Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri gm118085 ve kısmen Robert Welch Vakfı (R.M.H.'ye F-1811 hibesi) tarafından desteklendi.

1. Hareketlilik eksikliği olan suşlarda baskılayıcı mutantların izolasyonu
NOT: Hareketlilik kusurunun genel doğasını tanımlamak için bu yöntemi geniş bir 'catch-all' olarak kullanın.
<ol><li>Yumuşak-agar plaka hazırlığı NOT: Yumuşak-agar, motility- veya yüzme-agar olarak da adlandırılır, düşük yüzdeli bir agardır (~0.2-0.35% w / v), uzun zamandır kemotaksi31,32'yi test etmek için kullanılır.<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 3 g bacto-agar (%0,3 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O (çift damıtılmış su) ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki çubuk/ plakayı kullanarak hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Sıcaklık yaklaşık 50 ° C'ye ulaştığında, steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve erimiş agarın 16 saat içinde kullanılmak üzere en az 1 saat boyunca kapakla ayarlanabilmesini sağlar.</li>
	</ol></li>
	<li>Baskılayıcı mutantların kültür hazırlığı, aşılanması ve izolasyonu NOT: Yumuşak agar ile katılaşmış besin zengini medyanın merkezinde aşılanan E. coli, besinleri yerel olarak tüketerek takip ettikleri bir besin gradyanı oluşturur. Dışa doğru ilerledikçe, bakterilerin yanıt verdiği belirli kemoattantlarla ilişkili tanımlanmış 'halkalar' ortaya çıkar (Şekil 1A). Kemotaksi sistemindeki veya flagella motorunun yapısal bileşenlerindeki kusurlar bu testte performansı tehlikeye atabilir. Genellikle, hareketlilik avantajı olan mutantlar tarama sırasında ortaya çıkar ve halkanın çevresi boyunca tek veya birden fazla noktadan, 'alevlendikleri' yerden ortaya çıktığı görülebilir (Şekil 1C). Yüzme cephesinin en dış kenarının, kavunlanmamış bakire yumuşak agar'a karşı kolayca zıt olduğunu fark edecektir.<ol>
<li>Yatay sallama (220 r.p.m.) ile 30 °C'de 5 mL Lennox Suyunda (LB; 10 g/L tripto, 5 g/L maya özü ve 5 g/L NaCl, Malzeme Masası)istenen hareketlilik eksikliği olan suşun geceleme kültürlerini büyütün. Ertesi gün, taze LB'de alt kültür (1:100 seyreltme), üstel faza aynı koşullar altında büyür(OD 600 / 0.6).</li>
		<li>Kültürün 6 μL'sini pipet kullanarak yumuşak bir agar plakasının (1.1) ortasına aşılayın, yüklü steril ucu içeriği hafifçe dışarı çıkarmak için ağar içine itin. 30 °C'ye aktarın ve kuluçkaya yatırın (Şekil 1B), hareketlilik 'parlamaları' belirgin olana kadar, aşılama noktasından veya hareketlilik halkalarının çevresinden, tipik olarak 24-36 saat(Şekil 1C)olarak yayılana kadar. NOT: Hareketlilik tahlillerinde, karşılaştırma için mutant izolelerinin yanında vahşi tip bir suşu aşılar. Bu vahşi tip suş karakteristik eşmerkezli kemotaktik halkaları gösterecektir (Şekil 1A) ve plakayı 8-10 saat içinde dolduracaktır.</li>
		<li>Hücreleri 'parlama' bölgesinden kaldırmak için steril bir tel halka kullanın ve tek kolonileri bir LB sert agar plakasına arındırmak için çizgi kullanın (LB yukarıdaki gibi hazırlanmış, 15 g/L bacto-agar ile katılaştırılmış).</li>
		<li>Steril bir tel halkası kullanarak çizgi plakasından tek kolonileri seçin ve 'saf' bir koloni izolesinin izolasyonu için tek koloniler için çizgi çizerek yeniden arındırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bastırıcı mutantların onaylanması ve karakterizasyonu
	<ol>
<li>İzole bastırılmış mutantların hareketliliği geri yüklediğini onaylayın. Yumuşak agar plakaları (1.1) ve kültürleri, vahşi tip ve karşılaştırma için başlangıç 'hareketlilik eksikliği' suşu da dahil olmak üzere ilgi suşları (1.2.1'de olduğu gibi) için hazırlayın.</li>
		<li>Plakaları aşılayın (1.2.2'de olduğu gibi) ve 8-10 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>En dıştaki halkanın çapını (dairenin kenarı) kaydedin ve hangi izolelerin hareketliliği önemli ölçüde geri yüklediğini belirlemek için karşılaştırın. NOT: Plakaların deneyin zaman dilimi boyunca fotoğraf edilmesi önerilir. En iyi sonuçlar için, yüzme kolonisinin çapını ölçmek ve sömürgeleştirilmemiş agardan ayırt etmek için daha iyi aydınlatma için bir ışık kaynağının üzerine dijital kamera monte edildiği bir "ışık kovası" cihazı30kullanın.</li>
		<li>Denek, WGS'ye gerektiği gibi izole edilerek, vahşi tip fonksiyonu geri getiren mutasyonları pozitif olarak tanımlamak için yeterli 'sıra kapsamı' sağlar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Flagella motor davranışını hücre bağlama ile ölçme
NOT: Normal çalıştırma-takla davranışı (kemotaksi) tehlikeye atılmış gibi göründüğünde bu yöntemi kullanın.
<ol><li>
Kültür hazırlama ve flagella makaslama
	<ol>
<li>Adım 1.2.1'de açıklandığı gibi, ilgi gerginliğinin üstel bir faz kültürünü hazırlayın.</li>
		<li>Pellet 10 mL hücre, 10 mL filtre sterilize Motility Buffer (MB) ile yeniden canlandırmadan önce 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleme ile hücre; 10 mM potasyum fosfat tamponu [0.0935 M K2HPO4, 0.0065 M KH2PO4, pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl). NOT: MB hareketliliğidestekler, ancak bakteri üremeyi desteklemez</li>
		<li>Son peletin 1 mL MB olarak yeniden sünülene kadar 2.1.2 adımını iki kez daha yineleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu 1 mL şırıngaya aktarın ve sonuna 23G iğne takın. Aynı şırınga/iğne aparatını monte edin ve ikisini her iğne ucuna sıkıca sarılmış 6 inç polietilen boru (iç çapı 0,58 mm) ile birbirine takın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonu bir şırıngandan diğerine 50x'e hafifçe geçirerek flagellayı kesin (kırılgandırlar ve kolayca kırılırlar) ve her 10 geçiş arasında 1 dakika duraklama olur.</li>
		<li>Yamulmuş hücreleri 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj edin ve 500 μL MB'lık son hacimde yeniden biriktirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slayt hazırlama ve hücre bağlama
	<ol>
<li>Çift taraflı bantla ayrılmış 3 inç x 1 inç x 1 mm cam mikroskop kaydırağı üzerine 18 mm x 18 mm kapak örtüsü istifleyerek bir hücre sabitleme odası hazırlayın (Şekil S1).</li>
		<li>Haznenin üstüne uygulayarak hazneyi %0,01 (w/v) polilizin çözeltisi ile yıkayın. Çözeltinin hazneden(Şekil S1)çiz çekilmesine yardımcı olmak için alt kenarı (kapak altlığı mikroskop kaydırağıyla yıkama) bir görev silecekine (kağıt mendil) eğin. Daha sonra oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>2.2.2 adımında açıklandığı gibi 40 μL MB ile hazneyi üç kez yıkayın</li>
		<li>Odanın üstüne 40 μL yamluk hücre süspansiyonu ekleyin (yukarıda hazırlanmıştır) ve hücrelerin kapak kapağına takılmasını sağlamak için oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.</li>
		<li>Eklenmemiş hücreleri çıkarmak için hazneyi 2.2.3'te olduğu gibi 40 μL MB ile hafifçe yıkayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre dönüşü kaydı ve nicelleştirme
	<ol>
<li>Bağlı hücrelerle yüklenen mikroskop kaydırağı mikroskop aşamasına aktarın.</li>
		<li>Faz kontrastlı mikroskopi ve 100x hedefi kullanarak, popülasyonu yerinde sabitlenmiş hücreler için tarayın ve tek bir eksende döndürün, yani hücrenin odak içinde ve dışında hareket ettiği bir açıda sunmak yerine sabit bir noktada düzgün dönüşler (Video 1).</li>
		<li>Ticari bir mikroskop ve ilişkili kamera kullanın. İlişkili yazılımı açın, ilgi çekici hücrelerin odakta olduğundan emin olun ve hücre dönüşünü bir dakika (saniyede 10 kare veya daha yüksek) kaydetmek için video alımını tıklayın.</li>
		<li>Video oynatmadan, dakikadaki tam döndürme sayısını ve hücrenin yön değiştirme sayısını (anahtarlama sıklığı) ölçün. NOT: Dönme hızları ve anahtarlama frekansı gözle ölçülemeyecek kadar hızlı olabilir, bu nedenle yavaş / ince oynatma sunan veya dönme modellerini ölçmek için otomatik bir yazılım sistemi benimseyen video yazılımı kullanılması önerilir33. Bir alternatif, daha hızlı bakterilerin dönüşünü yavaşlatmaya ve çözmeye yardımcı olmak veya düşük kare hızlarına sahip kameralar kullanımda olduğunda telafi etmek için metil selüloz (veya benzeri bir ajan) kullanarak MB'nin viskozitesini artırmak olacaktır.</li>
		<li>İlgi popülasyonunun bir temsilini derlemek için biyolojik çoğaltmalarla 2.3.2 adımını yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sınır kapısında sürülerin hazırlanması
NOT: Bir mutasyonun veya durumun grup hareketliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek için bu yöntemi kullanın. Swarm-agar, yüzdenin genellikle yumuşak agardan daha yüksek olduğu agarı ifade eder. Yumuşak agarda (%0.3), hücreler agarın içinde ayrı ayrı yüzer. Sürü agarında (%0,5 ve üzeri), hücreler yüzeyde bir grup olarak hareket eder. Sürü plakalarının burada ayrıntılı olarak kullanılması gerekirken, yüzme plakaları daha uzun raf ömrüne sahiptir ve birkaç gün kullanılabilir. Kişisel tercihimiz 1-2 gün içinde kullanmaktır.
<ol><li>
Sürü agar hazırlanması
	<ol>
<li>2 L yuvarlak alt şişeye 5 g Eiken agar (%0,5 w/v) ve 20 g LB ekleyin. Şişeye 1 L DDH2O ekleyin ve bir karıştırma çubuğu ve manyetik karıştırma plakası kullanarak süspansiyonu eşit şekilde karıştırın.</li>
		<li>121 °C'de 20 dakika otoklav.</li>
		<li>Yukarıdaki gibi çubuğu / plakayı kullanarak hava kabarcıklarını önlemek için hafif ajitasyonla soğumaya bırakın. Yaklaşık 50 °C olduğunda, % 0,5'lik son konsantrasyon için filtre sterilize edilmiş glikoz ekleyin.</li>
		<li>Steril Petri kaplarına (100 mm x 15 mm) 25 mL dökün ve oda sıcaklığında en az 14 saat ve en fazla 20 saat ayarlayın. İleride kullanmak üzere saklamayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sürü plakalarının aşılanması ve inkübasyonu
	<ol>
<li>Asgarın üzerine tespit larak orta üssel bir kültürün (1.2'de olduğu gibi hazırlanan) 6 μL'yi aşıla.</li>
		<li>Kapağı 5-10 dakika bekletin ve inoculum agar yüzeyine kuruduğu zaman değiştirin.</li>
		<li>8 saat boyunca 30 °C'de kuluçkaya yatırın. Agarın kurumasına katkıda bulunacağı ve kaynamayı bozacağı için kapağı çıkararak sürü ilerlemesini inceleme cazibesinden kaçının. NOT: Kuluçka süresi gerinim fenotipine bağlı olarak değişebilir. Bazı izole mutasyonlar kaynama yeteneğini engelleyebilir ve daha az agar yüzdesi veya daha uzun bir kuluçka süresi gerektirecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sınır geçişi tahlil plakalarının hazırlanması NOT: Bu tahlil, plastik bir bölmenin (kenarlık) bir yerine iki odacık oluşturduğu modifiye edilmiş bir Petri kabı kullanır (Şekil 2A). Her oda diğer odadan bağımsız olarak hazırlanabilir ve ikisini 'bağlamadan' önce kaynama için farklı koşullar sunar. Deneysel tasarıma bağlı olarak, ilk oda (solda belirtilen) yüzme agarı (%0,3 w/v) veya sürü agar (%0,5 w/v) ile hazırlanabilir, burada bakteriler sınır boyunca sürü agar +/- gerekli herhangi bir takviye veya zorluk (örneğin, antibiyotikler) içeren sağ odaya göç edebilir. Her iki agar üzerindeki göç tipik olarak, orijinal aşılama noktasından en geniş bakteri kolonizasyonu çapı (kenardan kenara) kaydedilerek ölçülür/karşılaştırılır.<ol>
<li>Gerekirse 1.1'de açıklandığı gibi yüzme agarı hazırlayın.</li>
		<li>3.1'de açıklandığı gibi sürü agar hazırlayın.</li>
		<li>Çift bölmeli petri kabının (100 mm x 15 mm) sağ odasına, odalar arasındaki plastik bölücü ile aynı seviyede olan, ancak sola taşmayan noktaya kadar ~30 mL sürü agar (gerekirse istenen takviye ile) dökün (Şekil 2B).</li>
		<li>Agar sertleştikten sonra, sol odayı ~ 30 mL yüzme veya sürü agar ile doldurun, yine plastik bölme ile temas noktasına (Şekil 2C). Ayarlmadan önce, iki tarafı bölmenin tüm uzunluğunu kapsayan ~1 mm yüksekliğinde bir agar köprüsüne bağlamak için agar'ı yavaşça sınır boyunca sürüklemek için steril bir pipet ucu kullanın (Şekil 2D).</li>
		<li>Plakanın oda sıcaklığında (3,1) kurumasını bekleyin. NOT: Köprü oluşturmanın alternatif bir yöntemi, sol oda agarının kurumasına ve daha sonra iki oda arasında köprü oluşturmak için plastik bölücü boyunca ~100 μL erimiş sürü agarının yavaşça pipetlemesine izin vermektir (3,4). Yüzme (1.2.2) veya sürü (3.2) agar için yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmış olarak, 12-16 saat boyunca 30 ° C'de kuluçkaya yatırmadan önce veya sürüler ilgi gerginlikleri arasında karşılaştırmalara izin vermek için sağ oda üzerinde yeterli ilerleme sağlayana kadar sol odadaki plakaları aşılayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Baskılayıcı mutasyonların izolasyonu ve karakterizasyonu, kemotaksi sistemi 35,36,37'nin ve motor makinelerinin kendisinin38,39,40'ıntemel bileşenlerinin tanımlanmasına başarıyla katkıda bulunmuştur. Protokol 1'i kullanırken, hareketlilik kaybını telafi edebilecek büyük bir olası mutasyon spektrumunun izolasyonu sağla...

Bakteriler ekolojik nişlerinde hareket ve dağılım için birçok uzantılar istihdam eder1. Flagella tahrikli hareketlilik bunların en hızlısıdır, çevre sinyallerine yanıt olarak elverişli yerellerin kolonileşmesini teşvik eder ve bazı türlerin patojenik yeteneğine önemli ölçüde katkıda bulunan2,3. Flagellated bakteriler toplu sıvı içinde ayrı ayrı yüzebilir veya yarı katı bir yüzey üzerinde kolektif olarak sürünebilir4. Hücre dışıflagella, dönüş1, 2 ,4,5,6,7,8'e neden olan tork oluşturmak için iyongradyanlarınıngücünden yararlanan membrana gömülü döner motorlara takılır ve tahrik edilir. Motorları sabit tork9'daçalışan E. coli'demotor çıkışı, dönme hızı ve rotorun saat yönünün tersine (CCW) ve saat yönünde (CW) yönler arasında değiştirilmesi açısından kategorize edilebilir. CCW dönüşü, hücreyi ileriye doğru iten tutarlı bir flagellar demetin oluşumunu teşvik ederken (çalıştır), dönme yönünde (CW) geçici bir anahtar, demetin kısmen veya tamamen10'usökmesine ve hücrenin yüzme yönünü yeniden yönlendirmesine (yuvarlanma) neden olur. E. coli genellikle bir saniye koşar ve saniyenin onda biri için yuvarlanır. Rotorun veya 'takla önyargısının' anahtarlama frekansı kemotaksi sinyal sistemi tarafından kontrol edilir, burada transmembran chemoreceptors harici kimyasal sinyalleri algılar ve çekicilere yanıt olarak çalıştırmaları uzatmak veya toksik kimyasallara yanıt olarak bastırmak için fosforelay ile flagellar motora iletir11,12. Yüzme hareketliliği% 0.3 yumuşak agarda test edilir.
Kaynama sırasında bakteriler, bakteri paketlerinin sürekli dönen bir hareketle aktığı yoğun bir kolektif olarak yarı katı bir yüzeyde gezinirken2,13,14,15. E. coli sürüleri, dökme sıvıda yüzen hücreler üzerinde değiştirilmiş kemosentezör fizyoloji (daha düşük yuvarlanma önyargısı), daha yüksek hızlar ve antimikrobiyallere karşı daha yüksek tolerans sergiler16,17. Swarmers, yüzey aktif madde üretimi, hiperflagellasyon ve hücre uzaması2dahil olmak üzere harekete yardımcı olan çok sayıda stratejinin dağıtımında değişir. Swarming bakterilere hem ekolojik hem de klinik ortamlarda rekabet avantajı sunar18,19,20. Kaynayan bakterilerin iki kategorisi vardır: sadece% 0.5-0.8 agar ile katılaşmış medyaya sürülebilen ılıman sürüler ve daha yüksek agar konsantrasyonlarında gezinebilen sağlam sürüler21.
Yüzme hareketliliğini ve düzenlemesini sorgulamak için çeşitli tahliller mevcuttur. Mutasyonlar veya çevresel koşullar nedeniyle bozulduğunda, hareketliliğin kendisi fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonları tanımlamak için güçlü bir seçim sunar. Bu bastırıcılar, orijinal mutasyonun gerçek geri dönüşleri veya ikinci bir mutasyonun işlevselliği geri yüklediği sözde geri dönüşler olabilir. Bu tür mutantlar tüm genom dizilimi (WGS) ile tanımlanabilir. Tarafsız baskılayıcı seçimine bir alternatif, önyargılı hedefli bir mutajensis stratejisidir (örneğin, PCR mutajensis). Bu metodolojiler genellikle hareketlilik aparatının işlevine veya çevre düzenlemesine ışık tutar. Amaç motor fonksiyonu incelemekse, yumuşak agarda ölçülen vahşi tip hareketliliğin restorasyonu mutlaka vahşi tip motor çıkışının restorasyonunu göstermeyebilir. Hücrelerin tek bir flagellum tarafından cam yüzeye tutturulduğu ve hücre gövdesinin dönüşünün daha sonra izlendiği hücre bağlama tahlili, motor davranışı değerlendirmek için tercih edilen ilk test olabilir. Motor özelliklerini izlemek için artık daha sofistike metodolojiler mevcut olsa da, hareket analizi için gerekli yüksek hızlı kamera kurulumu ve yazılım paketlerinin uygulanması yaygın kullanımlarını sınırlar22,23,24,25. Hücre bağlama tahlili sadece flagellanın yamumasını gerektirir, bu da kısa filamentlerin cam bir slayda bağlanmasına izin verir ve ardından hücre gövdesinin dönüşünü videoya ekler. Kaydedilen motor hızları, hücre gövdesinin flagellum üzerinde uyguladığı yüksek yük nedeniyle bu testte düşük olsa da, bu test yine de kemotaktik yanıtlar26 , 27,28,29hakkında değerli içgörülere katkıda bulunmuştur ve aşağıda tartışıldığı gibi geçerli bir araştırma aracı olmaya devam etmektedir.
Kaynayan hareketlilik araştırmacılar için farklı zorluklar doğurur. fonksiyon kazancı bastırıcıların seçimi sadece bol miktarda yüzey aktif madde üreten ve kolayca sürü13. E. coli gibi yüzey aktif olmayan üreticiler, agar seçimi, medya bileşimi ve ortamın nemi ile ilgili titizdir2,13,14,21. Kaynama koşulları belirlendikten sonra, sınır geçişi tahlil17, bir sürünün yeni / zorlu koşullarda gezinme yeteneğini sorgulamak için yararlı bir metodolojidir. Aşağıda sunulan protokoller E. coliile ilgili olsa da, diğer türlerde uygulama için kolayca uyarlanabilirler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Dehydrated Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0140-15-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-002-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eiken agar</td>
			<td>Eiken Chemical Co. Japan</td>
			<td>E-MJ00</td>
			<td>Essential for E. coli swarming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D (+)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>410955000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB (Lennox) Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1427-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18-605-496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP362-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP363-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent software for microscope used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-285-28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX53 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>For soft-agar assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>9908265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89200-944</td>
			<td>For border-crossing assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-826A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringe - 1 mL</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Task/Tissue wipes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Or equivalent single use tissue wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XM10 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XM10</td>
			<td>Or equivalent microscope camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

Hareketlilik birçok bakteri türünün hayatta kalması ve başarısı için çok önemlidir. Sinyal yollarını anlamak, flagellar parçaların işlevini ve montajını aydınlatmak ve hareket kalıplarını incelemek ve anlamak için hareketlilik yararlanmak için birçok metodoloji vardır. Burada bu metodolojilerden üçünün bir kombinasyonunu gösteriyoruz. Yumuşak agardaki hareketlilik en eskidir ve hareketliliğin ikinci bir mutasyonla geri yüklendiği hareketlilik bozulmuş suşlarda fonksiyon kazancı baskılayıcı mutasyonlarını izole etmek için güçlü bir seçim sunar. İlk olarak flagellar motorun döner doğasını göstermek için kullanılan hücre bağlama tekniği, sinyal efektörlerinin motor hızı üzerindeki etkisini ve dönme yönünü değiştirme yeteneğini değerlendirmek için kullanılabilir. "Sınır geçişi" tahlilleri, yüzme bakterisinin topluca sürü olarak hareket etmeye geçiş için astarlanabileceği daha yenidir. Birlikte, bu protokoller hareketlilik makinelerinin bileşenlerini tanımlamak ve yüzme ve kaynaşma farklı fasetlerindeki rollerini karakterize etmek için sistematik ve güçlü bir yaklaşımı temsil eder. Diğer bakteri türlerinde hareketliliği incelemek için kolayca uyarlanabilirler.

Hareketlilik sinyal molekülü c-di-GMP'nin yüksek seviyeleri tarafından bozulan bir E. coli suşundaki sözde geri dönüşlerin izolasyonu, laboratuvarımızdan yapılan son çalışmalarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır34. Bu suş (JP1442) iki mutasyon barındırır:Δ yhjH ve ΔycgR. YhjH, E. coli'dec-di-GMP'yi düşüren en aktif fosfodiesterazdır. YhjH'nin yokluğu c-di-GMP seviyelerinin yükselmesine ve hareketliliğin inhibisyona yol açar. Yc...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Bir Seride Üç Yerleşik Teknik Uygulayarak Escherichia coli'de Flagella Odaklı Hareketliliği Araştırmak

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

investigating-flagella-driven-motility-escherichia-coli-applying

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.4K Görüntüleme.  The University of Texas at Austin. Birçok bakteri, çevrelerinde gezinmek ve hem bireysel hem de kolektif olarak elverişli çevreyi kolonileştirmek için flagella tahrikli hareketliliği kullanır. Burada, yüzmeye ve kaynayan hareketliliklere katkıda bulunan bileşenleri / yolları tanımlamak için hareketliliği bir seçim aracı olarak kullanan üç yerleşik yöntemin kullanılması gösterilmiştir.

Video: Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Etkinlik Ölçüm Bir Testi Escherichia coli Lizin Decarboxyase Đndüklenebilir

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Biyoloji

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Mantar Endoglucanase Faaliyet Yüksek Verimli Tarama Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Bir uygulama için Protokoller<em&gt; Escherichia coli</emSentetik Biyoloji&gt; Tabanlı TX-TL Hücre-Özgür İfade Sistemi

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

Live Algılama<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: PMA-qPCR H7 Hücreler

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.