Name: a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans
Uploaded: 2018-03-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

Dipa Bhaumik, Aaron Miller ve Bob Hughes teknik yardım için teşekkür ederiz. Suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir. Georgia Woods ve Lithgow, Kapahi ve Melov Labs üyelerine yararlı tartışmalar için minnettarız. M.L. ulusal kurumları Sağlık (NIH) eğitim Grant T32 AG000266 ve bir Ellison tıbbi Vakfı/Amerikan Federasyonu, yaşlanma araştırma bulunan bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser bir hibe BioAge Labs tarafından desteklenen, Larry L. Hillblom Vakfı Hibe yanı sıra ulusal sağlık Enstitüleri verir UL1024917, Geroscience ve 1R01AG029631-01A1 G.J.L. için disiplinler arası araştırma Konsorsiyumu destekleyen

1. hazırlanması arabellekleri
<ol><li>
LB suyu
	<ol>
<li>Önceden karışık granül ( Malzeme tabloyabakın) kullanın ve hazırlık için üreticinin iletişim kuralı izler.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nematot büyüme medya (NGM) Agar
	<ol>
<li>Mix 23 agar g, 3 g-in NaCl, bacto pepton 2.5 g ve 0.972 L. otoklav deiyonize su ve 60 ° c, let serin sonra 1 M Magnezyum sülfat (MgSO4) 1 mL 1 M potasyum fosfat (KPO4) arabelleği (pH 6.0), 25 mL ekleyin , 1 mL 1 M Kalsiyum klorür (CaCl2) ve 1 mL 5 mg/mL kolesterol (etanol içinde).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hipoklorit çözüm
	<ol>
<li>4 mL sodyum hipoklorit çözüm (% 6) ve deiyonize H2O toplam hacmiyle 50 mL 5 mL 5 m KOH, karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
S Bazal
	<ol>
<li>5 gram NaCl, 1 g K2HPO4, 6 gr KH2PO4ve 1 L, sonra otoklav için de-iyonize su karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. konsantre E. coli (OP50) hazırlanması
Not: Bu adım bir doymuş E. coli çözeltinin 1 L S Bazal arabellek 25 mL yoğunlaşmaktadır.
<ol><li>Autoclaved LB suyu (Adım 1.1) 5 mL bir koloni E. coli (zorlanma OP50) ile aşılamak ve 4-6 h 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile için kuluçkaya. Bu çözümün 0.1 mL lb 1 L bir 2 L Erlenmeyer şişesi aşılamak için kullanın. 1 L şişeler gecede (12-16 h) 37 ° C'de (250 devir/dakika) sallayarak ile kuluçkaya.</li>
	<li>500 ml'lik santrifüj şişe 10.000 x g ve bakteri cips ve uzak kalan medya dikkatle boşaltmak için 4 ° C ' 5 min için 1 L gecede kültürlerde santrifüj kapasitesi. Pelet 25 mL S Bazal (Adım 1.4) resuspend. 4 ° C'de mağaza</li>
</ol>3. hazırlık NGM kültür plakaların
<ol><li>Solucanlar çok sayıda üretmek için kullanılan kitle kültürü plakaları erimiş (60 ° C) NGM agar (Adım 1.2) bir otomatik sıvı losyonlu aparat veya serolojik pipet ile 10 cm kültür plakalar üzerine kabin laminar akışı 30 mL dağıtmak. Kuru gece kalmak için izin verir.</li>
	<li>Konsantre OP50 tamamen yatırma ve plaka, dönen Ağar yüzey kapsayacak yaymak her 10 cm plaka üzerine 2 mL damlalıklı sonra plakaları kuru izin verir. Tabaklar 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.</li>
	<li>Tarama için kullanılan yüksek işlem hacmi tahlil kültür plakaları için 96 iyi plaka laminar akış dolabında her kuyuya erimiş NGM agar 0.15 mL dağıtmak için otomatik bir 8 kanal dağıtıcı kullanmak. Kullanım bakım emin kuyu olun kabarcıklar yoksun, bunlar o kadar iyi tahlil taviz Worms burrowing sağlayacak vardır. Kuru gece kalmak için izin verir. Tabaklar 4 ° C'de 2 hafta için saklayın.</li>
</ol>4. sıcaklık duyarlı (ts) steril C. Elegans kitle kültürü hazırlanması
<ol><li>Kültürler, '(cam pipet ile ekli bir platin tel veya imal edilmiş solucan çekme) bir solucan pick' bir diseksiyon mikroskop altında kullanarak başlatmak için 20 yumurta transferi (TJ1060 soy: spe-9 (hc88) ben; 3.1 adımda hazırlanan kitle kültürü plate(s) üzerine rrf-3(b26)II). Sonra 20 ° C'de plakaları için 6 gün kuluçkaya (bir nesil için büyüme, döl taşındı 20 yumurta toplama için hedeflediğiniz gibi sağlar).</li>
	<li>Görsel olarak gravid yetişkin (yumurta rahim içinde mevcut) varlığını diseksiyon mikroskop doğrulamak. Gravid yetişkin cam pipet kullanarak tabağa Bazal S 2-3 mL dağıtımı tarafından toplamak. Kalenin çevresinde sıvı el ile girdap, sonra sıvı cam pipet kullanarak bir 15 mL tüp içine toplamak.</li>
	<li>Spin aşağı (20 ° C'de 1,5 dk 1000 x g) tüp solucanlar cips, daha sonra süpernatant Aspire edin. 10 mL hipoklorit çözüm (Adım 1.3) solucan Pelet ekleyin ve hızla tüp bir üst alt yönde elle her 2.5 dakikada sallayarak 5 s. Incubate için 5 min için çalkalanır.</li>
	<li>Yine, spin tüp (1,5 dk 1000 x g); Pelet sarımsı-kahverengi olmalıdır. Süpernatant Aspire edin. 10 mL hipoklorit çözüm yumurta Pelet ekleyin ve tüp şiddetle çalkalanır. 1-3 dk, ara sıra sallayarak ile görünüm diseksiyon mikroskop ile izleme sırasında kuluçkaya. Görsel olarak sadece yumurta kalıyor ve sonraki adıma geçin onaylayın.</li>
	<li>Spin aşağı tüp (1,5 dk 1000 x g) ve süpernatant Aspire edin. Pelet ile hiçbir kahverengi rengi beyaz olmalıdır. Not: hipoklorit çözümü kaldırıldıktan sonra bu steril teknikleri ve arabellekleri, kirlenme beri kullanmak için önemlidir (bakteriyel ve mantar, özellikle) israf değerli zaman ve reaktifler deneyi mahvedebilir. Bu çalışmada kullanılan bir filtre uygulanmış laminar akış kabine ve sıvılar steril Pipetler ve ipuçlarını kullanarak taşındı.</li>
	<li>Tüpler bir steril alanında açın. 3 kez ile S Pelet Bazal (1,5 dk 1000 x g) aşağı iplik ve uzak süpernatant her zaman aspirating yıkayın. Yumurta Pelet 2-3 mL S Bazal yeniden askıya alma. Bu yumurta şimdi arabellekte bir gecede kapağı L1 larva (5. adım) toplamak için kullanılabilir.</li>
</ol>5. zaman uyumlu kültürler (L1 larva C. Elegans hazırlama) almak için arabellek C. Elegans yumurta kuluçkalık
<ol><li>Steril cam petri kabına bir kapak ile içine yumurta Pelet ve arabellek dikkatle boşaltmak. Serolojik pipet ile 2-3 mL s Bazal kullanarak bir çanak içine kalan yumurta tüp durulayın. Bu tarama, (dansöz orbital Çalkalayıcı ile 20 devir/dakika) sallayarak yanacaktır teşvik gibi kalabalık, kolaylaştırmak için Bazal s 5 mL ekleyin. Bir gecede 20 ° C'de yumurta zaman kapağı (16-24 h) için izin vermek için kuluçkaya. Bütün yavru 1st larva aşamasında (L1) gıda yokluğu nedeniyle tutuklarım. Not: Taze L1 hazırlıkları (16-36 saat sonra yumurta toplama) Yetişkin solucanlar en zaman uyumlu nüfus oluşturmak anekdot niteliğinde kanıtlar gösterir.</li>
	<li>L1s 15 mL tüp serolojik pipet ile toplamak. Bir santrifüj (1,5 dk 1000 x g) L1s spin, uzakta süpernatant Aspire edin ve bütün L1s S 10 mL bir sonraki adım için Bazal bırakarak tabak, yumurtadan toplanmıştır kadar tekrarlayın.</li>
	<li>L1s içeren tüp, micropipette dışarı 0,01 mL (hemen karıştırdıktan sonra) ve bir seribaşı dağıtmak (yok E. coli) NGM plaka. L1s plaka üzerinde saymak. 10 kez yineleyin ve her aliquot L1s sayısında için ortalama elde edilir. Genel olarak, 1-3 L1s (20 yumurta içeren 1 kitle kültürü plaka ile Başlarken) µL başı arasında bekliyoruz.</li>
	<li>Serolojik pipet ile S L1s tutan Bazal hacmi belirlemek. Solucan L1s toplam sayısını tahmin etmek için önceki adımda elde 0,01 mL başına belirlenen ortalama sayısı ile o zaman tahmin et. Genel olarak, 10.000-30.000 L1s (başına 20 yumurta içeren kitle kültürü plaka) arasında bekliyoruz.</li>
	<li>Bu kültür 96-iyi tahlil kullanmak için L1 süspansiyon 1 µL steril yuvarlak medya şişedeki L1 sulandırmak, sonra adım 7'ye gidin. Bu kültür ek oluşturmak için kullanılacak ise C. elegans kültürler kitle, sonra adım 6'ye gidin.</li>
</ol>6. büyük ölçüde zaman uyumlu kültür hazırlama
Not: L1 çözümleri hızlı bir şekilde solucan örneğin alınma olasılığını artırmak için kullanılabilir.
<ol><li>Büyük solucan numara bir L1 çözüm oluşturmak için her bir kitle kültürü plakaları için istediğiniz sayıyı 5. 000'e kadar L1s dağıtmak. Gravid yetişkin 4.1-2, adımlarda açıklandığı gibi 2.5 gün sonra (20 ° C) toplamak ve yumurta toplamak için 4,3 adıma geçin.</li>
	<li>Bu tekrarlanan hipoklorit koleksiyonu boyun eğdirilmiş nüfus stres, nüfus tarafından bölünmüş anecdotally gözlenmiştir gibi malzeme çekme hipoklorit tedavilere kalan nüfus çok tabi önce yayma için o birden fazla yumurta nesiller nüfusun art arda hipoklorit çözüm tedaviye tabi değil.</li>
</ol>7. Kur 96-iyi tahlil plakaların
<ol><li>(3.3 adımda hazırlanan) tahlil plakaları oda sıcaklığında ulaşmak için izin verir. Sonra bir laminar akış kabine içinde her şey için konsantre OP50 (Adım 2.2 hazır) 5 µL ekleyin. Daha önce olduğu gibi bir otomatik 8 kanal dağıtıcı kullanın.</li>
	<li>10 µL L1 süspansiyon, bir otomatik 8 kanal dağıtıcısı kullanarak her şey ekleyin. Onlar süspansiyon 1 µL L1 olmadığı için bu şey, başına ortalama 10 solucanlar üzerinde ortaya çıkarır. L1s eşit dağılımı Bulamaç teşvik etmek, L1s aktif olarak orta derecede yavaş yavaş dönüm ile karışık bir yuvarlak medya şişe dağıtmak heyecan bar.</li>
	<li>Plaka kapak plakaları, kutu toplu halde ile kapak ve 25 ° C de 2 gün kuluçkaya.</li>
</ol>8. 1 st gün yetişkin C. elegans kimyasallar ile tedavi
<ol><li>Kimyasal Kütüphane plakaları dondurucudan kaldırın ve plakaları oda sıcaklığında devam etmeden önce ulaşmak izin. Not: burada açıklandığı gibi kimyasal Kütüphane plakaları her şey, tüm bunların aynı konsantrasyonu ve DMSO içinde çözünmüş olarak ayrı bileşikler içeren 96 iyi tabaklar. Bu kütüphanelerin dış sütunları kullanmak değil de her plaka en fazla 80 farklı kimyasallar öyle. Burada açıklanan iletişim kuralında, Kütüphane konsantrasyonu 10 mM boyundadır. Fenotipleri çözücü etkileri dikkate almak önemlidir. Bu çalışmada bir DMSO konsantrasyonu % 0,5 ekranlar iken, bu düzey asla bu ömrü deneyleri ve iş hızı düşük deneyleri, nerede bir bileşik hisse senedi çözüm konsantrasyonu almaya daha yüksektir aşıldı. Bu iletişim kuralı, ömrü değişiklikler16, en azından N2 zorlanma meydana gelmez bir düzey % 0.25 aşmaz.</li>
	<li>Yavaşça plaka üzerinde bir Mikroplaka shaker 1 dk. için 60 RPM hemen kullanmak için önceden sallamak.</li>
	<li>Bir otomatik 96-şey sıvı işleyicisi, transfer 0,75 µL bileşik (veya DMSO) Kütüphane plaka tahlil plaka için kullanmak. Öyle ki sıvı işleyicisi pipet uçları 0,75 µL birim (solucanlar ve konsantre OP50 adımlardan 7.1 ile agar yüzeyinde sıvı ~ 15 µL için teslim tahlil plaka sıvı teslimat sırasında pipet derinliği dikkatlice, kontrol edilir -2) ve agar yüzeyinin kuyuda delip değil. Kılavuzu 8 veya 12 çok kanallı Pipetler dışında çok küçük ekranlarında kullanmayın (< 10 plaka), onlar hata ve kez tahlil ödün vermez agar yüzeyinin Delme sonucu artırabilir.</li>
	<li>Test edilen Kütüphane DMSO solvent kullanan varsayarak kimyasal Kütüphane negatif kontrol pilakalar DMSO (Dimetil sülfoksit), hazır olun. Her 5 için 1 negatif kontrol levha Kaplamalar, 10 negatif kontrol plaka kadar test edin. Mümkünse, aynı zamanda bir olumlu denetim tabak hazırla (NP11 son tahlil yoğunlaşması 0.1 mm, 20 mm etkili bu amaç için; temsilcisi sonuçları bölümüne bakın). Kuruma için özellikle duyarlı oldukları gibi kimyasallar (test veya denetimi) plakaları, 2 Dış sütun için eklemeyin.</li>
</ol>9. kurutma kültürler
<ol><li>Agar yüzeyinden sıvı kaldırmak için 4-8 h için kabine laminar akış levha kuru. Bu tabakları tamamen kurumuş ama değil kurumuş olmak çok önemlidir. Bir kaç tabak diğerlerinden daha kuruması için daha uzun sürer gibi tüm plakaları yakından izlemek ve en kısa zamanda kuru kaldırın. Plaka bireysel kuyu dikkatli görsel denetim tarafından kurutma onaylayın. Not: egzoz değeri kabine etmenlere bağlı olarak, bu süreyi ampirik olarak belirlenmelidir. Bu kurutma adım yaklaşık 4-8 h tam bir kabine için alabilir.</li>
	<li>Şeffaf film ile plakalarının sonra tabak kapakları koydu.</li>
	<li>96-iyi tahlil plakaları 45 için spin 1000 x g s.</li>
	<li>25 ° C'de ters mağaza plakaları</li>
</ol>10. puanlama C. Elegans kültürler için uzun ömürlü
<ol><li>İzlemek kadar negatif kontrol Kaplamalar > % 95'i ölüm gözlenen. Kaplamalar, haftalık için ilk iki hafta ve her gün bundan sonra kontrol edin. Caenorhabditis tabur aynı soy ve türlerin deneme17tarafından önemli ölçüde farklı katlanacak görüntüleyebilirsiniz. Not: Burada, 25 ° C'de kültürlü TJ1060 hayvanlarla açıklanan ömrü tahlil için % 95'i ölüm bu nüfusu yetişkin gün 16-20 oluştu.</li>
	<li>Ne zaman negatif kontrol wells olarak kabul edilir ulaşmış > % 95 mark, tüm 96-iyi tahlil plakaları 45 için aşağı spin bir Mikroplaka ile bir masa üstü santrifüj s adapte rotor (250 x g 45 için s 20 ° c).</li>
	<li>Denetim plakaları bütün wells puan. Bu sayma ve canlı ve ölü hayvan sayısı her Peki kayıt yapılır. Ölü solucanlar sağ kurt hareketi tam onların eksikliği nedeniyle farklı. Sağ kurt hareketinde 96 iyi plaka yaklaşık 7 cm diseksiyon mikroskop yüzey üzerine herhangi bir çatışmaya yanıt için mercek ile bakarken tarafından atılan kışkırtmak. Ölü solucanlar yanıt ve yakındaki laboratuvar arkadaşları tekrarlayan gürültü takdir olmayabilir.</li>
	<li>Test plakaları için saymak ve canlı solucan içeren wells kaydedin. Canlı bir solucan gözlenen zaman, o kadar iyi, iyi pozisyon ve plaka ile birlikte tüm canlı ve ölü hayvan saymak. Not: Genellikle plakaları sonra yeniden puanı yararlı olduğu > negatif kontrol solucanlar % 99'u öldü. Büyük ölçekli ekranları, bu ilk Puanlama yapmak için en iyi nokta olabilir. Her iki durumda da, skor/yeniden-yukarıda açıklandığı gibi score</li>
</ol>11. yeniden test bileşikler
<ol><li>Az sayıda aday bileşikler sınarken (< 320 bileşikler), bir yeniden test veya bir aday ekran (bkz: temsilcisi sonuçları) ile tahlil 32 Merkez wells için olası plaka etkileri en aza indirmek için bir çaba kısıtlamak gibi. Bu 2 kuyu plaka kenarına yakın tedavi edilmemiş ama hala agar, gıda ve solucan içeren bırakır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+activation+of+a+food+deprivation+signal+extends+lifespan.">Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticonvulsant+medications+extend+worm+life-span.">Anticonvulsant medications extend worm life-span.</a> Science. 307 (5707), 258-262 (2005).</li><li>Melov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+of+life-span+with+superoxide+dismutase/catalase+mimetics.">Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics.</a> Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).</li><li>Benedetti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compounds+that+confer+thermal+stress+resistance+and+extended+lifespan.">Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan.</a> Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).</li><li>Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Genes+Tied+to+Endocrine,+Metabolic,+and+Dietary+Regulation+of+Lifespan+from+a+Caenorhabditis+elegans+Genomic+RNAi+Screen.">New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen.</a> PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).</li><li>Lee, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+identifies+a+critical+role+for+mitochondria+in+C.+elegans+longevity.">A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity.</a> Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).</li><li>Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+activities+that+mediate+increased+life+span+of+C.+elegans+insulin-like+signaling+mutants.">Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants.</a> Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).</li><li>Kwok, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+screen+in+C.+elegans+yields+a+new+calcium+channel+antagonist.">A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist.</a> Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).</li><li>Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+chemicals+that+increase+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Angeli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+synthesis+inhibitor+is+protective+against+proteotoxic+stressors+via+modulation+of+fertility+pathways+in+Caenorhabditis+elegans.">A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).</li><li>Fabian, T. J., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+age-synchronous+mass+cultures+of+Caenorhabditis+elegans.">Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans.</a> J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).</li><li>Greer, E. L., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+dietary+restriction+regimens+extend+lifespan+by+both+independent+and+overlapping+genetic+pathways+in+C.+elegans.">Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans.</a> Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).</li><li>Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+dietary+restriction+for+genetic+epistasis+analysis+and+gene+discovery+in+C.+elegans.">Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans.</a> PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).</li><li>Hamilton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+RNAi+screen+for+longevity+genes+in+C.+elegans.">A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans.</a> Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).</li><li>Frankowski, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimethyl+sulfoxide+and+dimethyl+formamide+increase+lifespan+of+C.+elegans+in+liquid.">Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid.</a> Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).</li><li>Lucanic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+genetic+background+and+experimental+reproducibility+on+identifying+chemical+compounds+with+robust+longevity+effects.">Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects.</a> Nat Commun. 8, 14256 (2017).</li></ol>

Bu eser destekleyici finansman hiçbir varlık veri, analiz sonuçlarının veya yayımlamak için karar koleksiyonu üzerinde herhangi bir giriş vardı yazarlar bildirin.

Burada C. elegans 96-şey levha kültür için basit bir yöntem anlatmıştık. Ama biz bu kültürler kimyasal tarama ve ömrü deneyleri için tarif deneyleri birçok türü için kullanılabilir. Ise kimyasal tarama için çok iyi kültür koşulları daha önce bildirilen8olabilirdi, ömrü analiz10için dahil burada açıklanan tahlil çeşitli şekillerde farklıdır. Burada açıklanan ömrü tahlil 96-şey plakaları kullanır, steril mutantlar (yerine kimyasal sterilizasyon) dayanan, agar kültürü koşulları kullanır, basit sıvı solucanlar taşımak için işleme kullanır ve uç noktada el ile attı. Bu tahlil kullanılan farklı yaklaşımlar araştırmacılar bu koşullar yer yöntemleri eleme için seyir için yardımcı olabilir.
Esas olarak tahlil için üretilen plakaların kalitesine Merkezi bu iletişim kuralı için çok önemli öğeleri. İlk olarak, tabak yaparken bu agar yüzeyinin kabarcıklar ve diğer kusurları ücretsiz zorunludur. Bu değişimler agar yüzeyinin hemen hemen her zaman tavşan çukuru ve kaybı iyi neden. İkinci olarak, bu iletişim kuralını kurulum ve hap veriyorsun aşamasında biriken sıvı kapalı kurutma dayanır. Bu sıvılar tamamen kaldırılır, ancak agar kurudu olmak değil önemlidir. Anecdotally, görünüşe göre tamamen değildir Wells solucanlar (sıvı içinde yüzme) kurutulmuş canlı düzgün kurutulmuş wells, daha fazla tabak kurutma kuruma ve tavşan çukuru ve kaybı solucan yol agar çatlama yol açar iken uzun. Başka bir önemli unsur bu protokol steril koşullar sürdürmektedir. Olarak herhangi bir ömrü tahlil ile bir sürü iş plaka kurulumu ile ilgili ve yerleşmek ve Tabaklarda büyümeye kirlenme bozma tahlil için birçok fırsat ve zaman adlı biri yok.
Burada açıklanan ömrü tahlil C. elegansbileşikler ile taranması için yararlıdır, sıcaklık duyarlı (ts) steril yaratıyordur dayanıyor gibi belirli genetik arka planlar için sınırlı iken; Biz yüksek kısırlık alellerle vardır TJ1060 kullanılır. Bu tarama için kullanılabilir suşları bu yöntem ile sınırlar. Ts steril mutasyonlar istenen arka plana geçiş veya kimyasal sterilizasyon kullanarak da dahil olmak üzere alternatif yaklaşımlar. Biz bu tahlil ile kimyasal sterilizasyon denemedim ama mümkün olmalıdır. Potansiyel Engelli Sterilizatör solucanlar üzerinde doğru aşamada ve uygun dozda yerleştirerek içerir. Açıklanan protokol burada hızlıdır, ancak yetişkin etkili bir şekilde dağıtmak için görünmüyor bir Sıvı Sabunluk kullanır. Bu yüzden, bu solucanları Tabaklarda geliştirmek ve bu nedenle Tabaklarda kimyasal sterilizasyon ile tedavi edilmelidir. En uygun doz belirleme ve zamanlama başarısı için önemli olacaktır. Alternatif Stratejileri yetişkin taşıyabilirsiniz bir dağıtım yöntemini kullanarak içerir. Geçmişte, biz makineleri belirlemek ve yetişkin sıralamak mümkün genellikle çok daha yavaş askıya alınmış larva homojen çamurlar dağıtabilirsiniz basit sıvı işleyicileri, bulduk.
Genel olarak, yaşam süresi üzerinde büyük olumlu etkileri için hızla ekran kimyasallar ve tedavileri için bu yöntemi kullanın. Yöntemi ile birden fazla dozlarda kullanıldığında özellikle etkilidir, yüksek sayılar çoğaltmak ve her zaman muhafaza ve test plakaları arasında serpiştirilmiş negatif denetimleri izlenmesi kapatın. Pozitif denetimleri tasarlama ve bu el yazması açıklanan ekranlar uygularken yararlıdır. Ancak, etkili bir pozitif olmak, denetimin oldukça güçlü ve/veya son derece sağlam olması gerekir. Ekranın ilk olarak dağıtıldığında, uygun güçlü ve sağlam bir bileşik tanımlanamıyor. Şu anda vardır birçok raporlar olumlu denetimler için muhtemel adayların 'yaşlanma' Edebiyat burada açıklanan ekranlar yararlı. Bu el yazması beklenen sonuçları bölümünün aday ekran bölümünde ve Şekil 2 ve Tablo 1' de açıklandığı gibi bileşik NP1 bu ekran etkili bir pozitif kontrol içindir. Biz genellikle bu ekranlar ile standart ömrü deneyleri 3 mm kültür Tabaklarda gelen pozitif sayısı onaylayın.

Burada bir iletişim kuralı Caenorhabditis elegans ömrü üzerinde etkileri için kimyasal bileşikler yüksek aktarım tarama için geliştirilen açıklanmıştır. Protokolün kendisi gazeteci C. elegans suşları kullanan çalışmaları da dahil olmak üzere diğer fenotipik ekranlara kolayca uyarlanabilir. Bu iletişim kuralı başarıyla bir roman biyolojik olarak aktif bileşim, NP1 tanımlamak için kullanılmıştır (nitrophenyl-piperazin 1), C. elegans ömrü bir diyet kısıtlama mekanizması aracılığıyla güçlü genişleten. NP1 ve ömrü oynayan, genetik yolları için bir açıklama da dahil olmak üzere, üzerindeki etkisini bir karakterizasyonu oldu daha önce başka bir bölümünde1. Rapor Ayrıca ekranın büyük ölçekli bir uygulama sonuçlarından bir açıklaması vardır. Burada biz çok daha ayrıntılı olarak Metodolojisi ve Kur ekranın kendisi, hem küçük ve büyük ölçekli uygulamalar için ölçeklenebilir olduğu açıklanmaktadır.
Büyük kimyasal kitaplıkları roman biyolojik olarak aktif bileşikler için hızlı tarama için izin verilen bir C. elegans Kültür Platformu geliştirmek için burada açıklanan protokol yol açtı hedefi oldu. Kimyasal ekranlarında bu protokolü geliştirme önce gerçekleştirilmiş olsa da, bunlar özellikle küçük ölçekli / veya2,3aday türü yaklaşımlar. Nitekim, onlarca bileşikler üzerinde laboratuarında gerçekleştirilen ekranlarının en uzun ömürlü etkileri4için tarandı sayısı ile stres direnç deneyleri, kullanılmıştır. Bu çalışmada bunun yerine doğrudan ömrü etkileri için ekran istedi. Dikkat çekici, büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegansile gerçekleştirme esnasında bilimsel literatürde birkaç açıklamaları vardı. Nitekim, ekranlar5,6,7, diğer türleri için karşılaştırıldığında, C. elegans kullanarak büyük ölçekli Kimyasal tarama altında istihdam olmak gibiydi.
Bu yaklaşım geliştirmek için bir temel olarak kullanılan büyük ölçekli Kimyasal ekranlarında C. elegans iki açıklamaları vardı. Bunlardan ilki Peter Roy'un laboratuvar hayvanları gelişimi huzursuz bileşikler tanımlamak için kimyasal ekranlarında kullanarak zarif bir çalışma yapıldı. Çalışma daha sonra bu kimyasallar8genetik hedeflerini tanımlamak için ileri mutagenesis ekran ile takip. Bu çalışmada açıklanan protokol 24-şey pates, hangi sadece kullanışsız bu çalışmanın belirli gereksinimler (sınırlı miktarda kimyasal Kütüphane ve sınırlı kullanılabilir kuluçka alanı) için kullanılır. Diğer çalışma Michael Petrascheck'ın yenilikçi ve hırslı küçük molekül ekran kimyasallar9,10uzanan ömrü için başvurdu. Bu çalışma 384-şey plakaları ve sıvı kültürleri kullanılır. Diğer önemli özelliği bu ekran, kimyasal olarak döl üretim etkisizleştirmek için FUDR (5-fluorodeoxyuridine) kullanmaktı. Bu çalışmada açıklanan protokol önemli dikkate sonra kimyasal sterilizasyon ve C. elegans sıvı kültürleri atlanma.
FUDR C. elegans ömrü deneylerde yaygın olarak kullanılmasına rağmen FUDR önceden tahmin edilemeyen ilaç etkileşimleri neden olabilir veya o FUDR ömrü üzerinde bir etkisi olabilir endişeler vardı. Son zamanlarda bu ikinci endişe, en azından bazı konsantrasyonlarda ve özellikle 25 ° C11doğrulandı. Döl kirlilik sorunu aşmak için C. elegans zorlanma TJ1060, hangi iki bağımsız sıcaklık duyarlı mutasyonlar limanlar kullanıldı (spe-9 (hc88) ben; sperm üretimini ortadan kaldırmaya ve yararlı olması için göstermiştir rrf-3(b26)II) zaman uyumlu nüfus12kitle kültürleri için. Bu zorlanma 25 ° C'de tamamen steril, ama ne zaman 15-20 ° C'de kültürlü döl üretecek Bu çalışmada agar, yüzeyinde sıvı kültürleri ile elde edilen sonuçlar her zaman geleneksel Ağar kaplamalar ile tekrarlanabilir değildir olarak tarama solucanlarla geleneksel kültür koşulları, kullanılan. Bu olay tamamen anlaşılmaktadır değil iken, solucanlar solucan standart medya13,14tarihinde kültürlü daha farklı bir şekilde Dr (diyet kısıtlaması) sıvı cevap kültürlü kanıtlanmıştır. Bu nedenle sıvı medya ile ekranın tanımlanması bazı DR mimetics maske makul 's.
Agar kültürü koşulları üzerinde yerleşmiş, bu tahlil wells performansını puanlama için farklı seçenekler kabul edildi. Çeşitli otomatik ya da görüntü tabanlı deneyleri mevcut iken, satın alma ve teknik cihazlar, en çok hangi prohibitively pahalıydı zorlu dağıtım gerektirdiği. Bu seçenekleri göz önünde iken, tüm türleri önceki ömrü ekranlara başvurmak için gerekliydi. Sonuçta, bu çalışma--dan Siu Sylvia Lee laboratuar tüm genom RNAi perde ömrü fenotipleri15için uyarlanmış bir skor yöntem kullanılır. Özellikle, tüm ömrü plakaları aynı şekilde ayarlanmış olan ama sadece negatif denetimleri takip. Bir kez negatif kontrol levha tam ölüm için teyit edildi, el ile test plakaları skorlanmıştır. Bu büyük ölçekli ekranda, pozitif yeniden kullanarak taze hazırlanmış kimyasallar ile test ederek nüsha birincil pozitif tekrarlar teyit edildi.

<table><tbody><tr><td>LB Broth Miller Granules</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unispense&amp;nbsp;</td><td>Wheaton Science Products</td><td></td><td>automated fluid dispensing apparatus</td></tr><tr><td>96 well assay plate; COSTAR 3370</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop 384; automated 8 channel dispenser</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manufactored worm pick</td><td>Genesee Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Belly Dancer Orbital Shaker</td><td>Stovall Life Science inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microplate shaker; MTS 2/4 Digital</td><td>IKA Works, inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler</td><td>&amp;nbsp;Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor&amp;nbsp;</td><td>Sorenson Bioscience, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>manual 8 or 12 multi-channel pipettes</td><td>we use rainin&amp;hellip;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>table top centrifuge; Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method for high throughput chemical screening in caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans fizyolojisi üzerinde kimyasal etkileri test etmek için yararlı bir organizmadır. Bütün organizma küçük molekül ekranlar ömrü gibi karmaşık fenotipleri değiştirebilirsiniz biyolojik olarak aktif kimyasal yapıları tanımlamak için önemli avantajlar sunuyor. Burada açıklanan yüzlerce C. elegans her iyi oldukça tutarlı numaraları ile birlikte 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokoldür. Daha sonra Yuvarlak solucanlar C. elegansömrü üzerinde etkileri için bu kültürler ekrana kimyasalların binlerce kullanmayı belirtilen. Bu iletişim kuralının yeteneklerinden sıcaklık duyarlı steril suşları, agar plaka koşullar ve basit hayvan eşitlenmiş hayvan kültürler tarama için hızlı ve yüksek üretilen iş üretimini kolaylaştırmak için işleme.

Biz bu iletişim kuralı 96-şey ömrü deneyleri için istihdam temsilcisi sonuçları inceleyerek başlar. İlk örnekte, yöntem başarıyla için 30.000 kimyasallar ile ekran için kullanılan kimyasallar, C. elegans, ömrünü uzatmak ve ayrıca takip yeniden test ekranından sonuçlarını en iyi kimyasallar kullanarak içerir tanımlamak aynı protokol. Bu sonuçlar yukarıda açıklanan1idi. İkinci örnek daha küçük ölçekli ekran aday bileşiklerin aynı iletişim kuralını kullanır.
Büyük ölçekli ekran ve yeniden test: 30.000 bileşikler test büyük ölçekli ekran yinelenen içinde tek bir doz olarak gerçekleştirildi. Her kimyasal bu nedenle iki Wells 20 beklenen bir toplam hayvan nüfusu ile test edildi. Bunu yapmak için üç ayrı Grup (yinelenen içinde) 10.000 bileşiklerin ~ 3 ay tüm 30.000 bileşikler kapsayacak şekilde bir süre içinde gösterildi. Bu kısmen, el ile testin sonunda puanlama yönetilebilir bir miktar sağlamak için yapılır ve her set 96-iyi tahlil plakaların 260 toplam gerekli. Kütüphane hisse senedi levha, sadece 80 wells bileşik yer alan; bir çoğaltma 10.000 bileşiklerin 125 tahlil plakaları yapar. Bu çalışmada 2 çoğaltır her sette 10 negatif kontrol plakalı kullanılır. İş çıkarma yeteneğini artırmak için ne zaman negatif kontrol nüfus % ~ 99 ölüm deneyimli olması değerlendirildi plakaları skorlanmıştır. Canlı solucanlar için tüm test Wells sonra muayene.
Wells bir canlı solucan ile kimyasalların sayısı olarak biliniyordu. Wells de denilen isabeti ve ayrıca bu Wells tüm solucanlar (canlı ve ölü) 1'den fazla solucan hayatta içeren kimyasallar sayılır basit bir skor oluşturmak için (yüzde canlı skor; sağ kurt ölü solucanlar numarasına göre bölünmüş sayısı). Her kimyasal kütüphanede bu nedenle bir hit iki kez olarak adlandırılabilir ve bu şarkıları olabilir, ama -ebilmek değil, var onlarla ilişkili puanları. 512 farklı kimyasallar (en az bir kez) sayısı 30.000 bileşikler ekrandan çağrıldı. Ekran güçlü ve/veya sağlam (tekrarlanabilir) yanlısı uzun ömürlü etkileri tanımlamak amacıyla gerçekleştirildi. Bu iki farklı özellik farklı etkileri olabilir. Güçlü kimyasallar bu durumda olduğu anlamına gelir'ın kuyuda hayatta olduğun için solucanlar yüksek bir yüzde beklediğiniz ömrü, önemli ölçüde arttırabilir. Sağlam kimyasallar için her iki çoğaltır canlı solucanlar için beklenir. Bulunanlar listesi bu kriterlere göre sırada yer aldı. 179 kimyasalların yüksek yüzde Canlı Skorlar, vermiştir veya her iki çoğaltır vuruldu ve bu nedenle yeniden test etmek için seçilmiştir. Sayısı olarak adlandırılan, ancak yeniden test etmek için seçili değil kalan kimyasalların çoğu yalnızca birinde Çoğalt wells, hayatta bir tek solucan yer.
Şarkıları yeniden sınamadan gerçekleştirilen, dışında birincil ekran 3 çoğaltır (beklenen toplam hayvan nüfusu 30) ve tedavi edilmezse denetim plakaları hayvanlarda katlanacak dikkatli miktar ile benzer. Bu değişiklikleri test ve denetim kuyuları karşılaştırma yardımcı olmak için eklenmiştir. kimyasal sayısı 179 yeniden sipariş, 10 mM ile seyreltilmiş ve 96 iyi kalıplara taşındı. Sadece iç 24 kuyu yeniden test tahlil için kullanılmıştır (geçerli sürümlerinde bu protokolü kullanılan iç 32 wells yeniden test ekranlar için protokol bölümünde açıklandığı gibi) ve bileşikleri nüsha altı negatif kontrol tahlil plakalı içinde yeniden test edildi DMSO solvent ile tedavi. Bir negatif kontrol plaka düzenli aralıklarla toplam yaşam (şekil 1A) için atan oldu. Denetim hayvanlar yaklaşık % 95'i ölü iken, tüm plakaları tamamen skorlanmıştır (tüm tedavi canlı ve ölü solucanlar sayılır).
Sayısı yeniden test sonuçlarını aramak için bir kesme ve ortalama yüzde canlı Puan negatif kontrol + 2 standart sapma (SD) yapıldı. Test kuyular için yüzde (puanlama sırasında) canlı ortalama puanları her şey için üç çoğaltır üzerinden yüzde canlı skor sayı ortalaması alınarak hesaplanan. Bu özel tahlil için negatif kontrol Wells'in ortalama yüzde Canlı Skorlar 48 wells (2 setleri onaylatılacak negatif kontrol) için üç çoğaltır ortalama olarak hesaplanmıştır. Yeniden test kimyasal kümesinden sayısı derdi SD SD 48 negatif kontrol genelinde ortalama olarak yüzde Canlı Skorlar oldu. Bu stratejiyi kullanarak, bu çalışmada 57 sayısı 179 bileşikleri, (şekil 1B) yeniden test Kimyasalları % 32 toplam pozitif test gösteren yeniden test Kütüphanesi bulundu. Negatif kontrol ve test kuyuları için ortalama yüzde canlı skor binning test wells denetim wells (şekil 1C) geride belirtti.
Aday ekran: Küçük ölçekli ekranlar yukarıda açıklanan sınava yeniden girmek için benzer bir şekilde gerçekleştirilebilir. Burada, 139 bileşikler ile aday ekranından sonuçları açıklayın. Bu adayların yapıları uzun ömürlü teşvik muhtemeldir toplandı. Bu ekran için iki farklı dozda (50 µM ve 100 µM) test plakaların 5 çoğaltır gerçekleştirilen. Ayrıca, iki farklı dozda içeren bir tek olumlu denetim (NP1) plaka ile 8 negatif kontrol levha, kullanılan; 50 µM ve 100 µM.
Hayvanların ~ %90 ölü olana negatif kontrol levha takip. O zaman, canlı ve ölü solucanlar tüm denetim Wells ve canlı solucanlar bulunan test kuyulardan sayarak wells skorlanmıştır. O zaman canlı puanlama yüzde ortalama yüzde canlı skorları her şey için hesaplamak için kullanılmıştır. Negatif kontrol için 8 çoğaltır üzerinden yüzde Canlı Skorlar 32 kuyu vardı. Pozitif kontrol için her doz için 4 çoğaltır genelinde ortalama 4 iyi skorları vardı. Sayısı ortalama büyük bir ortalama yüzde canlı skor ile kuyuları için çağrıldı negatif kontrol yüzde canlı Puan edinildi + 2 SD Bu kesim 14 sayısı aday ekrandan yaptı ve tüm negatif kontrol Wells hariç. Bu kesim de olumlu denetim dahil 100 µM ve olumlu denetimleri % 50'si tedavi wells tedavi 50 µM. Bu sonuçları sunulan burada binned ortalama 50 µM (Şekil 2A) ve 100 µM (Şekil 2B) test ekranları için yüzde canlı skorları.
Son olarak, tüm plakaları bir zamana denk geç bir zaman noktasında yeniden attı negatif kontrol % 99 daha fazla tedavi ederken hayvanlar ölmüştü. Bu sonuçları olumlu denetim wells Lübnan negatif kontrol ve test wells (Şekil 2C) dışı sahne olduğunu belirtti. Test kuyu negatif kontrolleri biraz daha iyi iken. Bu ikinci sonucu birçok test Wells toksisite kontrol tedavi (Tablo 1), böylece bu basit yorum semptomlarıdır göreli sergi ortaya çıktı göstergesi tarafından önyargılı. Bu yeniden test ekran aslında daha toksik olmayan bileşikler için önceden filtrelenmiş iken aday Kütüphane kimyasal C. elegans, bilinmeyen biyolojik aktivite ile gerçek bir ekran oldu bu yana, beklenen oldu. Bu birincil ekran ömrü uzamış bileşikler olduğu için önemli ölçüde zehirli kimyasal maddeler yeniden test ayarlanmamış.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig1.jpg"> Resim 1 : Temsilcisi sonuçları yüksek üretilen iş ekran ve yeniden test (A)yaşayanlar eğri yeniden test assay olarak kullanılan bir temsilcisi negatif kontrol plaka. Bu eğri bu tahlil testin 18 gün içinde 4 kez kullanılan 24 Wells tüm canlı ve ölü solucanlar puanlama inşa edilmiştir. Gün 18 erişkin, denetimleri ~ %5 hayatta kalmak için değerlendirildi ve tüm kontrol testi ve plakaları sonra da skorlanmıştır. (B) tablo ekran ve yeniden test sonuçları özetleme. (C) Binning wells ortalama yüzde hayatta puanları yeniden test ekranından kontrol ve test koşulları için. Denetimler için puanları 48 kuyulardan her 3 çoğaltır ortalamasını oluşan. Test sonuçlarını 179 kuyulardan her üç çoğaltır üzerinden Ortalama puanı oluşan. Şekil 1 bir önceki yayın1ile yeniden oluşturulur. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56892/56892fig2.jpg"> Resim 2 : Temsilcisi sonuçları bir aday ekrandan (A)Binning 50 µM aday ekranından sonuçlarının. 139 test-iyi sonuçları ortalama yüzde canlı skor 5 çoğaltır temsil eder. 32 negatif kontrol sonuçları ortalama yüzde Canlı Skorlar 8 çoğaltır dan oluşur. 4 olumlu denetim sonuçları ortalama yüzde Canlı Skorlar 4 çoğaltır (16 toplam içeren NP1, 50 µM kuyuları) dan oluşur. (B) Binning 100 µM aday ekranından sonuçlarının. Tüm Yani (A), aynı test wells ve olumlu denetimleri 100 µM konsantrasyonları tedavi edildi dışında. Aynı negatif kontrol levha hem (A ve Biçinde) gösterilir. (C) temsilcisi plakaları nispeten aşırı geç saat noktada yeniden gelen puanlama sonuçları. Pozitif denetimleri büyük ölçüde tüm diğerleri, sadece wells ile canlı solucanlar karşı test wells ana metin ve Tablo 1' de açıklandığı gibi önyargılı bu zamanda noktada yüzde için muhasebe Eğer geride. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56892/56892fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="6">Ortalama yüzde hayatta puanları binning</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gruplandırılmış puanları</td>
			<td>Tüm ölü (0)</td>
			<td>1-10</td>
			<td>11-20</td>
			<td>21-30</td>
			<td>31-40</td>
			<td>> 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>Yeniden test</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-), Denetim</td>
			<td>16</td>
			<td>31</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test Wells (50µM)</td>
			<td>46</td>
			<td>69</td>
			<td>50</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Aday ekran</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td># (-), Denetim</td>
			<td>0</td>
			<td>11</td>
			<td>21</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># (+) kontrol (50µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># (+) kontrol (100µM)</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test Wells (50µM)</td>
			<td>94</td>
			<td>22</td>
			<td>21</td>
			<td>2</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td># Test Wells (100µM)</td>
			<td>86</td>
			<td>25</td>
			<td>21</td>
			<td>6</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Farklı ekranlar binning temsilcisi sonuçları Burada--dan iki perde (yeniden test ve aday) ortalama yüzde Canlı Skorlar binning mevcut. Yeniden test ekranında, negatif denetimine benzer zirve negatif kontrol sağdaki önemli ölçüde daha iyi performans tekrar testleri ile tablonun (uzun ömürlü) yan. Bu birden çok yanlısı uzun ömürlü bileşikler yeniden test kümesinde varlığını gösterir. Aday ekranda, biz varken zirve tüm ölü kategorisinde de tablonun sağ taraftan belirgin bir sinyal olduğunu görürsünüz. Bu yanlısı uzun ömürlü bileşikler aday küme varlığını gösterir, ancak aynı zamanda aday grup bileşikler arasındaki önemli toksisite varlığını gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans at JoVE.com

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

a-simple-method-for-high-throughput-chemical-screening-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

8.7K Görüntüleme.  The Buck Institute for Research on Aging. Burada biz hızla nematodunun büyüme medya agar, yüzlerce Caenorhhabditis elegans tutarlı numaraları iyi başına 96-şey kültür plakaların üretimi için basit bir protokol tanımlamak. Bu kültürler tüm canlıların fenotipik tarama için yararlıdır. Yanlısı uzun ömürlü efektleri için ekran kimyasallara bu kültürler kullanarak üzerinde odaklanabilir.

Video: A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Gelişim Biyolojisi

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple and inexpensive method to obtain a large number of animals for the isolation of proteins to proceed with a western blot, mass spectrometry, or further proteomics analyses. Furthermore, an increase of nematode numbers for immunostainings and the integration of multiple analyses under the same culturing conditions can easily be achieved. Additionally, a transfer between plates with different experimental conditions is facilitated. Common techniques in plate culture involve the transfer of a single C. elegans using a platinum wire and the transfer of populated agar chunks using a scalpel. However, with increasing nematode numbers, these techniques become overly time-consuming. This protocol describes the large-scale culture of C. elegans including numerous steps to minimize the impact of the sample preparation on the physiology of the worm. Fluid and shear stress can alter the lifespan of and metabolic processes in C. elegans, thus requiring a detailed description of the critical steps in order to retrieve reliable and reproducible results. C. elegans is a model organism, consisting of neuronal cells for up to one-third, but lacking blood vessels, thus providing the possibility to investigate solely neuronal alterations independent of vascular control. Recently, early neurodegeneration in diabetic retinopathy was found prior to vascular alterations. Thus, C. elegans is of special interest for studying general mechanisms of diabetic complications. For example, an increased formation of advanced glycation end products (AGEs) and reactive oxygen species (ROS) is observed, which are reproducibly found in C. elegans. Protocols to handle samples of adequate size for a broader spectrum of investigations are presented here, exemplified by the study of diabetes-induced biochemical alterations. In general, this protocol can be useful for studies requiring large C. elegans numbers and in which liquid culture is not suitable.

Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

This protocol describes a method for the large-scale cultivation of Caenorhabditis elegans on solid media. As an alternative to liquid culture, this protocol allows obtaining parameters of different scales under plate-based cultivation. This increases the comparability of results by omitting the morphological and metabolic differences between liquid and solid media culture.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Culturing Caenorhabditis elegans (C. elegans) in a large-scale manner on agar plates can be time-consuming and difficult. This protocol describes a simple ...

Biyokimya

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Nematod Popülasyona Dayalı Kemoterapi Tercihi Testinin Otomatik Analizi

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Davranış

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and maintenance issues. On the contrary, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) has advantages to make it an ideal choice for toxicity testing: a short lifespan, easy cultivation, and efficient reproduction. Here, we describe a protocol for the automatic phenotypic profiling of C. elegans in a 384-well plate. The nematode worms are cultured in a 384-well plate with liquid medium and chemical treatment, and videos are taken of each well to quantify the chemical influence on 33 worm features. Experimental results demonstrate that the quantified phenotype features can classify and predict the acute toxicity for different chemical compounds and establish a priority list for further traditional chemical toxicity assessment tests in a rodent model.

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

A quantitative method has been developed to identify and predict the acute toxicity of chemicals by automatically analyzing the phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. This protocol describes how to treat worms with chemicals in a 384-well plate, capture videos, and quantify toxicological related phenotypes.

Bir yüksek-den geçerek tahlil tarafından otomatik fenotipik profil oluşturma Caenorhabditis elegans ve kimyasal toksisitesi tahmin için

Applying toxicity testing of chemicals in higher order organisms, such as mice or rats, is time-consuming and expensive, due to their long lifespan and ...

Çevre

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Biyoloji

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

Yüksek işlem hacmi, yüksek-içerik, sıvı tabanlı C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

Otomatik davranış analizi büyük C. elegans nüfus kullanarak bir geniş alan bakış açısı izleme platformu

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Kemotaksis Deneyi

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Bir taranabilir<em&gt; İn Vivo</em&gt; Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Nematod kullanma Germline Kimyasal zehirlilik Kapsamlı Değerlendirme