Bu eser gelişme bozuklukları ve plasental Analytics LLC, New Rochelle, NY olan kişiler için New York eyalet Office tarafından desteklenmiştir.

Bu protokol kuralları New York Devlet Enstitüsü temel araştırma için gelişimsel Engelli insan araştırma Etik Komitesi izler.
1. villous ağacı diseksiyon
<ol><li>Plasenta doku formalin kaldırıp bir kabında diseksiyon mikroskop sahnesinde yerini için buffed fosfat serum fizyolojik (PBS)14 ile sabit formalin durulayın. Neşter ve forseps iyi villous ağaçlar (beyaz ipliksi dallanma yapıları) bulmak için plasenta doku ayrı alay için kullanın. İ. ağaç (birkaç mm uzun) parçalarını dışarı incelemek ve dokuyu mikro-tüp içeren ~ 1 mL PBS aktarın.</li>
</ol>2. immünfloresan boyama
<ol><li>Bir pipet ile PBS kaldırın ve taze PBS ile değiştirin. Ara sıra dönen ile 10 dakika bekletin. Bir kez daha yineleyin. Not: Bu adım ve tüm diğer adımları birincil antikor kuluçka dışında oda sıcaklığında yapılır.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak kaldırmak ve PBS PBS ile +0.1 yerine % Triton-X100 + % 2 keçi serum (PBS-T-GS) ikincil antikorların doku ve blok non-spesifik bağlama permeabilize için. 30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>PBS-T-GS %2 keçi serum içeren PBS ile yerine, her iki fare monoklonal anti-CK7 ve tavşan anti-CK7.<ol>
<li>Doku gecede 4 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Kalan antikorlar ile ara sıra dönen 10 dakika için PBS-GS ile yıkayarak çıkarın.</li>
		<li>PBS-GS kaldırmak ve PBS-GS IgG birleştiğinde bir yeşil yayan ile her iki keçi Anti-fare içeren yerine (520 nm) fluorophore ve keçi Anti-tavşan IgG birleştiğinde bir kızılötesi yayan (652 nm) fluorophore.</li>
		<li>Antikorlar adım 2.1 yineleyerek kaldırın.</li>
		<li>Oda sıcaklığında immunolabeled doku karanlıkta saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. açıklama doku
<ol><li>3 kez PBS ile örnekleri 10 dakikalık aralıklarla yıkamak.</li>
	<li>PBS bir pipet ile kaldırma ve % 50 etanol ile değiştirerek doku kurutmak (metanol de kullanılabilir). Kuluçkaya için 10 dk. eski yerine koymak ile taze % 50 etanol ve 10 dk. yinelemek için bu bir kez daha 3 incubations toplam için kuluçkaya. İncubations % 70 ile yineleyin. O zaman % 100 etanol ile eski yerine koymak ve 15 dakika boyunca kuluçkaya (metanol alternatif olarak kullanılabilir).</li>
	<li>Mikro-tüp içeren bir taze için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 1 mL çözüm-1 4 h için.</li>
	<li>Bir taze mikro-tüp içeren çözüm-2 için doku ince uçlu Forseps ile transfer ~ 4 h. Not: karanlıkta depolandıklarında, ayirt en az 6 ay için oda sıcaklığında stabil.</li>
	<li>Takas kaybetti herhangi bir sulu çözüm (örneğin montaj orta) ile birlikte kullanmayın.</li>
</ol>4. montaj mikroskopi için
<ol><li>Doku yumuşak ve kolay deforme olduğu gibi bir coverslip ve bir standart cam slayt arasındaki doku bağlanmaz.</li>
	<li>Şekil 5' eB bakın ve aşağıdaki gibi Sykes-Moore odası dokusunda mount;<ol>
<li>İnce uçlu Forseps ile 25 mm yuvarlak coverslip odasında temel yerleştirin.</li>
		<li>İnce uçlu Forseps ile Lastik conta coverslip üste yerleştirin.</li>
		<li>Bir pipet ile bir damla (~ 40 µL) çözüm-2 coverslip ortasına yerleştirin.</li>
		<li>İnce uçlu Forseps ile bir parça doku çözüm-2 den coverslip ortasına düşüş aktarın.</li>
		<li>Conta üst kısmında ikinci bir coverslip bir yer.</li>
		<li>Kilitleme halka coverslips ve conta firma kadar sıkıştırma Bankası üst içine iş parçacığı. Not: aşırı değil sıkın için dikkatli olun ya da coverslip paramparça edecek.</li>
		<li>Bir 22'lik iğne temel ve conta ile bir bağlantı noktasına takın.</li>
		<li>3-mL şırınga ile doldurmak ~ 1,5 mL çözüm-2.</li>
		<li>25'lik iğne şırıngayı bağlayın.</li>
		<li>Şırınga iğne ters bağlantı noktasına ve conta ile ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça çözüm-2and dolgu odası enjekte, odasında hava diğer 25'lik iğne havalandırma sağlamak.</li>
		<li>İğne ve şırınga çıkarın ve odası confocal mikroskop Sahne Alanı'nda bir büyük cam slayt üzerinde yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, özel wells PDMS silikon yaprak dışarı kesmek.<ol>
<li>Bir 25,4 x 25,4 mm2 parça PDMS sayfasından makasla kesme.</li>
		<li>Neşterle kesmek ~ 12,7 × 12,7 mm2 parça halinde de.</li>
		<li>Parça mikroskop slayt üzerine sıkıca basın.</li>
		<li>Kuyu Üst çözüm-2 ile doldurun.</li>
		<li>Doku parça mikro-tüp sizden iyi Center'a aktarın.</li>
		<li>Öyle ki coverslip alt çözüm-2 ile ıslak ince uçlu Forseps ile bir coverslip kuyu üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Confocal mikroskop sahnede Sykes Moore odası derleme doku ile bağlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. confocal mikroskobu
<ol><li>Doku odasında 10 x amacı ile odak haline getirmek.</li>
	<li>Mikroskop sahne yukarı ve aşağı üst ve alt doku arasındaki mesafeyi ölçmek için odak düzlemi arasında hareket eder.</li>
	<li>Sahne alanı üst dokudan yukarıdan aşağıya doğru resimlerle kümesi içeren bir confocal resim dosyasını toplamak için 2.5 µm adımları hareket eder.</li>
</ol>6. açıklığın ters
<ol><li>Takas için bir mikro-tüp içeren > 20 x % 100 etanol hacmi doku aktararak ters. 1 h aralıkları ile % 70 etanol, sonra % 50 etanol ve son olarak PBS değiştirin. Karanlıkta 4 ° C'de depolayın. Not: Şimdi standart parafin yerleştirme, parça ve histolojik dokusu veya immün histochemical boyama işlemi.</li>
</ol>7. deconvolution
Not: aşağıdaki adımları için yazılım komutlar, sekmeler ve aşağı açılan menüleri italik.
<ol><li>Deconvolution yazılımını başlatın ve görüntü dosyasını açın.</li>
	<li>'Summary' penceresinde listelenen parametreleri girin.<ol>
<li>İçin 'serisinde girin Voksel x, y ve z boyutlu µm olarak.</li>
		<li>Her renk kanalı için aþaðý açýlan menüsünden immunostaining için kullanılan floresan boya seçin.</li>
		<li>İçin 'modalite ', lazer tarama Confocal aþaðý açýlan menüsünden seçin.</li>
		<li>İçin 'objektif Lens, 10 x aşağı açılan menüden seçin.</li>
		<li>İçin 'daldırma orta ', hava aþaðý açýlan menüsünden seçin.</li>
		<li>Tıklayın 'Uygula ' düğmesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Deconvolution' sekmesini tıklayın.</li>
	<li>Tıklayın '3D Deconvolution' damla-aşağı yemek listesi içinde.</li>
	<li>Buna '3D - Deconvolution' pencere sigorta ayarlar şunlardır: 1) adaptif PSF kör, 2) teorik PSF, 3) kullanımı (Adaptive PSF varsayılan, 10 yinelemeden, orta gürültü), 4) Bankası adı.</li>
	<li>Tıklayın 'Yeşil onay düğmesine ' programını başlatmak için.</li>
	<li>Ne zaman tamamlanmak, programı yeniden başlatmayı 7.3-7.6 adımları yineleyin. Ne zaman tamamlanmak için üçüncü ve son kez yeniden başlatın.</li>
	<li>İçinde 'Veri Yöneticisi ' pencere, tıkırtı üstünde eğe ile öneki "10-10 - 10-".</li>
	<li>Tıklayın 'dosyası ' sekme, o zaman tıkırtı üstünde 'Farklı Kaydet.</li>
	<li>'A kurtarmaks' penceresinde seçin '8 bitlik işaretsiz tamsayı ' dan 'veri türü ' damla-aşağı yemek listesi ve tıkırtı Kaydet.</li>
</ol>8. görüntü işleme
<ol><li>Fiji yazılımını başlatın.<ol>
<li>Tıklayın 'dosyası ', tıkırtı üstünde 'Açık ' ve Deconvolved görüntü dosyasını seçin ve tıklayın 'Açık ' düğmesini 'Açık ' pencere.</li>
		<li>Tıklayın 'görüntü/renk/Split kanalları ve convert üç renkli görüntü dosya tek bir renk içeren üç yeni dosyaları. İmmunolabeled villous kılcal görüntü kümesi içerir kırmızı görüntü dosyasını kaydedin. Yeşil ve mavi görüntü dosyaları silin.</li>
		<li>Kırmızı görüntü dosyası ile arka plan Floresans çıkarma: 'işlem/çıkarma arka plan '.</li>
		<li>Damla-aşağı yemek listesi 10 piksel Rolling ball yarıçapı ayarlayın.</li>
		<li>4 menü seçeneklerini işaretlemeyin ve tıklatın 'ı '.</li>
		<li>Tıkırtı 'Evet işlem yığın menüsünde.</li>
		<li>Doğal doku floresan (autofluorescence) açarak kaldırmak 'Image/Adjust/Parlaklık-Kontrast ' menü ve minimum, maksimum, parlaklık ve kontrast ayarlarını yaparak. Kapiller ayirt hiçbirini kaldırmak değil dikkatli olun.</li>
		<li>Alakasız Floresans açarak kalan en aza indirmek 'Image/Adjust/eşik ' menü ve öyle ki kılcal ayirt vurgulanır kaydırıcıları ayarlayarak. Kontrol 'koyu arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'Uygula '. Üzerinde 'için ikili açılan dönüştürmek ' menüsü onay 'siyah arka plan ' kutu ve tıkırtı üstünde 'ı '. Analizleri aşağıdaki için siyah ve beyaz (ikili) görüntü dosyası kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. analiz
<ol><li>Nesne sayma ve iskeletleşmiş.<ol>
<li>8.1.8. adımda oluşturduğunuz ikili görüntü dosyasını seçin.</li>
		<li>Tıklayın 'analiz/3D OC seçenekleri ve yalnızca onay 'Birim ' ve 'mağaza sonuç...' damla-aşağı yemek listesi kutuları. Sigorta 'Gösteri numaraları' kutusu seçili değildir. Tıklayın 'ı ' düğmesini.
</li>
		<li>CLIck 'analiz/3D obje Counter'. Açılan menüde ayarla 'boyut filtresi: dk. ' 5000'e. Bunu garantilemek 'kenarları nesnelerde dışlamak kutusudur denetlenmeyen. Şuna bir 'nesnesİstatistikler ve 'Özeti ' kutuları kontrol edilir. Tıklayın 'ı ' düğmesini. Not: Bu dosya boyutu ve bilgisayarın yapılandırmasına bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.</li>
		<li>İstatistik tablo ve nesneleri harita dosyası kaydedin.</li>
		<li>Nesneleri harita dosyasını seçin. Tıklayın 'eklentileri/iskelet/Skeletonize 2D-3D' ikili dosyasında kılcal ağ skeletonize için. Tıklayın 'Dosya/Kaydet olarak. Seçin 'TIFF...' damla-aşağı yemek listesi içinde. TIFF pencere farklı kaydet "içmek" nesne harita dosya adı ekleme ve tıkırtı üstünde 'Kaydet ' düğmesini.
</li>
		<li>Tıklayın 'analiz/iskelet/analiz iskelet 2D-3D'. Damla-aşağı yemek listesi varsayılan ayarları kabul edin ve tıkırtı üstünde 'ı ' düğmesini. Şube 'bilgi' tabloyu kaydedin 'sonuçları tablo ve iki çıktı dosyaları (içmek-nesneler-etiketli - iskelet ve takip edilen iskelet).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+features+of+placental+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Biological features of placental programming.</a> Placenta. 48, Suppl 1 47-53 (2016).</li>
<li>Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+weights+smaller+or+larger+than+the+placenta+predict+BMI+and+blood+pressure+at+age+7+years%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Orig+Health+Dis%22%5BJournal%5D)">Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years.</a> J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).</li>
<li>Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+Origins+of+Chronic+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Placental Origins of Chronic Disease.</a> Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).</li>
<li>Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective+study+of+villous+capillary+lesions+in+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pregnancy%22%5BJournal%5D)">A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies.</a> J Pregnancy. 2014, 193925(2014).</li>
<li>Jones, C. J. P., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+possible+function+for+placental+pericytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">A new possible function for placental pericytes.</a> Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).</li>
<li>Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histomorphometric+study+of+placental+villi+vascular+volume+in+toxemia+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes.</a> Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).</li>
<li>Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+transcriptional+activity+in+the+syncytiotrophoblast+of+the+human+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta.</a> Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).</li>
<li>Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. <a target="_blank" href="https://www.ias-iss.org/ojs/IAS/article/view/820">3-D study of vessels in peripheral placental villi.</a> Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).</li>
<li>Pearce, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-Based+Modeling+of+Blood+Flow+and+Oxygen+Transfer+in+Feto-Placental+Capillaries%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries.</a> PLOS ONE. 11 (10), 0165369(2016).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+modeling+of+the+structure-function+relationship+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi.</a> J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).</li>
<li>Mayhew, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereological+perspective+on+placental+morphology+in+normal+and+complicated+pregnancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies.</a> J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).</li>
<li>Teasdale, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+changes+in+the+functional+structure+of+the+human+placenta+in+relation+to+fetal+growth%3A+a+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study.</a> Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(15)00837-5">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R., Vogt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque+formation+and+isolation+of+pure+lines+with+poliomyelitis+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses.</a> J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).</li>
<li>Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+oxygen+transport+in+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling oxygen transport in human placental terminal villi.</a> J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).</li>
<li>Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modeling+of+human+placental+terminal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modeling of human placental terminal villi.</a> Placenta. 43, 54-60 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Kurumsal değerlendirme Komitesi electively sonlanmış gebeliklerin üzerinden formalin fiksasyon için plasenta villous doku topluluğu onayladı. Yordamlar gerçekleştirilmesi için önce tıbbi kayıt kısa bir tekrarıdır maternal yaş, eşlik, kaydetti ve herhangi bir (örneğin, hipertansiyon, şeker hastalığı ve lupus) altta yatan tıbbi ya da cenin (yapısal veya Kromozom anomalileri, yokluğu doğruladı anormal büyüme) gerçekleştirildi. Veri sayfası ve herhangi bir toplanan numuneler sadece ...

Gelişen plasenta ve onun patolojiler anlayışımızı büyük ölçüde bitişik villus ve histolojik kesitler elde bulunan kılcal damarlar arasındaki uzamsal ilişkileri anlaşılmaktadır için sınırlı. Bu çalışmada, biz üç boyutlu (3D) kaplamalar kılcal ağ özellikleri (dallanma, Kesintisizlikörneğin ) analizleri için uygun insan plasental kılcal damar ağları oluşturmak için bir araç geliştirerek bu sorunu ele sahip. Bunu yapmak için iki ticari doku Temizleme ürünleri, Visikol-1 ve Visikol-2 (aşağıda çözüm-1 ve çözüm-2 anılacaktır) ile immünfloresan boyama birleştirdik.
İnsan plasenta kan damarlarının anne intervillous kan ve gelişmekte olan fetus arasında arayüz bulunan büyük bir kompleks olduğunu. Dışarı onun ekleme koryonik plaka içine uzanan, göbek kordonu atar ve toplar damarlardaki ayrıntılı damar ağıyla koryonik yüzey kapsayacak şekilde ramify bir ağ içine dalları. Amaçları sonra aşağı iç ya da nerede birçok daha dallanma nesiller geçmesi ve bitir, terminal villus ve içerdiği kapiller ağlarına gazlar, besin, Satım sitesi plasental disk derinliği içine nüfuz ve metabolik Fetal-maternal kan kaybı.
Plasental kapiller ağ geliştirme sırasında hakaret fetus, yeni doğan bebek ve acil yetişkin 1,2,3sağlığı için kalıcı sonuçlar doğurabilir. İçinde görüş-in gebelik ile ilgili patolojiler düşük, intrauterin büyüme kısıtlama, gibi ön eklampsi ve maternal diyabet 4,5,6 orada ölçüm yöntemleri geliştirmek üzerine yerleştirilen bir yüksek değerdir ve plasental villous kılcal damar ağları karakterizasyonu. Büyük bir barikat plasental damar ağları geniş ölçekli bir kapsayacak var. Yüzey damar ağları olarak 4-5 mm çapında büyük olabilir. Terminal villous kılcal damar çapı 10 -20 µm sırasına vardır; Plasenta kan damarlarının 7300 km üzerinde içerir. Şu anda, bu büyük gemi ölçek-ebilmek esir alma birkaç kolay ve hızlı teknikleri vardır. Bugüne kadar az sayıda villus mikroskobu tarafından işlenebilir. Örneğin, Jirkovska ve ark. plasental villus dönem confocal mikroskobu 120 µm kalınlığında bölümlerden elde edilen 1 µm aralıklarla seri optik bölümleri birleştirme duruldu; veri yokken okudu örnekleri ne de istatistik sayısı 8temin edilmiştir. Kılcal damar yapıları tespit edilmiştir ve çizilmiş, görüntü analizi için ihraç tracings ile kontür villus ve kılcal damarlar. Yazarlar ve bulguların "büyüyen villous damar ağı için" etkileri komisyonda görüşürken, zaman sadece "terimi" (36 + hafta gebelik yaşı) doku eğitimi böyle sonuçlara sorunlu. Benzer şekilde, Mayo et birl. ve Pearce ve ark. dayanıyordu kan akışı ve oksijen transferi, onların simülasyonları için aynı yaşta dokular ama onların analizleri sadece birkaç terim, terminal villus 9,10 sınırlı idi . Stereology da villous damarlarının yapısını çalışma odasına uygulanmıştır. Ama yine, odak genellikle daha sonraki gebelikler ile bir veya daha fazla gebelik komplikasyonları 11,12liveborn bebekler teslim olmuştur.
Yakın zamana kadar confocal mikroskobu emme uyarma ve floresan emisyon nedeniyle örten doku 13 tarafından 100-200 µm derinliklerinde doku görüntüleme sınırlıydı. Geri dönüşümsüz hiperhidrasyon aracılığıyla hücresel Morfoloji zarar olsa takas doku ve 3D Histoloji yaygın olarak literatürde tarif edilmiştir ve orada birçok takas doku için çok sayıda yöntem genel olarak, dokular ile kullanım için uygun olmayan proteinler veya lipidler kaldırılması. Bu nedenle, bu sonuçlar doku kendisi ve temizleme işlemi bizim doku karşı geleneksel Histoloji doğrulayamıyor tersinir bir tekniktir, ancak işleme gelen eserler göstergesi olduğunu doğrulamak mümkün değil. Doku takas genellikle üç ana yaklaşımdan birini içerir: 1) nedeniyle sürekli mercek neden toplu ışık saçılma kaldıran batma RI eşleşen çözümlerinde tarafından Tekdüzen kırılma indisini (RI) doku bileşenlerinin eşleştirme dalgalanma düşük RI (sitozol) ve yüksek RI (protein/lipidler) bileşenlerinin; 2) hidrojel gömme ve lipid bileşenleri kaldırmak için Elektroforez/Difüzyon kullanmak yoluyla lipid bileşenleri kaldırma; 3) artan penetrasyon çözücüler RI 13tekdüzelik teşvik etmek için izin vermek için protein yapısının genişleme/denatürasyon. Bu yaklaşımlar doku şeffaf render ve biyolojik 3D temsilleri için oluşturulmasına izin ver, bu görüntüleri doku özelliklerini gösterge olup olmadığını belirlemek zor olduğu gibi bu 3D temsilcilikleri şüpheli klinik değeri iken veya takas işlemi doku. Bizim doku takas geri dönüşümlü olduğundan Öte yandan, standart histolojik ve/veya immünhistokimya değişiklikler klinik olarak anlamlı olup aynı doku uygulanabilir.
Bu çalışmada bir analiz toplam 23 klinik olarak normal ve electively sonlanmış gebeliklerin 9-23 tamamlanan haftalık gebelik ve iki tam dönemlik normal teslimatlar arasında elde edilen 47 distal villous örnekleri sunar. Ayirt etiketleme Trofoblast ve endothelia villous damar ağları ve onların karmaşıklığı değişiklikler bir nicel ve otomatik analiz sağladı.
Bu protokol ile izole ve terminal villus ve kapiller ağlarına mümkün değil bir ölçekte daha önce analiz etti. Villous ve kapiller ağ geliştirme için gebelik uygulandığında bu yaklaşım sağlıklı bir çocuk doğum için temelidir bu özellikleri tanımlar. Karmaşık gebelik çalışmaları için uygulandığında, Ayrıca zaman ve plasental patolojileri villous ağaçlar ve onlar kılıf kılcal damar ağları değiştirmek ve bunlar fetal iyilik üzerinde vurmak nasıl açıklığa kavuşacaktır.

<table><tbody><tr><td>10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>H-121-08</td><td>General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic</td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-916-5B No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>78354-119</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tube (1.7 mL)</td><td>PGC Scientifics</td><td>505-201</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>VWR</td><td>52947-948</td><td>disposable, 3ml transfer pipette</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Boehriner Mannheim</td><td>789 704</td><td>Dilute to 0.1% from stock</td></tr><tr><td>Goat Serum</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td>Dilute to 2% in PBS solution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MS-1352-RQ</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-CD31 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td></td></tr><tr><td>green emitting (520 nm) fluorochrome&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>Alexa-Fluor 488</td></tr><tr><td>infrared emitting (652 nm) fluorochrome</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>Alexa Fluor 633</td></tr><tr><td>Ethanol alcohol 200 proof</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td>Dilute down to lower concentrations using PBS as needed</td></tr><tr><td>Solution-1</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-1</td></tr><tr><td>Solution-2</td><td>Visikol Inc.</td><td></td><td>Visikol Histo-2</td></tr><tr><td>Skyes-Moore chambers</td><td>BellCo Glass Inc.</td><td>P/N 1943-11111</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-826AA</td><td>BD Precision Glide Needes</td></tr><tr><td>3 mL syringe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-40</td><td>BD disposable syringe</td></tr><tr><td>PDMS silicon sheets</td><td>McMaster-Carr</td><td>P/N 578T31</td><td></td></tr><tr><td>confocal microscope</td><td>Nikon Inc.</td><td></td><td>Nikon C1 Confocal Microscope</td></tr><tr><td>Deconvolution software</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td>AutoQuant X22</td></tr><tr><td>Fiji image processing software</td><td></td><td></td><td>free, Open source&amp;nbsp; software available at https://fiji.sc</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801570</td><td>Component 1 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Alcoholic Eosin</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801615</td><td>Component 2 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Blue Buffer</td><td>Leica Biosystems</td><td>3802918</td><td>Component 3 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Aqua Define MCX</td><td>Leica Biosystems</td><td>3803598</td><td>Component 4 of SelecTech H&amp;amp;E staining system</td></tr><tr><td>Immunohistochemistry detection system</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TL-125-QHD</td><td>UltraVision Quanto Detection System HRP DAB</td></tr></tbody></table>

three-dimensional rendering and analysis of immunolabeled, clarified human placental villous vascular networks

Anne intervillous kan ve insan plasenta parankimi çoğunu yapar büyük villous kılcal ağ arabiriminin, anne ve fetüs arasındaki besin ve gaz değişimi gerçekleşir. Distal villous kılcal damarları dışarı--dan göbek kordonu uzanan dallanma birkaç kuşak sonra fetal kan akımı terminus ağıdır. Bu ağ bir bitişik hücresel kılıf, fetal kan karıştırma engeller sinsisyal Trofoblast bariyer tabakası ve içinde sürekli boğulmuş olduğunu maternal kan var. Maternal diyabet, hipertansiyon ve obezite, gibi bozukluklar meydana plasental kılcal ağ bütünlüğü için hakaret fetus, çocuk ve yetişkin için bu mevcut ciddi sağlık riskleri doğurabilir. Bu hakaret yapısal etkileri daha iyi tanımlamak için bir protokol kılcal ağ yapısı onda bir topolojik özellikleri tam karmaşıklığı içinde araştırmak için 1-2 mm3 sırasına yakalar Bu çalışma için geliştirilmiştir. Terminal villus kümeleri plasenta üzerinden bunu yapmak için disseke ve Trofoblast katman ve kapiller endothelia immunolabeled vardır. Bu örnekler o zaman confocal görüntü yığınları z-~ 1 mm derinliklerinde elde etmek olanaklı kılan süreci temizleyerek yeni bir doku ile açıklık. Bu yığınlar üç boyutlu render sonra işlenir ve bu yaklaşım için uygunluğunun doğrulanmasını birim, kılcal damar dalları ve kapiller şube bitiş noktaları, sayısı gibi temel kapiller ağ tedbirler oluşturmak için analiz kapiller ağ karakterizasyonu.

İnsan 8 hafta gebelik yaşı vadeli teslim için plasenta içinde terminal villus kümeler halinde kılcal oluşturulan 3D render bireysel kümeleri sayılır ve ağ analizi için Iskeletlenmiş. Fonksiyonel plasenta (şekil 1A) yüzey gemileri nerede onlar plasenta parankimi (şekil 1Bve genişlemiş içinde 1 C) nüfuz bir uzantısı olan villus ağaçlar birimleridir. Bir dis...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks at JoVE.com

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

three-dimensional-rendering-analysis-immunolabeled-clarified-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Görüntüleme.  The New York State Office for People with Developmental Disabilities. Bu çalışmada tersinir doku takas, immunostaining, 3D işleme ve analiz insan plasenta villus örneklerinde sırasına 1-2 mm3damar ağları için bir protokol sunar.

Video: Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Gelişim Biyolojisi

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia polycythemia sequence (TAPS)1,2. Injection studies of twin placentas have shown that such anastomoses are almost invariably present in monochorionic twins and extremely rare in dichorionic twins1. Three types of anastomoses have been documented: from artery to artery, from vein to vein and from artery to vein. Arterio-venous (AV) anastomoses are unidirectional and are referred to as "deep" anastomoses since they proceed through a shared placental cotyledon, whereas arterio-arterial (AA) and veno-venous (VV) anastomoses are bi-directional and are referred to as "superficial" since they lie on the chorionic plate. Both TTTS and TAPS are caused by net imbalance of blood flow between the twins due to AV anastomoses. Blood from one twin (the donor) is pumped through an artery into the shared placental cotyledon and then drained through a vein into the circulation of the other twin (the recipient). Unless blood is pumped back from the recipient to the donor through oppositely directed deep AV anastomoses or through superficial anastomoses, an imbalance of blood volumes occurs, gradually leading to the development of TTTS or TAPS. The presence of an AA anastomosis has been shown to protect against the development of TTTS and TAPS by compensating for the circulatory imbalance caused by the uni-directional AV anastomoses1,2. 
Injection of monochorionic placentas soon after birth is a useful mean to understand the etiology of various (hematological) complications in monochorionic twins and is a required test to reach the diagnosis of TAPS2. In addition, injection of TTTS placentas treated with fetoscopic laser surgery allows identification of possible residual anastomoses3-5. This additional information is of paramount importance for all perinatologists involved in the management and care of monochorionic twins with TTTS or TAPS. Several placental injection techniques are currently being used. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of (residual) vascular anastomoses using colored dye injection.

Twin-to-twin transfusion syndrome and twin anemia polycythemia sequence are two potentially devastating problems in perinatal medicine. Both disorders occur only in monochorionic twins and result from unbalanced blood flow through placental vascular anastomoses. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of vascular anastomoses using colored dye injection of placental vessels after birth.

Renkli Boya kullanarak Monokoryonik Plasenta vasküler anastomozlar doğru ve basit Değerlendirme

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Tıp

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Akış Tabanlı Bir Yaklaşım Kullanarak Ex Vivo Plasental Ekzplant Kültürünün İyileştirilmesi

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

Yazar Spotlight: Plasental Dokularda Tek Hücre Dizilimi ve Mekansal Histoloji Yoluyla Araştırmayı İlerletme 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Doku temizleme ve floresan etiketleme kullanarak retinal perisitlerin görselleştirilmesi

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi 

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Fare Uterus içinde Gebelikte maternal Vasküler Yaptırma Değerlendirilmesi

Renkli Boya kullanarak Monokoryonik Plasenta vasküler anastomozlar doğru ve basit Değerlendirme

Bir In vitro 3D model ve hesaplamalı boru hattı PSC-türetilen endotel progenitors Vazculogenik potansiyelini ölçmek için

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Ex Vivo (Canlı Canlı) Plasental Eksplant Akış Kültürü - Utero'daki Dinamik Koşulları Taklit Etmek

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi

Farelerde Retinal Vasküler Perisitlerin İmmün Boyama ile 3D Görüntülenmesi