Bu çalışmada NSF (HBCU-UP araştırma başlatma Ödülü, HRD 1401426 ve EPSCoR EPS-0814251) ve NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1) tarafından desteklenmektedir. K.S. Delaware INBRE-III 6404 bir bursu tarafından desteklenmektedir.

Aşağıda belirtilen iletişim kuralı etkileri BPA maruz kalma sırasında (erken) embriyo test etmek için standart ve bit/sn, BPF veya diğer EDC piliç embriyonik nöronlar içinde kullanılmak üzere değiştirilebilir.
Bu iletişim kuralı Delaware Eyalet Üniversitesi Kurumsal ilkeleri ve kuş embriyo NIH poliçesinin izler. Protokol Ayrıca onay DSU'ın malzeme ve kimyasal güvenlik yönergeleri ile mevcuttur.
1. malzeme Kur
<ol><li>BPA (m.w. 228.29) % 10 etanol (v/v) yapmak a 1 mM hisse senedi eriyik (mL % 10 etanol 0,23 mg) suda çözülür. Sonraki dilutions (0,1 µM, 0.5 µM, 1 µM, 5 mikron ve 10 µM) neurobasal ortamda yapmak. Dikkat: BPA çevresel bir toksindir ve bakım tozu ele alırken edilmelidir.</li>
	<li>Piyasada bulunan bir masa üstü kuluçka 37 ° C'de piliç yumurta kuluçkaya Yumurta E7 embriyo 7 gün kuluçkaya.</li>
	<li>3-4 h için % 70 etanol ıslatarak bana gerekli sayıda ölçü birimi Sterilize hazırlamak ve sonra üç kez içinde yaklaşık 10 mL steril distile su BSLII Hood durulayın. Not: Bana bir 8 x 8 kılavuz düzenlenmiş 64 nanoporous Platin elektrotlar içerir. Elektrot çapı 30 µm ve elektrotlar arasındaki aralığı 200 µm. Denatüre etanol gibi bu MEA korozyona yol açacaktır Guinan sterilizasyon için kullanmayın.</li>
	<li>(Steril koşullar korumak için) bana kapak ile steril bir kap içine yerleştirin ve bir masa üstü kuluçka için hareket. En az 6 saat 55 ° C'de pişirin Bu uygun sterilizasyon için kritik bir adımdır ve sıcaklık 60 ° C. geçmemelidir Kısırlık Bakımı, bana BSLII hood için depolama için daha fazla kullanımı kadar içeren yemek taşımak. Not: Biz plastik kapak ile bir fırın güvenli cam pişirme çanağı kullanın ve yüzey sterilize % 70 etanol ve kurutma için BSLII hood yerde.</li>
	<li>Aliquot ekstra hücresel matris ECM çözümü. Şişeyi 4 ° C'de gecede çözülme ve 100 µL aliquots-20 ° C'de dondurmak Not: ECM donmuş sevk edilir. ECM oda sıcaklığına kadar hazır oda sıcaklığında polymerizes ve sonra polimerli, bu ceket için imkansız gibi kat için getirilmelidir değil. ECM büyüme faktörleri olmadan Bilinmeyen faktörler nedeniyle ek etkileri önlemek için tercih edilir.</li>
	<li>Tüm diseksiyon aletleri (Dumont #5 forseps, kıvrımlı pensler, küçük makas ve bahar makas) sterilize ve kendinden contalı malzeme diseksiyon yemekleri % 70 etanol ile kaplı ve koyup diseksiyon mahallede kuruyuncaya kadar bırakın.</li>
</ol>2. piliç embriyonik nöron kültürü ve ağ etkinliğini
<ol><li>Kaplama günü, bir şişe kaldırmak % 70 etanol ile-20 ° C-dondurucu dan ECM sprey ve Buza koyun. % 25'e 300 µL soğuk neurobasal orta BSLII hood içine ekleyerek sulandırmak.</li>
	<li>Bir P200 pipetteman eklemek 100 µL % 25 ECM elektrotlar dokunmaya değil ve yüzeyde ince bir film ayrılmadan hemen kaldırmak için dikkat çekici MEA ortasına. MEA kapak ve nöronlar plaka için hazır kadar CO2 kuluçka (37 ° C ve % 5 CO2) yerleştirin.</li>
	<li>E7 yumurta (embriyonik gün 7, 7 gün süreyle 37 ° C'de inkübe) dış kabuğunun % 70 etanol ile sterilize. Embriyo soğuk steril Hank'in dengeli tuzlar çözüm (HBSS) kalsiyum olmadan içeren bir Sylgard alt diseksiyon çanak içine başını kesmek. Göz çevresi kesmek ve gözbebekleri kaldırın. DuMont #5 kullanarak ince forseps ve bahar makas ventral tarafta bir kesi yapın ve dış katmanlarını deri ön ve optik tectum ortaya çıkarmak için kaldırın. Soyma ve pial membran dikkatli bir şekilde çıkarın. Ön başka bir petri kabına aktarın ve bahar makasla yaklaşık 2 mm küçük parçalar halinde kes. Not: Değil herhangi bir kan damarları için ön pial membran çıkarıldıktan sonra bağlı olmalıdır. Aletleri ve diseksiyon alanı iyice % 70 etanol ile sterilize sürece bir başlık dışında diseksiyon gerçekleştirildiğinde oldukça iyi sonuçlar elde varsa, diseksiyon bir steril diseksiyon başlık, gerçekleştirmek için tercih olsa da .</li>
	<li>Steril transfer pipet kullanarak, bir 15 mL santrifüj tüpüne ön parçaları toplamak ve HBSS mümkün olduğunca daha fazla ön lavabo santrifüj tüpü dibine parçalarını icar sonra kaldırın.</li>
	<li>1 mL % 0.05 ekleyin tripsin/EDTA (37 ° C için önceden ısındı) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca kuluçkaya.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak, dikkatle doku parçaları bozmadan tripsin kaldırın ve 1 mL neurobasal orta ekleyin. Doku Lavabonun altına parçaları izin ve orta kaldırın. Bu yıkama bir kez daha yineleyin. Bu adım tripsin/EDTA yıkayın etmektir.</li>
	<li>Neurobasal orta 2 mL ekleyin ve triturating başlar. Toz steril bir yangın cilalı Pasteur pipet alarak ve doku yok daha fazla parçalar görülür kadar doku o ile birkaç kez hafifçe geçen içerir. Herhangi bir adet sonra tekrarlanan geçer kalırsa, sadece altına yerleşmek bırakın. Not: köpük oluşturmak, durup, aspirasyon tarafından kaldırmak - triturating süre renginde solma kaçının.</li>
	<li>Yeniden askıya alınan hücreler 1:10 neurobasal orta ile sulandırmak ve hücrelerin Trypan mavi boya ve bir hemasitometre kullanarak say. Mix 50 µL 0.5 mL santrifüj tüpü Trypan mavi çözümün 50 µL ile seyreltilmiş hücre. Coverslip koyduktan sonra hemacytometer için 10 µL ekleyin ve parlak açık hücreleri (mavi hücreler öldü ve yok sayılması) saymak. Not: Tipik cep numaraları 1 ile 5 x 107 hücre/mL arasında tek E7 optik tectum aralığından.</li>
	<li>Disosiye plaka ECM hücrelerdeyse 2200 hücreler/kare mm bir yoğunluk Guinan kaplı. MEA sistemimiz için bu MEA başına yaklaşık 130.000 hücre çevirir. Birim içinde MEA için 1 mL getirmek ve CO2 kuluçka hücre eki ve neurite (şekil 1) uzantısı için bir gecede bana yer neurobasal orta ekleyin. Not: Farklı alanlarda ve elektrot numaraları Guinan farklı hücre yoğunluğu çalıştı - genel olarak, daha yüksek hücre yoğunluğu büyük ağ faaliyet sonuçları, ama aynı zamanda daha kısa ömürlü kültürler için yol açar.</li>
	<li>Ertesi gün, adım 1.1 için tedavi MEA yapılan 1 mM stoktan neurobasal ortamda 10 µM son bir konsantrasyon için BPA ekleyin. Denetime MEA, % 10 etanol aynı birim su (v/v) çözüm ekleyin.</li>
	<li>Harcanan orta neurobasal orta içeren 10 µM ile BPA her geçen gün 7 gün vitro (7DIV) ve bundan sonra her gün kadar ağ aktivite arttıkça değiştirin. Not: ağ aktivite arttıkça, metabolik aktiviteyi artırır ve medya değişikliklerini daha sık olması gerekir. Turuncu açmak orta izin vermeyin.</li>
</ol>3. kayıt nöronal ağ etkinliğini
<ol><li>Satın alma günü, taze neurobasal orta ile Kültür ortam değişimi ve ölçü CO2 kuluçka en az 2 h kayıt önce geri dönün. Kayıt yazılımı çalıştırın ve MEA sıcaklığı 37 ° C sıcaklık ikonuna tıklayarak ayarlayın (tamamlayıcı şekil 3.1a-b). Not: Kayıt günü 3 kaplama olarak erken başlayabilir ve kültürler hayatta olduğu sürece devam edebilirsiniz.</li>
	<li>(Altında akarsu sol pencerede Masası'nda) "Muse" ikonuna tıklayarak satın alma parametrelerini ayarlamak ve "işleme Ekle" ve "Spike dedektörü" seçin ve pencere açılır içinde Tamam'ı tıklatın. "Spike dedektörü (6 x STD)" dosya adının altında görünür (tamamlayıcı şekil 3.2a-b).</li>
	<li>Sonraki Spike Dedektör üzerinde sağ tıklayın, "İşleme Ekle" ve "Patlama dedektörü" seçin ve pencere açılır içinde Tamam'ı tıklatın. "Dedektör patlama" (ısı) Muse simgenin altında görünecektir (tamamlayıcı şekil 3.3a-b).</li>
	<li>Sonraki patlama Dedektör üzerinde doğru tıkırtı, seçme "Eklemek işleme" ve "Sinir istatistikleri derleyici." Pencere açılır, dosya üstbilgisi, de toplanan istatistikleri ve senkronizasyonu seçili olduğuna emin olun. Tamam'ı tıklatın. "İstatistikler derleyici"-ecek gözükmek altında (tamamlayıcı şekil 3.4a-b). Not: Bu adaptif eşik geçiş (6 x STD filtre), 100 ms arası spike aralıklarla sivri 5, 10 oranı algılama ateş demek en az sayıda ile ayarlar 20 ms bir senkronizasyonu parametrelerinin ve 0.083333 sivri min başına en az spike oranda s.</li>
	<li>Zamanlanmış kayıt kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms) için alt saat simgesine tıklayarak ayarlayın. Bu 5.1 dakikada kaydetmek ve 5 dakika boyunca kaydetmek için ayar bölümünde yer alan bilgileri değiştirerek elde edilir. Bu hemen başlatılır ve bir kez yürütülür (tamamlayıcı şekil 3.5).</li>
	<li>MEA sıcaklığı 37 ° C MEA taşımadan önce ulaştığını emin olun. MEA kuluçka makinesi kaldırmak, kayıt biriminde yer ve MEA kilitleyin. Ağ etkinlik başlangıç kayıt zamanlanmış kayıt bölümünde ya da "Dosyayı yürütmek" penceresinde kayıt simgesini tıklayarak kayıt işlemini başlatmak. 10 dakika daha uzun kayıtları elde edilebilir, ancak genellikle, bir kayıt süresini 5 dakika (300.000 ms), yeterlidir.</li>
	<li>Kaydettikten sonra bana da kuluçka için dönmek. Not: MEA İnkübatör dışında zaman en aza indirmek için ve kısırlık korumak için özen göstermelidir.</li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>Çevrimdışı kayıt yazılımı kullanarak ham veri analizi yapılabilir. Dosya açılır menüsü tıklayın ve kayıt açık. Çözümlenmesi için ham veri dosyası seçin. Gerekli spiking parametreleri yakalamak için ham kayıtlar tekrarlanır.</li>
	<li>Sivri ortalama sayı elde etmek için Spike dedektörü modülü kullanmak ve senkronizasyonu dizini elde etmek için sinirsel istatistikleri derleyici modülü kullanmak.</li>
	<li>Spike dedektörü, patlama dedektörü ve istatistik derleyici modül olarak daha önce (Bölüm 3) yükleyin.</li>
	<li>Spike bulmak, patladı dedektörü ve istatistik derleyici modülü windows içinde aşağı açılır menülerden Spike listesi, ağ veri bloğu liste ve ölçümleri, Gelişmiş seçmenizi sağlar.</li>
	<li>Bir .csv dosyası yönettiği klasöründe oluşturur veri dosyası kaydetmeye başlamak için kayıt düğmesini tıklatın. Spike parametreleri - toplam sayısı sivri ve senkronizasyonu dizin - .csv dosyasında kaydedilir. Not: Bu işlemci zamanını ve hesaplama kaynaklarını tüketmek gibi gerçek zamanlı analiz ham veri kaydederken tavsiye edilmez.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+agonists,+17+beta-estradiol,+bisphenol+A,+and+diethylstilbestrol,+decrease+cortactin+expression+in+the+mouse+testis.">Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis.</a> Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).</li><li>Dodds, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+oestrogens.">Synthetic oestrogens.</a> Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).</li><li>Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weak+estrogenic+transcriptional+activities+of+Bisphenol+A+and+Bisphenol+S.">Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S.</a> Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).</li><li>Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenocarcinoma+of+the+vagina:+association+of+maternal+stilbestrol+therapy+with+tumor+appearance+in+young+women.">Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women.</a> New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).</li><li>Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+exposure+to+bisphenol+A+increases+dimethylbenzanthracene-induced+mammary+cancer+in+rats.">Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats.</a> Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).</li><li>Okada, A., Kai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estradiol-17beta+and+bisphenol+A+administered+chronically+to+mice+throughout+pregnancy+and+lactation+on+the+male+pups'+reproductive+system.">Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system.</a> Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).</li><li>Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+developmental+exposure+to+bisphenol+A+on+brain+and+behavior+in+mice.">Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice.</a> Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).</li><li>Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans.">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).</li><li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germLine+and+causes+chromosome+abnormalities.">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities.</a> Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).</li><li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults.">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27 (2015).</li><li>Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+GermLine+Function.">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function.</a> PLOS Genetics. 12 (7), 1006223 (2016).</li><li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Synchronous+Oscillations+in+Freely-Organized+Small+Neuronal+Circuits.">Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits.</a> PLoS ONE. 5 (12), 14443 (2010).</li><li>Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+Oscillating+Population+Activity+in+Developing+Cortical+Networks:+Models+and+Experimental+Results.">Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results.</a> J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).</li><li>Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+Biochemical+Maturation+of+Neurones+Cultured+in+the+Absence+of+Glial+Cells.">Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells.</a> Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).</li><li>Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interneuronal+Synapses+Formed+by+Motor+Neurons+Appear+to+Be+Glutamatergic.">Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic.</a> NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).</li><li>Paiva, A. R. C., Park, I., Pr&#237;ncipe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Binless+Spike+Train+Measures.">A Comparison of Binless Spike Train Measures.</a> Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).</li><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Rat+Glioma+Growth,+Invasion,+and+Vascularization+in+a+Novel+Chick+Embryo+Brain+Tumor+Model.">Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li><li>Chiappalone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociated+cortical+networks+show+spontaneously+correlated+activity+patterns+during+in+vitro+development.">Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development.</a> Brain Res. 93, (2006).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+recording+on+multi-electrode+array+reveals+degraded+inhibitory+connection+in+neuronal+network+development.">Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development.</a> Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Hızlı büyüme ve embriyogenez gibi geliştirme aşamalarını BPA de dahil olmak üzere çeşitli endokrin engellemeden bileşikler zararlı etkilerini özellikle güvenlik açığından etkilenir. Detaylı iletişim kuralları etkileri BPA maruz kalma bir vitro omurgalı nöronal ağ modeli eğitim için sağlar. Bu iletişim kuralını kullanan, BPA spike oranı yanı sıra gelişmekte olan nöron ağları (Şekil 2a-b) senkronizasyonu dizinde düşürür kurdu.
Metodolojimiz BPA maruz kalma sırasında erken embriyogenez çalışmak için tasarlanmış ve kolayca diğer EDCs etkileri çalışmaya adapte edilebilir. Civciv embriyonik nöronal kültürler fare veya fareyi de dahil olmak üzere diğer omurgalı modellerle karşılaştırıldığında kurmak nispeten kolaydır. Ayrıca, ayrı bir hayvan odası için bir gereksinim olduğunu — bir laboratuvar tezgah üzerinde basit bir kuluçka bu deneyleri taşımak için yeterli. Biz EDC, BPA, etkisi ağ etkinliğini değerlendirmek için bir çoklu elektrot sistemi (MEA) nasıl kullanılacağını açıklar. Burada açıklanan protokoller diğer sistemlere uygulanabilir. Önemli bir özelliği bu iletişim kuralı, kısırlık korumaktır. Bu embriyo steril koşullar altında diseksiyon içerir — % 70 etanol ve steril Hank'in dengeli çözüm tuzlar kullanımı ile aletleri sterilize yeterli. Bir hafta boyunca toplanan verileri gibi bana steril işleme korumak için önemlidir. Kez kurulan nöronal kültürler uzun vadeli - en fazla üç ay için kültürlü — ve böylece uzun vadeli maruz EDCs ve diğer bileşikler nöronal ağ üzerinde çalışmak için yararlıdır. Bu iletişim kuralı bir başka önemli yönü kaplama diseksiyon üzerinden vakti geldi. 30 dk kuluçka dokusunun tripsin ile de dahil olmak üzere, en iyi zamanı. Uzun geçen, hücrelerin yoksul hayatta kalma süre.
Biz burada, herhangi bir kimyasal veya davranış ve sinir işlevi etkiler uyuşturucu değerlendirilmesi için uygulanacak temel protokol tanımlamak. Burada, mm2başına 2.200 hücre hücre yoğunluğu kullandık; Ancak, bu değiştirilebilir ve diğer hücre yoğunluğu kullanılabilir. Genel olarak, hücre yoğunluğu artan ağ aktivite - daha kısa sürede daha fazla sivri artar bulduk. Yöntem tarif, ağ etkinliğinin değerlendirilmesi etkileri kimyasalların çok yararlı olsa da kısıtlamalar bulunmaktadır. Bir yöntemin en büyük sınırlamalar bu tüp bebek kültürleri iki boyutlu omurgalı beyin üç boyutlu mimari yansıtmıyor olabilir olmasıdır. Bu dilim kayıtları kullanarak üstesinden gelebilir. Başka bir alternatif tedaviler gelişmekte olan civciv embriyo tarafından uygulamak için yumurta15geniş sonuna kesip küçük bir pencere tedavi rejimi sonunda beynini incelememize, kalın bir vibratome bölümlerde yapmak ve MEA için üzerine yerleştirin. ağ etkinliğini kaydetme.
Bizim iletişim kuralı ağ etkinliğini geliştirme EDCs etkisi incelenmesi sağlar ve bir mekanik olarak bu kimyasalların etkileri için keşif sunmaktadır önemlidir.

4, 4 '-Isopropylidenediphenol, yaygın olarak Bisfenol-A atıfta veya BPA, bir anti-oksidan katkı polikarbonat zengin çeşitte bulundu ve epoksi reçine bazlı ürünler, termal kağıt arasında değişen CD ve paramparça geçirmez Cam, iç kaplanması İçecek kutular. BPA östrojen1taklit eden dağıtmak menajer endokrin anılmasına karşın, hasta etkileri BPA her gün rahat maruz üzerinde çalışmalar çoğunlukla son 10-15 yıl içinde dışarı geldi. BPA maruz kalma bile düşük düzeylerinin en derin embriyogenez aracılığıyla pozlama anneler2,3sırasında da dahil olmak üzere erken gelişimsel dönemlerde sonuçlarıdır. Kadın embriyolar rahim içinde maruz kimyasallar engellemeden endokrin da artan hastalığı duyarlılık vajinal meme kanseri4,5üzerinden bağlanmıştır. Hayvan çalışmaları atipik beyin yapısı ve fonksiyonel anormallikler davranış6' tecelli BPA maruz yol gösterdi. Sonuç olarak, bebek besleme şişe BPA kullanımında Avrupa ve Kuzey Amerika, FDA da dahil olmak üzere en düzenleyici kurumlar tarafından yasaklandı. Düzenlemeleriyle uyum sağlamak için birçok üretici 4, 4'-sulfonyldiphenol ya da Bisfenol-S (BPS) geçiş yaptınız. BPA ve BPS yapısal analogları ve son raporlar östrojenik transkripsiyon7' BPS karşılaştırılabilir potens gösterdi vardır dayanarak gerçeğine, bileşik bu göreceli olarak BPA toksisite eğitim önemlidir.
Burada nöronların omurgalı manken civciv embriyo kullanarak ağlar üzerinde BPA (ve diğer EDCs) etkilerini sınamak için bir protokol açıklayın. Vitro kültür nöronların sinaptik kişiler oluşturmak ve aksiyon potansiyelleri (ani olarak da bilinir) oluşturur. Bu kültürlerin spiking etkinlik çoklu elektrot dizi (MEA) sistemleri kullanılarak kaydedilir. Sivri 5 ms içinde oluştuğunda senkronizasyonu kabul edilir. Sonunda eşitler ilk rastgele spiking faaliyet nöronal ağları8,9geliştirme önemli bir özelliktir. Senkronizasyonu çeşitli yöntemlerle ölçülebilir ve çeşitli algoritmalar edebiyat9,10,11' açıklanmıştır. Bizim analizleri, MEA koordinat belirleme sistemi sürücüler kayıt yazılımı entegre Paiva ve iş12 tarafından geliştirilen bir algoritma kullanıyoruz. Sağlam spiking faaliyeti embriyonik piliç nöronların BPA etkisi neural ağ etkinlik13eğitim için bir prototip sağlar. Kayıt spiking etkinlik için çoklu elektrot dizileri kullanarak, BPA maruz kalma nöronal spiking senkronizasyonu9,14gelişimi inhibe görülmektedir. Burada, BPA maruz civciv embriyo nöronlar piliç embriyonik kültürlerde nöronal spiking senkronizasyonu geliştirme temsilcisi sonuçları ile birlikte kültür üzerinde çalışmak için detaylı bir metodoloji sağlamak.

<table style="border-collapse:collapse;width:903pt" width="1204">
	<colgroup>
		<col style="width:245pt" width="326" />
		<col style="width:164pt" width="218" />
		<col style="width:258pt" width="344" />
		<col style="width:237pt" width="316" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">#5 foreceps</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl20" style="width:258pt" width="344">11251-10</td>
			<td class="xl20" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Axion Muse MEA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Axion Biosystems</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">M64-GL1-30Pt200</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316">Will be called MEA system in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:245pt;height:31.5pt" width="326">Axis Software</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Axion Biosystems</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl19" style="width:237pt" width="316">Will be called recording software in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">BPA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">239658-250g</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">curved forceps</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">11272-50</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">EtOH</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">64-17-5</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Fertilized chicken eggs</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">from any local farm or Spafas</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344"></td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">HBSS</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">14170112</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Hemacytometer</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">&#160;02-671-6</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="40" style="height:30.0pt">
			<td class="xl22" height="40" style="width:245pt;height:30.0pt" width="326">Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">BD Biosciences</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">356231</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316">Will be called Extra Cellular Matrix (ECM) in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Neurobasal medium</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">BrainBits</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">Nb4-500</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Neuroexplorer statistical software</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Nex Technologies</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">Neuroexplorer version 5</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Pasteur pipettes</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">&#160;13-678-20A</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">spring scissors</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fine Science Tools</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">15514-12</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Sylgard bottom dissection dishes</td>
			<td class="xl19" style="width:164pt" width="218">Living Systems Instrumentaion</td>
			<td class="xl19" style="width:258pt" width="344">DD-90-S-BLK-3PK</td>
			<td class="xl19" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Trypan Blue dye</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl22" style="width:258pt" width="344">15-250-061</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl22" height="21" style="width:245pt;height:15.75pt" width="326">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl22" style="width:164pt" width="218">Fisher</td>
			<td class="xl23" style="width:258pt" width="344">15400054</td>
			<td class="xl22" style="width:237pt" width="316"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of the effects of endocrine disrupting compounds on the development of vertebrate neural network function using multi-electrode arrays

BIS-fenoller, bis-fenol A (BPA) ve BIS-fenol-S (bit/sn) gibi yaygın olarak kullanılan plastik ve çok sayıda günlük ürünleri üretiminde aracılar polymerizing. Endokrin dağıtmak bileşikler (EDC) estradiol benzeri özelliklere sahip olarak sınıflandırılır. EDCs, uzun süreli maruz kalma düşük dozlarda bile, erken gelişim dönemleri sırasında büyük güvenlik açığı ile kanser, davranış bozuklukları ve kısırlık, dahil olmak üzere çeşitli sağlık kusurları ile bağlantılı olmuştur. BPA nöronal fonksiyon gelişimi üzerine etkisi, biz erken piliç embriyonik beyin bir model olarak türetilen bir vitro nöron ağı çalışırdım. Bu maruz kalma bulduk BPA etkilenen ağ etkinliğini, gelişimi özellikle etkinlik ve eşitleme yükseliyor. Bir ilacın veya bileşik moleküler hedef ve davranış sonucu üzerindeki etkisi arasında çok önemli bağlantı ağ etkinliğini bir değişimdir. Çoklu elektrot dizilerin giderek ağ aktivite içinde in vitroilaç etkilerini incelemek için yararlı araçlar hale gelmektedir. Var birkaç sistemleri elde edilebilir içinde belgili tanımlık çarşı ve rağmen elektrotlar, türü ve elektrot dizi ve analiz yazılımı, temel temel ilkeleri, kalite farklılığı ve elde edilen veriler arasında aynıdır farklı sistemleri. Şu anda iki boyutlu vitro kültür analizi için sınırlı olmasına rağmen in vivo ağ etkinliğini beyin dilimleri içinde etkinleştirmek için bu MEA sistemleri geliştirilmektedir. Burada, embriyonik pozlama ve nöronal ağ etkinliğini ve senkronizasyonu, temsilcisi sonuçları ile birlikte kaydetmek için detaylı bir protokol sağlar.

Senkronizasyonu geliştirme civciv embriyo nöronal kültürlerde BPA etkisi incelenmiştir. Etkinlik spiking eşitleme nöronal ağları içinde vitronormal gelişimi bir göstergesidir. İki sivri 5 ms içinde oluştuğunda, onlar zaman uyumlu olarak kabul edilir. Vitro nöron kültürler başlangıçta rasgele spiking etkinliği görüntülemek — sivri ortaya rastgele ve arası spike aralıkları bir normal dağılım gösterir. Kültürler olgun, spiking etkinlik daha senkronize olur ve arası spike aralıkları sabittir. Zaman uyumlu spiking etkinliği bir kültürün çapraz korelasyon analizi spike senkronizasyonu dizin (SI) türetmek için yazılım12 kayıt kullanarak kez quantitated. BPA maruz kalma olumsuz azaltarak spiking etkinlik ve senkronizasyonu dizin (Şekil 2bir ve 2b) ağ etkinliğini geliştirme etkiler bulduk. Özet olarak, biz bir embriyo zararlı etkileri BPA maruz kalma kültür nöronlarda piliç senkronizasyonu geliştirilmesi yoluyla tespit edilebilir nöronal işlevi de dahil olmak üzere onun gelişme etkileri göstermiştir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg"> Şekil 1: Şematik diseksiyon piliç ön adımları ayrılma, kaplama ve ağdaki etkinliğini kaydetmek için tasvir Protokolü'nün. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg"> Resim 2: (A) sivri ortalama sayısı önemli ölçüde daha düşük BPA tedavi kontrol kültürler için karşılaştırıldığında E7 piliç ön kültürler. Sivri ortalama sayısı kayıt yazılımı kullanarak ayıklandı. Anlamına gelir (kontrolü, 14,890 ± 949.0, N = 15 ve BPA, 5,624 ± 465.9, N = 22) önemli ölçüde farklı olduğunu (unpaired t-Testi, p < 0.0001). (B) ortalama senkronizasyonu (SI) önemli ölçüde daha düşük dizinidir BPA tedavi kontrol kültürler için karşılaştırıldığında E7 piliç ön kültürler. SI sinirsel istatistikleri derleyici modülü içinde kayıt yazılımı kullanarak ayıklandı. SI anlamına gelir (kontrolü, 0.5159 ± 0.06547 N = 15 ve BPA, 0.1140 ± 0.01840 N = 22) önemli ölçüde farklı olduğunu (unpaired t-Testi, p < 0.0001). Hata çubukları standart sapma tasvir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Endokrin Bozucu Bileşiklerin Omurgalı Sinir Ağı Fonksiyonunun Gelişimi Üzerindeki Etkilerinin Çoklu Elektrot Dizileri Kullanılarak Değerlendirilmesi | Gelişim Biyolojisi | Video

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Çevresel toksinlere maruz akut gelişmekte olan embriyo etkileyebilir. Bisphenols sinir sistemi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu bilinmektedir gibi kimyasallar engellemeden endokrin. Burada bir vitro Omurgalılar (civciv embriyo) nöronal ağ modeli toksin pozlama erken embriyo üzerinde fonksiyonel etkisini incelemek için bir iletişim kuralı'nı açıklar.

Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Human Biology

Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

5.9K Görüntüleme.  Delaware State University. Çevresel toksinlere maruz akut gelişmekte olan embriyo etkileyebilir. Bisphenols sinir sistemi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu bilinmektedir gibi kimyasallar engellemeden endokrin. Burada bir vitro Omurgalılar (civciv embriyo) nöronal ağ modeli toksin pozlama erken embriyo üzerinde fonksiyonel etkisini incelemek için bir iletişim kuralı'nı açıklar.

Video: Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of multipotent, self-renewing, and expandable neural stem cells. In serum conditions, these multipotent NSPCs will differentiate, generating neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The harvested tissue is enzymatically dissociated in a papain-EDTA solution and then mechanically dissociated and separated through a discontinuous density gradient to yield a single cell suspension which is plated in neurobasal medium supplemented with epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), and heparin. Adult rat spinal cord NSPCs are cultured as free-floating neurospheres and adult human spinal cord NSPCs are grown as adherent cultures. Under these conditions, adult spinal cord NSPCs proliferate, express markers of precursor cells, and can be continuously expanded upon passage. These cells can be studied in vitro in response to various stimuli, and exogenous factors may be used to promote lineage restriction to examine neural stem cell differentiation. Multipotent NSPCs or their progeny can also be transplanted into various animal models to assess regenerative repair.

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) and the moment of the radiation of Angiosperms. This led to the hypothesis that alterations in GMF polarity may play a role in plant evolution. Here, we describe a method to test this hypothesis by exposing Arabidopsis thaliana to artificially reversed GMF conditions. We used a three-axis magnetometer and the collected data were used to calculate the magnitude of the GMF. Three DC power supplies were connected to three Helmholtz coil pairs and were controlled by a computer to alter the GMF conditions. Plants grown in Petri plates were exposed to both normal and reversed GMF conditions. Sham exposure experiments were also performed. Exposed plants were photographed during the experiment and images were analyzed to calculate root length and leaf areas. Arabidopsis total RNA was extracted and Quantitative Real Time-PCR (qPCR) analyses were performed on gene expression of CRUCIFERIN 3 (CRU3), copper transport protein1 (COTP1), Redox Responsive Transcription Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1, (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal Ascorbate Peroxidase (TAPX), a cytosolic Ascorbate Peroxidase1 (APX1), and NADPH/respiratory burst oxidase protein D (RbohD). Four different reference genes were analysed to normalize the results of the qPCR. The best of the four genes was selected and the most stable gene for normalization was used. Our data show for the first time that reversing the GMF polarity using triaxial coils has significant effects on plant growth and gene expression. This supports the hypothesis that GMF reversal contributes to inducing changes in plant development that might justify a higher selective pressure, eventually leading to plant evolution.

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Manyetik Alan (GMF) ve Bitki Gelişimi: GMF İptalleri Etkileri üzerine Araştırılması<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Geliştirme ve Gen İfadesi

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor &#946;, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor &#945;. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes (hPSC-CMs) Using Multi-electrode Arrays (MEAs)

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) are increasingly recognized as having great value for modeling cardiovascular diseases in humans, especially arrhythmia syndromes. They have also demonstrated relevance as in vitro systems for predicting drug responses, which makes them potentially useful for drug-screening and discovery, safety pharmacology and perhaps eventually for personalized medicine. This would be facilitated by deriving hPSC-CMs from patients or susceptible individuals as hiPSCs. For all applications, however, precise measurement and analysis of hPSC-CM electrical properties are essential for identifying changes due to cardiac ion channel mutations and/or drugs that target ion channels and can cause sudden cardiac death. Compared with manual patch-clamp, multi-electrode array (MEA) devices offer the advantage of allowing medium- to high-throughput recordings. This protocol describes how to dissociate 2D cell cultures of hPSC-CMs to small aggregates and single cells and plate them on MEAs to record their spontaneous electrical activity as field potential. Methods for analyzing the recorded data to extract specific parameters, such as the QT and the RR intervals, are also described here. Changes in these parameters would be expected in hPSC-CMs carrying mutations responsible for cardiac arrhythmias and following addition of specific drugs, allowing detection of those that carry a cardiotoxic risk.

Electrophysiological Analysis of human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes hPSC-CMs Using Multi-electrode Arrays MEAs

Electrophysiological characterization of cardiomyocytes derived from human Pluripotent Stem Cells (hPSC-CMs) is crucial for cardiac disease modeling and for determining drug responses. This protocol provides the necessary information to dissociate and plate hPSC-CMs on multi-electrode arrays, measure their field potential, and a method for analyzing QT and RR intervals.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Cardiomyocytes can now be derived with high efficiency from both human embryonic and human induced-Pluripotent Stem Cells (hPSC). hPSC-derived ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...