressed by describing the development of a method to 3D-print dense colonies of bacteria into jammed granular hydrogel matrices. These matrices have tunable pore sizes and mechanical properties; they physically confine the cells, thus supporting them in 3D. They are optically transparent, allowing for direct visualization of bacterial spreading through their surroundings using imaging. As a proof of this principle, here, the capability of this protocol is demonstrated by 3D printing and imaging non-motile and motile Vibro cholerae, as well as non-motile Escherichia coli, in jammed granular hydrogel matrices with varying interstitial pore sizes.

Yazar Spotlight: 3D Hidrojel Matrislerinde Bakteri Üremesinin İncelenmesi

This protocol describes a procedure for three-dimensional (3D) printing of bacterial colonies to study their motility and growth in complex 3D porous hydrogel matrices that are more akin to their natural habitats than conventional liquid cultures or Petri dishes.

Karmaşık 3D Gözenekli Ortamlarda Hareketliliği ve Büyümeyi İncelemek için 3D Baskı Bakterileri

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Rolü seğirmesi Motilitesi görselleştirme ve Karakterizasyonu

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Zaman Atlamalı Mikroskopi Kullanılarak Escherichia Coli'de Biyolojik Gürültünün Sürekli Ölçümü

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

Karmaşık 3D Gözenekli Ortamlarda Hareketliliği ve Büyümeyi İncelemek için 3D Baskı Bakterileri

Karmaşık 3D Gözenekli Ortamlarda Hareketliliği ve Büyümeyi İncelemek için 3D Baskı Bakterileri

Karmaşık 3D Gözenekli Ortamlarda Hareketliliği ve Büyümeyi İncelemek için 3D Baskı Bakterileri

Bakteriyel Glikoziltransferazların Bakteriyel Motilitedeki Rolünü Aydınlatmak için Boş Mutantların Üretilmesi