Bu işlemin genel amacı Drosophila nöronal gelişim sırasında dendritik arborization nöronların karmaşıklığı Üzerinde SOX5 geninin etkisini gözlemlemektir. Bu yöntem nörodejeneratif hastalık genlerini daha iyi anlamak için nöro-dendritlerin morfogenezinin ve sinir sisteminin gelişimindeki gen fonksiyonunun incelenmesine yardımcı olabilir. Sonuçta bu teknik nöro-dendritler birçok farklı tipte kullanılabilir dendritler karmaşıklığı, bir nicel analiz sağlar.
Mutasyon gen fonksiyonunu anlamak için anahtar tutar, çünkü bu tekniğin etkileri nöro-dejeneratif hastalığın genetik mekanizması doğru uzanır. UAS-GFP'nin kurulum çaprazları;ppk-GAL4 ile UAS-Sox102F-RNAi suşu sinekleri veya W118 kontrolleri. Kültür 25 santigrat derecede standart koşullar altında uçar.
Yaklaşık beş ila altı gün içinde, dikkatle diseksiyon için üçüncü instar larvaları toplamak için forseps kullanın. Silikon elastomer tabanından yapılmış bir diseksiyon kabına ve doku kültürü Petri kabına bir larva yerleştirin. Sonra diseksiyon mikroskobu altında çanak yerleştirin.
Şimdi orta hattı ortaya çıkarmak için larva kuyruğunu sabitle. Sonra larva ağız kancaları pin böylece larvanın dorsal tarafı kadar. Şimdi larva çözeltisi batırmak için çanak PBS 200 mikrolitre ekleyin.
Sonra, küçük kesiler ile larva kuyruk ve ağız kesti. Sonra dorsal orta hat boyunca ve iki trakea arasında larva açık kesip, rostral için kaudal gidiyor. Sonra vücudun dört köşesinin her birine bir iğne yerleştirin, böylece vücut düz yatıyor.
Şimdi oda sıcaklığında 25 dakika boyunca% dört PFA larva vücut duvarı düzeltmek. Daha sonra larvayı PBS ile üç kez yıkayın ve yıkama başına beş dakika yıkayın. Yıkar sonra, pimleri çıkarın ve bir cam slayt üzerine doku aktarın.
Daha sonra dokuyu antifade montaj ortamına batırın ve bir kapak fişi ile monte edin. Kulak lığı üzerine tırnak cilası ile sızdırmazlık yapmadan önce monte edilen dokunun bir saat boyunca kurumasını bekleyin. Bu slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.
20X hedefi kullanarak bir konfokal mikroskop ile z-serisi görüntüleri yakalayın. İlk olarak, larva vücut duvarında DA nöronların tüm içerecek şekilde z-adımlar aralığı ayarlayın, ve yarım mikrometre için adım boyutunu ayarlayın. Ardından görüntüleri işlemek için TIF veya ND2 dosyaları olarak saklayın.
Daha sonra, DA nöronlar üzerinde dendritlerin sayısı ve morfolojisi değerlendirmek. Uzunluklarını değerlendirmekle başla. İlk olarak, Fiji ImageJ'de, gerekirse görüntüleri ayrı kanallara bölün.
Sadece GFP kanalının değerlendirilmesi gerekir. Sonra, bir z-projeksiyon yapmak. Yeni pencerede, projeksiyon türü için maksimum yoğunluğu seçin ve dilimleri başlat ve durdur'u seçin.
Ardından, net dendrite projeksiyonları içeren bir z-projeksiyon görüntüsü oluşturmak için Tamam'ı tıklatın. Şimdi eklenti aracını kullanarak nöritlerin izini sür. İlk olarak, ilgi nöron soma gidin ve bir dendrite hücre vücudundan ortaya çıktığı yere tıklayın.
Sonra bu dendrite ucunda tıklayın. İki noktayı birbirine bağlayan mavi çizgi neuritin uzunluğunu çalıştırıyorsa, evet için Y tuşuna basın. Daha sonra bu satır neurite tam yol uyuyorsa, tam yol tıklatın.
Çizgi yola uymuyorsa, yolu neuritin uzunluğuna uyacak birden çok satır segmentine bükmek için bu neurite boyunca daha ilerideki noktalara tıklayın. Sonra, tam yol tıklatın ve bir sonraki neurite için yol işaretleme ile devam edin. Tüm izleme yollarını tamamladıktan sonra, yolları bir CSV dosyasına aktarmak için Çözümleme, Yolları Ölçüle seçeneğini seçin.
Çözümleme için yol uzunluklarının ortalama değerini hesaplamak ve ortalama değeri için bu verileri kullanın. Sonra, nöronun yüzey alanını hesaplayın. İlk olarak, Fiji ImageJ penceresinden ücretsiz el çizim aracını seçin.
Sonra, ilgi nöronun bitiş noktaları bağlayın. Ardından, Çözümle penceresinden Ölçüle seçeneğini belirleyin. Sonuç, seçilen alanın değerine sahip yeni bir kutuda görünür.
Bu değeri veri çözümleme yazılımına kopyalayın. Son olarak, İskeletize Yolları Çözümle eklentisini kullanarak toplam dal sayısını hesaplayın. DA nöronların dendritleri, GFP floresangörüntüleme analizi için soma ve dendrit arbors'larında gfp'yi aşırı eksprese ederek etiketlendi.
Dendritlerin morfolojisi ters konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi. DA nöronların dendritleri tarif edildiği gibi izlendi. Dosya dendrite uzunluğunu tahmin etmek için kullanıldı.
Üçüncü instar larvasında DA nöronlarında Sox102F'nin susturulması, dal uzunluğunun yaklaşık yarısı ve daha basit bir yapıya sahip dendritlerin toplam sayısında önemli bir azalmaya yol açmış ve dal sayısının sadece yarısını göstermiştir. Mantıksal olarak, bu arbor yüzey alanında azalmaya yol açtı. Bu protokol DA duyusal nöronların gelişimini değerlendirmek için hızlı bir yöntem sağlar.
Bu yordamı çalışırken, iyi bir kapsama almak için DA nöronlar her grup görüntüleri bol sayıda almak için emin olun. Bu prosedürü takiben dendrite gelişimi ile ilgili ek soruları cevaplamak için dendrite analizi gibi diğer yöntemler de uygulanmaktadır. Bu gelişme beri, bu teknik nörolojik alanında araştırmacılar Alzheimer model sistemleri kullanarak gibi nörodejeneratif hastalık içine çıkarımlar yapmak yardımcı oldu.
