Dikkatle el yazması okumak için Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann ve Walker Jackson teşekkür ederim. , Nörodejeneratif Hastalıklar Mükemmeliyet Merkezleri (COEN, yazarlar devlet Northrhine-Westfalia (SR), hesaplama nörobilim BMBF-Projekträger DLR ABD-Alman işbirliği (SR CRCNS) araştırma MIWF Bakanlığı tarafından sağlanan fon aldı; SR) ve Bonn intramural finansman programının Üniversitesi (BONFOR, SR).

1. Sistem Gereksinimleri <ol><li> Mikroskop sistemi: dendrit iyi görselleştirme önemlidir. Varsa, bir iki foton lazer tarama mikroskop sistemi kullanın. Sapphire ultra-darbeli lazer (Chameleon Ultra II, Tutarlı) ve yüksek NA amacı: Deneylerde bir Ti ile donatılmış bir TRIM Kapsam II, LaVision Biotec, Bielefeld, Almanya ya da Ultima IV sistemi, Prairie Teknolojileri, Middleton, Wisconsin kullanılan (60X, 0.9 NA, Olympus) biz yama pipet ile bir floresan boya ile dolu olan dendritler görselleştirmek için. Fotoğraf-zarar 2-foton tarama kullanarak daha hafif olduğu düşünülmektedir rağmen, lazer gücü azaltmak (dokuda altında 8 mW) ve bekleme süreleriyle (aşağıda 1 mikrosaniye) veya mümkün olduğunca. </li><li> İkinci bir olasılık mümkün olduğunca maruz kalma süresini azaltmak için satın alma ile eşzamanlı bir geniş alan floresan ışık kaynağı (LED veya floresan lamba) tetiklemek için olduğunu. Biz entegre bir ışık kaynağı (TILLPho bir monokromatör kullanmışDodt kontrastlı kızılötesi aydınlatma (TILLPhotonics, Gräfelfing, Almanya) ile donatılmış bir Zeiss Axioskop 2 FS dik mikroskop tonikler, Gräfelfing, Almanya). Deneylerde pozlama süreleri msn genellikle 10 maks değişmektedir. 30 msn. </li><li> Iki kanallı mikro-iyontoforez sistemi örneğin Kızamık aşılamasından-C-02 (npi elektronik, Tamm, Almanya) hızlı kapasitans tazminat ile., Hızlı mikro-iyontoforez amplifikatör kullanın Ince uçlu iyontoforez Mikroelektronlar 25 dirençleri var - MQ 100 (en önemlisi ucu boyutu ve pipet şekline bağlı olarak), ve iyontoforez amplifikatör kapasitans tazminat en iyi şekilde ayarlanmış ise hızlı artış kez elde edilebilir. Bu hızlı tazminat iyontoforez pipet için alt milisaniye aralığında kısa ve hızlı başlayan akım darbeleri uygulamak ve böylece 1 mikron 13 aşağıda yer boyutlarda yüksek uzaysal çözünürlüğü ile verici çıkarmak için gereklidir. İyontoforez amplifikatörler al vardırbizim laboratuvarda test değil diğer bazı şirketler, bu kadar kullanılabilir. Bu cihazlar kapasite tazminat devresi ile donatılmış değil bilgimizi için vardır. </li></ol> 2. Çözümler hazırlayın <ol><li> Yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ve deney tasarımı için gerekli olduğu gibi iç çözeltisi hazırlayın. Gerekli iç çözüm, tek sıra optik donanım bağlı olarak kırmızı veya yeşil floresan boya (örneğin 50 ila 200 mcM Alexa Fluor 488 veya 594 hidrazin Invitrogen) &#39;dir. Ve normal ACSF için, 60 NaCl, 100 sukroz, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glukoz: mM diseksiyon için kullanılabilir ACSF sukroz, burada bir örnek mM olarak patch-clamp deneyler solüsyon: 125 NaCI, 3 KCI, 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 2.6 CaCl2, 1.3 MgCl2, 15 glukoz. </li><li>Tüm dışı çözümler sürekli olarak (% 95 O 2,% 5 CO 2) Carbogenize. </li><li> MM olarak, örneğin, iç çözeltisi hazırlayın: 140 K-glukonat, 7 KCI, 5 Hepes-asit, 0.5, MgCl2, 5 fosfat, 0.16 mM EGTA, 50 - 200 uM Alexa 488. </li><li> Glutamat için mikro-iyontoforez 150 mM glutamik asit, bir çözelti hazırlamak ve NaOH ile pH değeri 7.0 &#39;ye ayarlayın. 50 -200 mcM Alexa Fluor 488 veya görselleştirme için 594 hydrazide (Invitrogen) ekleyin. </li><li> GABA iyontoforez 1 M&#39;lik bir çözeltinin hazırlanması GABA ve HCl 15 5 ile, pH yi ayarlamak için. Bu pH GABA tahsil edilir de, ancak o zaman iyontoforez ile uygulanabilir. Çözümünde düşük pH GABA iletim kendisi 16,17 etkileyebilecek dışı alana atılan lütfen unutmayın. Işıktan GABA çözüm korumak ve eski çözüm etkinliğini kaybedebilir çünkü sık sık, taze GABA stok solüsyon hazırlanır. </li><li> Bu GABAerjik olaylar, bir hi görmek zor isegh Cl - itici güç iç çözüm, KCl bırakarak, örneğin, GABA iyontoforez çalışıp çalışmadığını görmek için GABAerjik olayları görselleştirmek için yardımcı olabilir, ancak fizyolojik bir itici güç tavsiye olabilir sinaptik entegrasyon araştırmak. Küçük GABAerjik olayların genel tespiti için, Şekil 8C gösterilen bir protokol yardımcı olabilir. </li></ol> 3. İyontoforez Pipetler çekin ve test edin <ol><li> Genel olarak, doğru pipetler çekerek belki kontrollü nörotransmitter iyontoforez elde etmek için en kritik adımdır. Hücre kültüründe iyontoforez kullanırken, 10 keskin bir mikroelektrot benzer çok ince elektrotlar çekmek mümkündür. Bunlar, bir açı ile dokuya indirildiğinde akut dilimleri içinde patch-clamp deneylerde, ancak, bu çok ince olan pipetler imkansız derin dendrit ulaşmak için yapım kesit yüzeyi üzerinde eğilir. </li><li> Bu nedenle, bu yüzden, çok küçük bir ucu ile bir pipet çekin hiçbir neurotransmitter dışarı sızıntı olabilir, ancak yine de ucu doku (Şekil 2) içine geçmek için yeterince sert olması gerekir. Veya P-97 Çektirme, Sutter Instrument Company, örneğin, 150 GB F 8P sınıf pipetler (Bilim Ürünleri, Hofheim, Almanya) ve yatay çektirmesi (örneğin bir DMZ-Evrensel Çektirme, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Almanya kullanın , dik bir açı ile (Şekil 2 ve Tablo 2) ile birlikte küçük bir delik, aynı zamanda, bir kısa uzantılar elde etmek için çeşitli çekme adımları Novato, CA). </li><li> Bu iyontoforez pipetler 10 çekmek için kuvars cam pipetler kullanmak da mümkündür. Bu daha iyi mekanik özelliklere sahip olduğu ve daha güvenilir olması gerekiyordu, ancak özel lazer Elcikler gereklidir. Ama genellikle yama pipetler çekme için kullanılan normal bir cam pipet ile iyi sonuçlar elde etmek de mümkündür. </li><li> İlk için kullanmadan önce, doku olmayan bir çember içinde pipet performans ve direnç testizaman, glutamat kaçak yana doku zarar verebilir. </li><li> Doğru iyontoforez amplifikatör ayarlayın. Daha sonra nörotransmitter ve boya içeren çözüm ile pipet doldurun ve banyo (ACSF) içine yerleştirin. </li><li> Kapasitans (Şekil 3) telafi. Genellikle çok keskin pipetler künt olanlardan daha yüksek bir kapasite olacak. </li><li> Pipet direnci kontrol edin: Burada kullanılan mikro-iyontoforez amplifikatör pipet direnci ölçmek için bir yap-özelliği vardır. Bu standart bir osiloskop veya satın alma yazılımı ile bir bilgisayara bağlı bir A / D kurulu ile izlenebilir kısa dikdörtgen test darbeleri, çağrıştırıyor. Şekil ve ucu boyutuna bağlı olarak, uç 25 arasında bir dirence sahip olmalıdır - MQ 90. </li><li> Pipet dışında floresan boya akarsa, bir 60X veya 40X suya daldırma hedefi ve floresan görüntüleme geçiş ile ve mümkünse ucu odaklanın, yaklaştırma, (glu durumunda küçük bir olumlu uygulamaktamate) veya negatif (GABA, Şekil 4 ile ilgili olarak) (&lt;0.02 uA) akım korur. Bu kaçak iptal etmek için işe yaramazsa, pipet değiştirin. </li><li> Güçlü bir adım mevcut uygulama veya manuel tetik kullanımı ve çözüm pipet dışına çıkarılır olabilir görmek için floresan görüntü ucu izlemek. Yukarıda belirtildiği gibi, mevcut darbe kutup çıkartılabilmesi için gerekiyordu molekülün yük bağlıdır. Glutamat çıkarmak için bir negatif akım ve GABA olumlu akım (Şekil 4) için. Olduğu </li><li> Boya ve verici blok çıkarma, yüksek ejeksiyon akım birkaç kez uygulanarak giderilebilir ki pipet hava kabarcıkları var. </li><li> Hiçbir görünür sızıntı olup testi ejeksiyon başarılı olup olmadığını, Birlikte ele alındığında, kapasite telafi ve deney başlar. </li><li> Dikkat: kapasitans tazminat bir geri besleme devresi ile elde olduğundan, bu devre aşmayı olabilir veya overcomp ise salınımensated. Yavaşça kapasite tazminat için arama ayarını kullanın. </li><li> Filament özellikleri değişmiş olabilir bu yana çektirmesi istikrar bağlı olarak bu, bazen zaman zaman çektirmenin ayarlarını yapmak için gereklidir. Bir kere iyi bir pipet tasarlanmıştır, ancak birkaç gün için kullanılabilir. Bu nedenle, bitirdikten sonra deney ucu zarar vermeden kapalı bir kapta iyontoforez pipet saklayın. </li><li> Bir sonraki deneme nörotransmitter çözüm pipet doldurmak için, ucu açık ve daha sonra özellikleri (örneğin direnci) değişirse önemli ölçüde kontrol etmek için birkaç güçlü çıkarma bakliyat geçerlidir. Daha sonra kapasite telafi ve tekrar pipet kullanın. Farklı nörotransmitter çözümleri ile tek bir pipet kullanmayın. </li></ol> 4. Beyin Dilimleri hazırlayın <ol><li> Mikro-iyontoforez ilk defa kullanılırsa kesinlikle güvenilir çalışma çektirmesi programı kurduktan sonra dilimleri hazırlamak. </li> &lt;Kurumunuzun ya da yerel otoritenin hayvan bakımı kurallarına uygun olarak li&gt; Perform anestezi ve baş kesme işlemleri. </li><li> Beynin çıkarıldıktan sonra, buz soğuk ACSF sakaroz (Protokol 2.1) aktarın. </li><li> Uygun kalınlıkta dilimler (örneğin 300 mikron) içine ilgi bölgesi kesin. </li><li> 30 dakika boyunca 35 ° C&#39;de ACSF sükroz dilimleri inkübe edin. Daha sonra, oda sıcaklığında normal ACSF içeren bir batık tutma odasına aktarabilirsiniz. </li><li> Hazırlanması ve deney boyunca% 95 O 2,% 5 CO 2 ile dilim çevreleyen ACSF carbogenize. </li></ol> 5. Bir Tüm hücre Kayıt oluşturulması <ol><li> Tam hücreli modu kurduktan sonra, uzun süreli konumlandırma önlemek için, yama bir hücre önce dilim yüzeyine yakın zaten iyontoforez pipet (ler) yerleştirin. </li><li> Düşük dirençli bir yama pipet (3 - MQ 5) çekin, d ile doldurunye iç çözüm içeren ve pipet pozitif basınç (30 - 60 mbar) geçerlidir. </li><li> Görsel gözetiminde banyo ve yaklaşım hücre (kızılötesi Dodt kontrast veya iki foton degrade kontrast görüntü) girin. </li><li> Gerilim kelepçe modunda bir test darbe (örneğin -10 mV, 20 msn) ile pipet direnci izleyin. Doku ofset potansiyel düzeltmek dokunurken. </li><li> Hücre yaklaşım ve hafifçe açıkça görülebilir bir &quot;çukur&quot; kadar içine pipet itin. 60 mbar negatif basınç ve -65 mV membran potansiyeli geçiş - hemen pipet basınç serbest, 40 geçerlidir. </li><li> Tutma akımı 100 pA altındaki değerler ulaştığında, negatif basınç bırakın. </li><li> Bir giga mühür kurduktan sonra (direnci&gt; 1 GΩ), pipet veya kapasitans tazminat devrenin kısa aşırı telâfi için kısa, güçlü emiş gücü ile kopma membran. </li><li> Moda bağlı olarak (gerilim veya akım kelepçe) gereklidirdeneysel tasarım için, uygun telafi. </li><li> Nihai konumuna iyontoforez pipet getirmek için başlayın. Başarılı bir yama kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için nasıl daha ayrıntılı bir açıklama gerekiyorsa, 18,19 kullanılabilir harika birkaç kurallar vardır. </li></ol> 6. Iontophoretic Pipet yerleştirin ve postsinaptik Iontophoretic Potansiyel Oluştur <ol><li> Genel olarak, iyontoforez olaylar soma GABA ya da mikro-İyontoforez akson başlangıç ​​çizgi parçasının, dendritik şaftında, glutamat mikro iyontoforez bir dikenli dendrit de, örneğin, arzu edilen deneye bağlı olarak tanımlanan konumlarda uyarılmış olabilir. </li><li> Dokunmadan yaklaşık 1 mikron mesafe için hücre kadar Yaklaşım. Ilgi konumunu ulaştıktan sonra hiçbir nörotransmitter dışarı sızdıran ve pipet kapasitans doğru telafi olduğu olduğu çok önemlidir. </li><li> Glutamat ile hücre yaklaşan iyontoforetik pipett doldurulduğundae membran potansiyeli tespit depolarizasyon neden, mümkünse mevcut korumak ayarlamak, ya da pipet değiştirin. </li><li> , Kısa negatif akım darbeleri uygulayın sıfırdan başlayarak ve (örneğin 0,1-0,4 msn, 0,01-1 uA bakliyat) sistematik akım artar. Bu iyontoforez mevcut spesifik deneysel olarak istenen yanıtları set-up çağrıştıran hangi aralığında öğrenmek için yardımcı olur. </li><li> Yanıt tespit varsa, pipet birkaç yüz mikrometre kaldırmak ve ucu temizlemek için (&gt; 0.1 uA) güçlü bir çıkarma akımı uygulanır. , Kapasite tazminat ayarlayın hücre yaklaşım ve yeniden deneyin. </li><li> Yanıt hala var ise, mevcut muhafaza azaltır. Bu işlem kontrolsüz nörotransmitter salınımına neden olabilir bu yana arama ayarlarını çok dikkatli olun. Bu nedenle, sürekli membran potansiyeli ilgili değişiklikleri tespit etmek için kayıt izlemek. </li><li> Bu GABAerjik olayları tespit etmek zor ise, bir kullanmak yararlı olabilirn iç çözüm kompozisyon yüksek Cl verimli - itici güç. Bunu başarmak için, Cl azaltmak - pipet çözüm (. Protokol bölüm 2.6 bakınız) konsantrasyonu. Bu, daha yüksek bir itici güç nedeniyle istirahat membran potansiyeli büyük GABAerjik etkinlik ile sonuçlanır. </li><li> Alternatif olarak, -100 mV -48 mV (Şekil 8C) için membran potansiyeli şansı sonuçlanan uzun geçerli adımları enjekte. Bu protokol ile Cl - itici güç bir depolarizan GABA tepki neden hiperpolarize potansiyelleri de artar. </li><li> Bu olayların GABAerjik nedenini belirlemek için yardımcı olur uyarılmış olaylar, ters potansiyelini belirlemek için adım mevcut enjeksiyon protokolü kullanmak da mümkündür. GABA Kaçak glutamat sızıntı daha tespit etmek zordur. Bu durumda, giriş direnci bir sürekli izlenmesi GABA dolduran pipet yaklaştığı zaman, yardımcı olabilir. Giriş direnci azalır, geçerli olabilir b korumakE artan ya da farklı bir pipet kullanılmalıdır. </li><li> Glutamat iyontoforez için kontrol deneyleri olarak, glutamat sızıntı neden olabileceği yerel kalsiyum girişini görselleştirmek için pipet çözüm 200 mcM OGB-1 ve hiçbir EGTA kullanarak, bir Ca 2 + görüntüleme deney öneririz. </li><li> Genel olarak, kararlı bir yanıt elde etmek için zaman zarfında önlemek için mekanik olarak stabil bir pipet olması çok önemlidir. Drift sıcaklık değişimleri neden olabilir, bu nedenle ölçümlerin termal sürüklenme önlemek için önce en az yarım saat ekipman açmak için tavsiye edilir. Pipet tutucu iyi kartuş mühürler kullanmak ve ucu gerçekten sabit olduğundan emin olun. Sahibi kendisi ayrıca teflon bant ile tespit edilebilir, ayrıca, aynı zamanda kayması potansiyel bir kaynağı olan headstage veya manipülatör, gelen kabloları üzerinde herhangi bir gerilim olduğundan emin olun. </li></ol>

<ol>
	<li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+initiation+and+propagation+of+dendritic+spikes+in+CA1+pyramidal+neurons.">On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).</li><li>Losonczy, A., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+properties+of+radial+oblique+dendrites+in+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons.">Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 50, 291-307 (2006).</li><li>Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+control+of+neuronal+output+by+local+and+global+dendritic+spike+attenuation.">Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation.</a> Neuron. 61, 906-916 (2009).</li><li>Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+initiation+and+propagation+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons.">Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).</li><li>Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+integration+of+excitatory+synaptic+input.">Dendritic integration of excitatory synaptic input.</a> Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).</li><li>Amaral, D. G., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+the+hippocampal+formation:+a+review+of+anatomical+data.">The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data.</a> Neuroscience. 31, 571-591 (1989).</li><li>Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+between+somatic+and+dendritic+inhibition+in+the+hippocampus.">Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus.</a> Neuron. 16, 815-823 (1996).</li><li>Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+control+of+linear+and+supralinear+dendritic+excitation+in+CA1+pyramidal+neurons.">Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 75, 851-864 (2012).</li><li>Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+iontophoresis+for+single-synapse+stimulation.">High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation.</a> J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).</li><li>Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+of+neurotransmitter+concentration+and+nonsaturation+of+postsynaptic+AMPA+receptors+at+synapses+in+hippocampal+cultures+and+slices.">Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices.</a> Neuron. 22, 395-409 (1999).</li><li>Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+neurotransmitter+flux+enhances+synaptic+efficacy+by+affecting+AMPA+receptor+activation.">A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation.</a> Neuron. 29, (2001).</li><li>Heine, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+mobility+of+postsynaptic+AMPARs+tunes+synaptic+transmission.">Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission.</a> Science. 320, 201-205 (2008).</li><li>Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+types+of+cortical+interneurone+structure+space+and+spike+timing+in+the+hippocampus.">Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus.</a> J. Physiol. 562, 9-26 (2005).</li><li>Pugh, J. R., Jahr, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+GABAA+receptors+increase+cerebellar+granule+cell+excitability+and+synaptic+activity.">Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity.</a> J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).</li><li>Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+GABA(A)+receptors+by+hydrogen+ions+reveals+synaptic+GABA+transient+and+a+crucial+role+of+the+desensitization+process.">Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process.</a> J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).</li><li>Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+modulation+of+functionally+distinct+GABAA+receptors+in+acutely+isolated+pyramidal+neurons+of+rat+hippocampus.">Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus.</a> Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Channel Recording. , (2009).</li><li>Davie, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).</li><li>Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporally+graded+NMDA+spike/plateau+potentials+in+basal+dendrites+of+neocortical+pyramidal+neurons.">Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).</li><li>Rose, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+pharmacology+and+whole-cell+patch+recording+from+CNS+neurons,+in+vivo.">Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo.</a> J. Neurosci Methods. , (2012).</li><li>Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+activation+of+postsynaptic+GABA(A+)receptors+by+rapid,+focal+agonist+application+onto+intact+rat+striatal+neurones+in+vitro.">Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro.</a> Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).</li><li>Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Electrophysiological methods. , (1992).</li><li>Wetzel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes.">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).</li><li>Cash, S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+summation+of+excitatory+inputs+by+CA1+pyramidal+neurons.">Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 22, 383-394 (1999).</li><li>Eccles, J. C., Jaeger, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+mode+of+operation+and+the+dimensions+of+the+junctional+regions+at+synapses+and+motor+end-organs.">The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).</li><li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474, 100-104 (2011).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada dendritler üzerinde sinaptik entegrasyon araştırmak için nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez nasıl uygulanacağını açıklar. Bu teknik, başarılı bir şekilde, in vitro ve in vivo olarak 9,20-22, beynin farklı bölgelerinde ve glutamaterjik sinaptik transmisyonu GABAerjik araştırmak için kullanılmıştır. Mikro-iyontoforez 60 yılı aşkın süredir kullanılmaktadır, ancak erken yıllarda çoğunlukla yerel olarak yavaş ya da ara zaman çizelgesi 23...

Merkezi sinir sisteminde nöronların ince ve dallanmış dendritik süreçleri 1 sinaptik çeşitli girişler almak. Orada, eksitatör dendritik girişlerin çoğunluğu glutamaterjik sinaps aracılık eder. Bu sinaps eksitatör postsinaptik potansiyeller (EPSPS) bir postsinaptik doğrusal entegrasyonu ile sonuçlanan, bir mekansal dağıtılmış şekilde devreye alınabilir. Sinaps aynı anda ve dendrit üzerine mekansal yakınlık içinde aktif ise, bu uyarıcı girişler supra-lineer entegre ve dendritik ani 2-5 oluşturmak olabilir. Ayrıca, eksitatör girdilerin entegrasyonu dendritik ağaç üzerindeki giriş yerini bağlıdır. Distal tutam bölgede varmak sinyalleri çok daha zayıflatılmış kablo filtreleme 6 nedeniyle proksimal girişi daha vardır. Hipokampus, apikal tutam dendritler için uzak girdi proksimal dendri üzerinde daha farklı bir beyin bölgesi tarafından oluşturulantes 7. Heyecan verici bir soru bu nedenle, ne kadar sinaptik giriş farklı dendritik bölmeleri tarafından işlenen ve dendritik entegrasyon farklı şekillerde nöronal ateşleme bu katmanlı girişlerinin etkisi düzenler eğer. Edilir Fonksiyonel özellikleri, dendrit morfolojik özellikleri Sadece, giriş yerini ve kümeleme önemlisi glutamaterjik sinaps 8,9 etkinliğini belirlemek de uyarıcı girişleri, GABAerjik terminallerinden ek inhibitör girişlerin dendritik entegrasyonu etkiliyor. Sinaptik entegrasyon Bu farklı yönlerini ideal dendritik etki için farklı nörotransmitterlerin mekansal tanımlı uygulama sağlar nörotransmitter mikro-iyontoforez, kullanılarak incelenebilir. Biz başarıyla nöronlar sinyal entegrasyon araştırmak glutamat ve GABA mikro-iyontoforez kurmak için nasıl burada göstermek. Bu uygulama, ince uçlu içinKonsantre nörotransmitter çözeltisi ile doldurulur, yüksek direnç pipetler kullanılır. Bu pipet nörotransmiter reseptörleri bulunmaktadır hücresi, dış membran yakın konumlandırılmıştır. Dendritik dalların iyi bir görüntüleme gereklidir. Bu en iyi yama pipet vasıtasıyla tanıtılmaktadır floresan boyalar kullanılarak elde edilir. Daha sonra çok kısa bir (&lt;1 milisaniye) akım darbesi (10 aralığında - 100 NA) şarj nörotransmitter molekülleri çıkarmak için kullanılır. Bu kısa bakliyat ve etkili kapasite tazminat ile, postsinaptik potansiyelleri veya akımlar eksitatör giriş yerini tam olarak bilinen anlamına gelir yüksek zamansal ve mekansal hassas, ile uyarılmış olabilir. Glutamat mikro iyontoforez (Şekil 1 9), burada gösterildiği gibi 6 um&#39;den daha küçük olan bir yarıçap tanımlanabilir, sinaps aktive olabilir, ancak tek bir sinaps çözünürlük 10-12 ulaşmak da mümkündür. Heine, M., ve ark </em&gt; hızlı mikro-iyontoforez mekansal çözünürlükte bile düzenli glutamat 13 iki-foton uncaging ile elde nokta boyutları daha küçük olan 0.5 mikron altında boyutları, nokta ayarlanabilir gösterdi. Hızlı mikro-iyontoforez ile iki veya daha fazla iyontoforez pipetler kullanın ve dendritik ağaç üzerinde farklı, hatta uzak noktalarda yerleştirmek için kolayca mümkündür. Bu şekilde, farklı yollar gelenler de dahil olmak üzere uyarıcı etkinlik, entegrasyonu araştırılabilir. Bu, aynı zamanda, bir glutamat, GABA dolu bir iyontoforetik pipet kullanmak da mümkündür. Bu şekilde eksitatör giriş (on-yolu, off-yolu inhibisyonu) göre farklı yerlerde GABAerjik inhibisyon etkisi incelenebilir. Ayrıca, belirli nöronal etki hedef internöronlar tarafından inhibisyon etkisi, distal dendritler gibi, soma veya aksonlar 14, GABA iyontoforez kullanılarak incelenebilir. Kültürlü nöronlarda, hızlı mikro-iyontoforez INVE için bir fırsat sunuyorçok daha ayrıntılı 10,11 nöronların tek sinaps dağıtım ve sinaptik iletişim temel yönlerini stigate. Bu yazıda giriş yeri, giriş güçlü ve zamanlama, tek başına ya da etkileşim içinde bağımlılığında eksitatör ve inhibitör girdi sinaptik entegrasyonu soruşturma sağlar akut beyin dilimleri, en kullanılmak üzere glutamat ve GABA iyontoforez kurmak için nasıl ayrıntılı olarak göstermektedir. Biz avantajları ve sınırlamaları bu tekniğin ve nasıl başarılı bir şekilde gidermek için işaret olacaktır.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

Nörobilim temel ilgi alanlarından biri sonunda akson de aksiyon potansiyeli nöronal çıkışına yol açan dendritik ağaç, çok kompleks yapısı boyunca eksitatör ve inhibitör girdi entegrasyonu anlamaktır. Nöronal çıkış belirli sinaptik giriş farklı mekansal ve zamansal parametrelerinin etkisi dendritik girdi mesafe bağımlı zayıflama, mekansal ayrılmış giriş yerini bağımlı etkileşim, uyarıcı entegrasyonu, lineer üzerinde GABAergig inhibisyon etkisi örneğin, halen araştırılmaktadır ve doğrusal olmayan entegrasyon modları, ve çok daha fazlası. Glutamat ve GABA hızlı mikro-iyontoforez ile tam glutamaterjik uyarma ve GABAerjik inhibisyon mekansal ve zamansal entegrasyonu incelemek mümkündür. Kritik teknik gereksinimleri ya tetiklenen floresan lamba, ışık yayan diyot (LED), ya da bir iki foton SCA olandoku önemli fotoğraf zarar tanıtan olmadan dendritik dalları görselleştirmek için mikroskop nning. Ayrıca, yüksek direnç pipetler hızlı kapasite tazminat sağlayan bir mikro-iyontoforez amplifikatör olması çok önemlidir. Başka bir önemli nokta hiçbir verici istemsiz deney sırasında pipet tarafından yayımlanan olmasıdır. Bir kez kurulan bu tekniği yüksek bir nörotransmitter ve konumu özgüllük ile güvenilir ve tekrarlanabilir sinyalleri verecektir. Glutamat ve GABA uncaging ile karşılaştırıldığında, hızlı iyontoforez görüş alanı için sınırlama olmaksızın aynı anda ama çok uzak yerlerde hem vericileri kullanarak sağlar. Orada akson odak elektrik stimülasyonu ile karşılaştırıldığında avantajları da vardır: mikro-iyontoforez ile giriş sitenin konumu kesinlikle bilinir ve ilgi sadece nörotransmitter serbest emin olabilirsiniz. Ancak bu mikro-iyontoforez sadece dikkate alınmalıdırpostsynapse devreye girer ve nörotransmitter serbest presinaptik yönleri çözülmüş değildir. Bu yazıda beyin dilim deneylerinde mikro-iyontoforez kurmak nasıl gösterilmektedir.

İyontoforez mekansal yayılmasını belirlemek için basit bir yaklaşım, püskürtülen glutamat sabit tutarken, dendrit arasında aşamalı iyontoforetik pipet geri etmektir. Bir mikro-iyontoforetik stimülasyon mekansal ölçüde yaklaşık 12 mikron (Şekil 1 yarıçapı arası) bir çapa sahip olduğu bulundu. Ne iyontoforez kullanılabilir dokusunda derin pipet sertliği bağlıdır. Bununla birlikte, burada kullanılan dilimleri (Şekil 2), deneyler için gerekli olan iyontofor...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration at JoVE.com

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Bu yazıda yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle postsinaptik sinyal entegrasyonu araştırmak için bir teknik olarak nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez tanıtmak.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K Görüntüleme.  University of Bonn. Bu yazıda yüksek uzaysal ve zamansal hassasiyetle postsinaptik sinyal entegrasyonu araştırmak için bir teknik olarak nörotransmitterlerin hızlı mikro-iyontoforez tanıtmak.

Video: Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

Nörobilim

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI CyberMotion Simulator: Üç boyutlu çoklu duyumsal Yolu Entegrasyon araştırmak için bir Roman Hareket Simülatörü Uygulaması

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA A reseptör Membran Yerelleşme ve Ticareti Eğitim için bir α-bungarotoksin Bağlama Sitesi Tag Kullanımı

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

Bir izoelektrik Beyin Devlet indüksiyon Nöronal Eksitabilite üzerinde Endojen Sinaptik Faaliyet etkisini araştırmak için<em&gt; İn Vivo</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

Enzim bazlı biyosensörlerin kullanılması Alzheimer Fare Modellerinde Tonik ve Fazik glutamat Ölçmek için

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

Optogenetics gen nakavt etkileri olduğu gibi nöronal devreler içinde Presynaptic işlevi karakterize etmek için yapay mikroRNA'lar birleştirme

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...