Biz Dr Mark M. zengin ve Daniel Miranda Editöryel Yorum için Ahmad Khedraki mali destek (A.A.V. için başlangıç Fonu) için bu tekniği ve Wright Devlet Üniversitesi kurmak yardım ettiğin için teşekkür ederim.

Tüm hayvan yordamları hayvan bakım ve kullanım Komitesi Wright Devlet Üniversitesi uygun olarak yapıldı.
1. fare ötenazi
<ol><li>Bir duman başlık, hava geçirmez bir cam odası anesthetizing fareyi getirin.</li>
	<li>Fareyi isoflurane (doyurarak veya ~ % 25) ölümcül bir doz için inhalasyon yoluyla ortaya çıkarmak. Nefes gözlenen kadar odasında fareyi bırakın.</li>
	<li>Fare odasından kaldırın ve ötenazi, ikincil yöntem olarak yerindençıkmasına servikal gerçekleştirmek.</li>
</ol>2. kaldırma saç baş, boyun ve sırt Dorsal yüzeyinden
<ol><li>Bir Elektrikli tıraş makinesi saç baş, boyun ve fare arkasında dorsal yüzeyi çoğunluğu kaldırmak için kullanın. Ayrıca, çevresinde ve sol kulak saç kaldırmak. Not: dikkat çekmek ne zaman tıraş kulak çevresindeki deri, deri tıraş bıçakları yakayı ele ve temel kas dokusuna zarar verebilir.</li>
	<li>Saç dökücü krem bir pamuk bez ile kalan saç kaldırmak için traş bölgeye uygulanır. Yaklaşık 1 dakika bekleyin ve krem saç kaldırma sıkmak yıkama şişe kullanarak su ile durulayın sonra uzak kalan herhangi bir krem veya pamuklu çubukla kullanarak saç fırça ve cilt kuru pat.</li>
</ol>3. deri Levator Auris Longus kas ortaya çıkarmak için kaldırmak
<ol><li>Stereo diseksiyon mikroskop altında fare scapulae düzeyde arkasında küçük bir insizyon attım (Cilt için sadece derin yeterli) olun. Şekil 1A-Bgösterilen yolunu izleyerek mikro diseksiyon makası kullanarak deriyi kesme.</li>
	<li>(No 5 gibi) iyi forseps kullanarak, scapulae yakın kesme boyunca cilt kaldırın. Bahar makas kullanılarak, bağ dokusu deri kulak yaklaşırken temel kas dokusundan ayırmak için kesme. Önemlisi, bağ dokusu maruz kalan kas dokusunun yanlışlıkla kesme önlemek için deri içine sivri Bıçaklar ile kesti.</li>
	<li>Düzenli olarak maruz kalan kas (mM) oluşur aşağıdaki Na+ dış arabellek gibi bir fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile sıvı: 144 NaCl, 4 KCl, 1.2 CaCl2, 0.6 MgCl2, 5 glikoz, 1 NaH2PO4, pH 7.4 NaOH ile ve bir osmolalite 300 ± 5 mmol/kg vardır. Bir kez cilt tamamen fare kaldırmak ve onu atmak için kulak çevresindeki deri kesilmiş sol kulak için bağ dokusu kesilmiş oldu. Not: LAL kulak tabanına verdiği ve cilt kaldırılırken kolayca zarar görebilir. Yaklaşık 1 mm LAL kesme önlemek için kulak tabanı etrafında deri bırakmak iyidir.</li>
</ol>4. kaldırma Levator Auris Longus kas ve çevresindeki doku
<ol><li>Hangi omurga arasında scapulae bağlanmak için LAL, aşağı kesim kasları tarafından bahar makas kullanarak başlatın. Sadece orta hat, sağına doğru kürek başlangıç ve orta hat sağ tarafında kalan süre rostral fareyi, sonuna doğru kesti. Devam sonuna kadar kas dokusu sonuna kadar kafatası üzerinde kesme. Not: LAL kulak ve orta hat, medial tarafına bağlı en yüzeysel kas Şekil 2' de gösterildiği gibidir. Diğer resimleri, AK Greene17 tarafından bir kitap LAL mükemmel, çizilmiş görüntüleri gösterir.</li>
	<li>Forseps orta hat, hemen sağındaki kesme doku kapmak sonra yavaşça kaldırın ve doku sol kulak doğru sol LAL aşağı olan birkaç kat kas kaldırmak için kafatası karşı baskı makas bıçaklı kesme başlamak için kullanın. Tüm geçici olarak yanlışlıkla LAL kaldırma sırasında kesme önlemek için bağlı katmanların bırakın.</li>
	<li>Bıçaklar ile paralel olarak kesmek ve belgili tanımlık kulak kanal kaydırılır ve kas kulak medial tarafında girer LAL innervates sinir kesme önlemek için kafatası karşı baskı. Kadar mümkün olduğunca bağlı sinir tutmak belgili tanımlık kulak kanal içinden devam. Not: LAL sağlayan sinir uzakta-in yüz sinir dalları ve daha sonra yordamda kullanılacaktır olarak muhafaza edilmelidir.</li>
	<li>Şekil 1B adımında kulak ventrolateral kısmı üzerinde gösterilen aynı yol boyunca kulak kanalına geçince mi yağlı doku kes. Ayrıca, sol kürek kemiği kas tamamen fare kaldırmak için sağ tarafta olduğu gibi kesti.</li>
</ol>5. Levator Auris Longus kas yalıtım
<ol><li>LAL ve çevresindeki doku, bir konteyner içine yerleştirin. Bir konteyner içinde disseke doku gibi bir petri silikon elastomer alt ile altına tutturulmuş kullanın. Banyo ve doku bir fizyolojik serum çözümde sık sık yıkayın.</li>
	<li>Boyunca Bankası için LAL bağlı kulak kıkırdak parçası bırakarak kulak, kulak pinna kesti. Böylece aşağı yüzün (LAL çanak alt) yukarı dönük kas çevir.</li>
	<li>Hazırlık tutmak için belgili tanımlık kulak kanal aracılığıyla bir böcek pin gibi bir iğne yerleştirin. O zaman daha küçük iğne, PIN LAL midline karşı tarafta kalan doku kullanarak. Forseps kullanarak, yavaşça deri yan kısmındaki kas germek dışarı ve bir iğne deri yoluyla yerleştirmek için kulak çekin. Şekil 3' te gösterildiği gibi iyi yemek için güvenli dokudur kadar bu adımı yineleyin. Not: Küçük diseksiyon pimleri akupunktur iğneleri ipuçları için istenilen uzunluğa kesim tarafından yapılabilir. Bu küçük pin doku hasarı en aza indirmek ve su-daldırma mikroskop objektif uzun çalışma uzaklıkları ile birlikte kullanılabilir.</li>
	<li>Begin, kasları (gösterildiği şekil 4) kaldırma bu LAL (auricularis üstün, kaçıran auris longus ve interscutularis) kapsayan ve bu LAL için bağ dokusu ile bağlı ve özellikle dar yakınındaki orta çizgi, No 5 forseps ve bahar makas kullanarak.</li>
	<li>Yukarı çekmeye forseps kullanarak örten kas katmandaki bağ dokusu ile varlık makara kas katmanı doğru odaklı bıçaklar ve kesme veya LAL nicking önlemek için dikkat ediniz. Orta çizgi doğru kesme ve orta hat giderken yaklaşık dörtte üçü kesmeyi bırak. Sonra her kas katmanı kaldırmak için orta hat için paralel kesti. Kadar sadece LAL kalır kas tabakaları kaldırma devam et.</li>
	<li>Elektrotlar kazığa oturtma içinde AIDS LAL kapsayan kalan bağ dokusu bazılarını kaldırın. Yavaşça No 5 forseps bağ dokusu LAL uzak çekmek ve uzak bahar makas kullanarak kesmek için kullanın. Sadece o kadar kolay sürecinde LAL zarar riski olmadan yapılabilir doku kaldırın. Nöromüsküler kavşak görselleştirme engel LAL alt yüzeyinde kalan aşağı kas tabakaları innervate herhangi bir büyük sinirler kaldırın.</li>
</ol>6. sinir yalıtım
<ol><li>Sinir Stimülatörü kullanarak LAL innervates sinir belirle (örneğin, iki Platin teller bağlı bir darbe üreteci); kulak kanalına kaslar için çalışan birkaç sinirler bulunur. Sinirleri bazı akım sağlayan sinir Stimülatörü ile touch (geçerli V 5 civarında değişir). Ne zaman kas sözleşmeleri, doğru sinir olduğu belirlendi.</li>
	<li>Dikkatle doku sinir yakınındaki kapmak ve bahar makas sinir kulak çevreleyen dokusundan ayırmak için kullanın. Hasarı en aza indirmek için daha sonra kayıt çanak sinir güvenliğini sağlamak için kullanılan bazı çevreleyen doku gömülü sinir çoğunu tutun. Not: LAL innervates motor sinir medial ve açılış belgili tanımlık kulak kanal tarafında bulunur.</li>
	<li>İki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak, sinir, kas distal bölgenin etrafında sadece çevreleyen doku kaldırın. Emme bir elektrot kullanarak, sinir kesme sonundaki çevreleyen doku kaldırın. Not: Bu iyi durdurma noktadır. Bu bir iyi durdurma noktadır. Eğer bir ara disseke LAL hazırlık bir fizyolojik çözüm ya da bir kaç saat zararlı metabolitleri değil birikir sağlamak için sürekli perfüzyon sürdürülebilir. Çözüm ya da sabit perfüzyon büyük miktarda zararlı metabolitleri değil birikir emin olmak için kullanın.</li>
	<li>Ardından, çözme ve perfüzyon odasına dik bir bileşik mikroskop altında Elektrofizyoloji deneyler için kas transferi. Not: Kullanım ile yumuşak bir alt doku güvenli bir şekilde olabilen bir perfüzyon Odası (şekil 5A) tutturulmuş.</li>
	<li>İğne ucunda (kulak ve orta hat) ve kas kenarı boyunca kas. Sinir kas lifleri dikey konumlandırma ve sinir sonunda sağlam kaldı bazı aşırı doku ile çanak dibine pin. Her zaman bir fizyolojik serum çözümde banyo doku tutun. Not: Yükseltilmiş malzeme doğrudan altında LAL kas lifleri yuvarlak yararlıdır. Bu ekstra destek elektrot kazığa oturtma AIDS ve yan tarafında yalan bir 50 mL konik tüp döküm silikon elastomer küçük bir bölümünden yapılabilir. Elastomer yuvarlak bölümünü taze silikon az miktarda kullanarak perfüzyon odası altına güvenli. Perfüzyon odası bir diyagram şekil 5B-Cile gösterilir. Kas lifleri (ki çok hidrofobik) yeni oyuncular silikon elastomer için çok sıkı uygun ve daha da zarar görebilir. Ceket için yararlıdır veya blok yeni protein, bir immunoblot engelleme adımına benzer silikon döküm. Bunu engellemek için biz yeni oyuncular silikon sığır serum albümin konsantre bir çözümde gecede inkübe.</li>
</ol>7. Elektrofizyoloji ekipman kurulumu
<ol><li>Hazırlamak veya aliquots gibi ışığa duyarlı ve ışıktan uzak muhafaza edilmelidir mitokondrial boya 4-(4-diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium18, nöromüsküler kavşak görselleştirme yardım etmek için bir boya, buzlarını. Ayrıca, elektrot çözümleri çözme. Girdap tüm solutes çözüm olduğundan emin olmak için tüm aliquots. 1 µM içeren bir fizyolojik serum çözüm hazırlamak µ-Conotoxin GIIIB (μ-CTX) ve 80 µM BTS (isteğe bağlı).</li>
	<li>Perfüzyon odası mikroskop sahneye LAL ile güvenli. 3 M agar Köprüsü üzerinden kayıt odası'na bağlı KCl Place referans elektrot bir bardağa dolu. Referans elektrot amfi üreticinin yönergelerini başına bağlayın.</li>
	<li>Bu noktada, sinir uyarıcı elektrot sinir üzerinde konumlandırın. De sinir stimülasyonu için çalışırken bir emme elektrot veya küçük bir iki kutuplu elektrot kullanın.<ol>
<li>Uyarıcı elektrot gibi kas uyarımı yapı kayıtları sayısını en aza indirmek için mümkün olduğunca uzak getirin. Not: Uyarıcı elektrot gerilimi genlik gerektiği gibi kontrol edebilirsiniz bir uyarıcı yalıtım birimi ile kontrol edilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş yavaş kasılmalar gözlenen kadar uyarıcı yalıtım birimi üzerinde gerilim düğmeyi çevirerek gerilim yükseltmek. Hangi ilk daralma gözlenmiştir eşik noktasıdır. Bir kez tanımlanan eşik, gerilim uyarıcı yalıtım birimi üzerinde 1,5 ayarla * eşik (veya deneme tarafından tanımlandığı gibi). Not: Şekil 6 dik bir mikroskop ve Bugi manipülatör kullanarak sinir yerleştirilmiş küçük iki kutuplu elektrot altında kurmak kas hazırlık göstermektedir. Hala yeterince eşiğin olurken mümkün uyarılması için en düşük fiyat voltajı için olumlu. Daha düşük bir uyarıcı gerilim kayıtları sırasında stimülasyon yapı sayısını azaltır. Ayrıca, uzak Kas uyarıcı elektrot yerleştirme stimülasyon obje boyutunu azaltır. Bazen sinir Stimülatörü nereye yerleştirileceğini ile deneme gerekli olabilir bu yüzden sinir sonu diseksiyon zarar görür.</li>
	<li>Banyo tuzlu çözüm kaldırın ve 5 µM 4-Di-2-Asp ile değiştirin. LAL Hazırlık'a 4-Di-2-Asp nöromüsküler kavşak görüntüleme (Şekil 7) için yeterli Floresans elde etmek 10 min için maruz.</li>
	<li>İki elektrot çözümleri, 3 M KCl ve K+ iç çözüm (mM) oluşan 75 aspartat, 5 MgCl2, 15 Ca(OH)2, 5 ATP disodyum, 5 phosphocreatine disodyum, 5 glutatyon, 20 BEZLERİ, 30 EGTA, pH 7.2 KOH ile hazır olun. Not: Çözümleri önceden hazırlanmalı; K+ iç çözüm aliquots-20 ° C'de depolanan</li>
	<li>Dolgu çekti cam ile 3 M KCl. gerilim algılamalı elektrot için kılcal K+ iç çözüm (hazırlanan adım 7,6) akım geçen elektrot için kullanın; 1 mL şırınga bağlı bir Ametal dar iğne (~ 34 ölçer) kolayca cam kılcal doldurmak için kullanın. Yavaşça hava kabarcıkları kaldırmak için kılcal dokunun; Dolgulu elektroda direnci 10-15 MΩ olduğundan emin olun. Not: Kontrol ve veri toplama yazılımı kullanarak her iki elektrot direnç not edin.</li>
	<li>10 dakika sonra normal Ca2 + çözüm 4-Di-Asp Çözümle değişimi.</li>
</ol>8. nöromüsküler kavşak Floresans kullanarak tanımlaması
<ol><li>Standart parlak alan ve floresan aydınlatma ile dik bir mikroskop kullanarak, floresan yeşil nöromüsküler kavşak dikey şekil 7Aiçinde gösterildiği gibi hazırlık boyunca kas lifleri için çalışan bir parlak bant arayın. Nöromüsküler kavşak tanımlamak için bir düşük büyütme su-daldırma hedefi (~ 10 X) kullanın Not: Mikroskop FITC küp ile donatılmış olmalıdır (Ex: 480/40, Dichroic: 505LP, Em: 535/50) ve bir LED, lazer, halojen lamba veya civa lamba floresan için. Fotoğrafı beyazlatma, alan parlak ve floresan aydınlatma arasında geçiş yapar en aza indirmek için. Not: Bu genellikle daha proksimal orta hat kulağa tabanına grubudur. Grup nöromüsküler kavşak en yoğun olduğu bölgedir.</li>
	<li>Daha yüksek bir büyütme su-daldırma amaç (~ 40 X) geçin ve Elektrofizyoloji (şekil 7B) ile incelemek için bir nöromüsküler kavşak kas üst tabakası üzerinde tanımlamak.</li>
	<li>Başına üretici yönergelerine uygun headstages pipet tutucular içine doldurulmuş Pipetler güvenli. Yukarıda tanımlanan nöromüsküler kavşak (şekil 7C) 100 µm içinde kas membran elektrotlar yerleştirmek için micromanipulators kullanın. Öncelikle alan parlak mikroskobu kullanılarak elektrotlar yerleştirmek; Floresans elektrotlar nöromüsküler kavşak göreli konumunu doğrulamak için kullanın.</li>
	<li>Öncelikle, bir düşük büyütme (~ 10 X) hedefi elektrotlar bulun ve sonra son elektrotlar konumlandırma için daha yüksek bir büyütme (~ 40 X) amaç için geçiş yapmak için kullanın. Elektrotlar kasına bu noktada kazığa oturtmak değil, ilk elektrotlar radyo istasyonu ayarlayın.</li>
</ol>9. Aksesuar ve elektrotlar Impaling
<ol><li>Elektrotlar istenen fiber konumlandırılmış bir kez sıfır ve köprü Dengeleme (ya da benzer bir yaklaşım) gerilim algılamalı elektrot ayarlamak ve üretici yönergelerine başına elektrot kapasitans nötralize. Ayrıca, akım geçen elektrot sıfır.</li>
	<li>Her iki elektrot lif yüzeyinin aşağı getir. Yavaş yavaş böylece elektrotlar nöromüsküler kavşak ile ilgili olarak odaklı kalır lif aşağı yolda elektrotlar konumunu 8.3 ve 8,4 adımlarda açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Sonra her iki elektrot kas lif yüzeyine temas etmiş, künt akım geçen elektrot ilk kazığa oturtmak. Elektrot kazığa oturtma kolaylaştırmak için buzz (aşırı kapasite tazminat kısa bakliyat), kısa geçerli bakliyat veya hafifçe dokunarak tablo gibi teknikleri kullanın.<ol>
<li>Elektrot Impaled gösterir negatif membran potansiyeli tespit kadar bir osiloskop veya osiloskop protokolü veri toplama yazılımı kullanarak olan sinyali, izlemek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daha net voltaj algılamalı elektrot Impaled akım geçen elektrot seviyesine kas üzerine bunalıma girmek. Her iki elektrot doğrultusunda bir başka bir kez, akım geçen elektrot ile uygulanan aynı teknikleri kullanarak gerilim algılamalı elektrot kazığa oturtmak.</li>
	<li>Başarılı kazığa oturtma, denetleyicinin amplifikatör için kullanarak üzerine sürekli negatif elektrot kazığa oturtma nedeniyle Membran zarar telafi etmek için geçerli geçen elektrot ile güncel tutan bir uygulanır. Hücre-80 doğru yavaş yavaş şarj etmek Başlarken mV, holding olarak geçerli gerekli istenen istirahat için potansiyel cep getirmek için artış (Yani,-80 -85 için mV). Not: kayıt gerektiren bir holding liflerinden önlemek geçerli mutlak değerde sağlıksız liflerinden kayıt olasılığını en aza indirmek için-25 nA vahşi tipi kas daha büyük.</li>
	<li>Fiber için birkaç dakika istenen dinlenme potansiyel, stabil sonra kas zarı özellikleri veya nöromuskuler iletim kayıt için devam etmek.</li>
</ol>10. kayıt postsinaptik membran özellikleri ve sinaptik iletimi
<ol><li>Geçerli-kelepçe kayıtları ile eşit sayıda motor endplate Riçinde ve τmbelirlemek için kullanılan karşılık gelen membran gerilim yanıtları ölçmek için pozitif ve negatif geçerli adımları uygulayarak başlar. Pasif özellikleri sağlamak için kararlı bir duruma ulaşmak ve bir doğrusal gerilim-akım ilişki16,19,20küçük gerilim yanıt kullanın. Kayıt ile bozuk veya sağlıksız Sinir liflerinden önlemek, mEPP frekans böyle lifleri var > 3 Hz.</li>
	<li>Sonra iki elektrot gerilimi-kelepçe üretici yönergelerine başına girin. Gerilim Tipi Kelepçe lifler -85 membran potansiyelini, mV. Gerilim Tipi Kelepçe ayarlar mEPCs olarak algılanmasını sağlayan sinyal noise oranları elde etmek. Not: Bakımı yeterli gerilim kontrolü bir sorun olabilir. Bu sorunları en aza indirmek için iki yöntem kullanabilirsiniz. İlk olarak, lifler motor endplate 100 µm içinde daha önce açıklandığı gibi bu lifler21uzunluğu sabit içinde olduğu Impaled. İkinci olarak, biz amplifikatör DC geri yükleme özelliğini kullanın. Bu özelliği bir çok yüksek voltaj-kelepçe kazanç ayarlar. Önceki çalışmalarımız bu yöntem ayrıntılı olarak açıklanan ve gerilim klempe endplate16değerlendirmek için bir yöntem sıraladı.</li>
	<li>Bir kez kayıt gerilim-kelepçe, sinaptik akımları (mEPCs ve eEPCs) çeşitli sinir stimülasyonu protokolleri kullanarak deneme gereksinimlerini temel alarak.<ol>
<li>Kayıt kendiliğinden mEPCs ve bir kayda EPCs sinaptik Modülasyon (kolaylaştırma veya modülasyon) quantal içerik değerlendirmek için olmadan sağlayan bir düşük frekanslı sinir stimülasyonu Protokolü (≤0.5 Hz) kullanarak EPCs. Sinaptik kolaylaştırma veya depresyon değerlendirmek için bir yüksek frekans sinir stimülasyonu Protokolü (50 Hz değerinde 10 bakliyat) kullanın.</li>
		<li>Veri toplama yazılımı ile kontrol edilir bir darbe Oluşturucu'yu kullanmamanızı tetiklenebilir bir uyarıcı yalıtım birimi üzerinden istenilen frekansta sinir uyarmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kez gerilim tipi kelepçe kayıtları yapılır, amplifikatör bir akım tipi kelepçe ayara dönmek, Bütün akımlar off ve elektrotlar elyaf çıkarın. Elektrotlar değil tıkalı haline onay veya kayıt sırasında temel gerilim içinde drift. Not: lif kazığa oturtma önce ayarlanmış olarak drift ile ilgili elektrot gerilimi ekstraselüler çözümünde, 0 volt olmalıdır. Örneğin, kaydedilmiş Gerilim Gerilim deneme sırasında sürüklendi Eğer belirsiz olur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).</li><li>Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+the+mouse+levator+auris+longus+muscle:+a+convenient+preparation+to+study+muscle+and+nerve+plasticity.">Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity.</a> J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).</li><li>Bertone, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbonic+anhydrase+inhibitor+acetazolamide+shifts+synaptic+vesicle+recycling+to+a+fast+mode+at+the+mouse+neuromuscular+junction.">Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction.</a> Synapse. , (2017).</li><li>Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrusion+of+Ca2++from+mouse+motor+terminal+mitochondria+via+a+Na+-Ca2++exchanger+increases+post-tetanic+evoked+release.">Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release.</a> J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).</li><li>Nadal, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+muscarinic+acetylcholine+autoreceptors+(M1,+M2+and+M4+subtypes),+adenosine+receptors+(A1+and+A2A)+and+tropomyosin-related+kinase+B+receptor+(TrkB)+modulate+the+developmental+synapse+elimination+process+at+the+neuromuscular+junction.">Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).</li><li>Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse-glia+interactions+are+governed+by+synaptic+and+intrinsic+glial+properties.">Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties.</a> Neuroscience. 167 (3), 621-632 (2010).</li><li>Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+neurotransmitter+release+at+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+polyglutamine+disease.">Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease.</a> J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).</li><li>Takeuchi, A., Takeuchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+analysis+of+relationship+between+end-plate+potential+and+end-plate+current.">Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current.</a> J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).</li><li>McLachlan, E. M., Martin, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non+linear+summation+of+end+plate+potentials+in+the+frog+and+mouse.">Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse.</a> The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).</li><li>Obis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+protein+kinase+C+epsilon+isoform+modulates+acetylcholine+release+in+the+rat+neuromuscular+junction.">The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction.</a> Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).</li><li>Silveira, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ryanodine+and+inositol+triphosphate+receptors+modulate+facilitation+and+tetanic+depression+at+the+frog+neuromuscular+junction.">Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).</li><li>Wood, S. J., Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+factor+at+the+neuromuscular+junction.">Safety factor at the neuromuscular junction.</a> Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).</li><li>Miranda, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+Cl-+channel+defects+reveal+disrupted+skeletal+muscle+maturation+in+R6/2+Huntington's+mice.">Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington's mice.</a> J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).</li><li>Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington+disease+skeletal+muscle+is+hyperexcitable+owing+to+chloride+and+potassium+channel+dysfunction.">Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).</li><li>Khedraki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+Synaptic+Transmission+and+Reduced+Vesicle+Release+Sites+in+Huntington's+Disease+Neuromuscular+Junctions.">Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington's Disease Neuromuscular Junctions.</a> Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).</li><li>Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The anatomy of the rat. , (1955).</li><li>Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+that+stain+living+nerve+terminals.">Fluorescent probes that stain living nerve terminals.</a> J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).</li><li>Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electric current flow in excitable cells. , (1983).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y(1)+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors.</a> Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).</li><li>Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+slow+mammalian+muscles+after+denervation.">Fast and slow mammalian muscles after denervation.</a> Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).</li><li>Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+types+of+calcium+channels+mediate+transmitter+release+during+functional+recovery+of+botulinum+toxin+type+A-poisoned+mouse+motor+nerve+terminals.">Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals.</a> Neuroscience. 95 (1), 227-234 (2000).</li><li>Gaffield, M. A., Betz, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicle+mobility+in+mouse+motor+nerve+terminals+with+and+without+synapsin.">Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin.</a> J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).</li><li>Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicular+ATPase+Inserted+into+the+Plasma+Membrane+of+Motor+Terminals+by+Exocytosis+Alkalinizes+Cytosolic+pH+and+Facilitates+Endocytosis.">Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis.</a> Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada açıklanan hazırlık ve akım veya gerilim kelepçe koşullar altında nöromuskuler iletim ölçümü için fareyi LAL kas kullanımı olduğunu. LAL dissekan için göz önünde bulundurulacak birkaç önemli nokta vardır. Aşırı bağ dokusu kas AIDS olarak elektrot elektrot kazığa oturtma'dan temizlik bağ dokusu onları kazığa oturtma için yerleştirirken pürüzle. Ancak, sadece elinden alınan bağ dokusu kaldırmak kolayca kas zarar verme olasılığını sınırlandırmak için. Çünkü çok has...

Nöromusküler kavşakta sinaptik iletimi okuyan gergin ve iskelet kas sistemleri arasındaki dinamik ilişki içine anlayışlar sağlar ve sinaptik Fizyoloji incelenmesi için mükemmel bir model. Levator auris longus (LAL) kolayca görüntülenmeyecektir nöromüsküler kavşak için izin veren bir ince kas var. Önceki raporlar sinaptik uyuşturucu ve toksinler incelemek ve iskelet kas fiber türü özellikleri LAL1,2nitelendirmiştir LAL kullanma kolaylığı anlatmıştık. Çok sayıda çalışma LAL nöromüsküler fizyolojisi3,4,5,6,7,8incelemek için kullandık. Elektrofizyoloji için yetenek kolayca LAL nöromüsküler kavşak gözlemlemek için microelectrodes motor endplate, doğru yerleşimini sağlar ve sinaptik iletimi kayıt alanı kelepçe sorunları büyük ölçüde azaltır. Membran zaman sabiti (τm) ve (Riçinde) giriş direnci gibi kas membran özelliklerini geçerli-kelepçe kayıtları kolayca elde edilir. Ayrıca, bu özellikleri kas zarı özellikleri sinaptik işleve doğrudan karşılaştırması için izin nöromuskuler iletim kaydetmek için kullanılan aynı kas liflerinden ölçülebilir. Bu veri analizi birçok nöromüsküler hastalıklar ve Birleşik değişmiş faaliyet fiziksel mekanizmalarının içine anahtar anlayışlar verebilir.
Burada açıklanan tekniği önemli bir yönü olmayan linearities akım-kelepçe içinde karşılaşılan tabi değildir ve kas membran özelliklerini bağımsız sinaptik kayıtları için gerilim tipi kelepçe kullanımıdır. Nöromuskuler iletim incelemek için gerilim-kelepçe akım tipi kelepçe karşı kullanmanın yararları 1950'lerde9çabalarında öncü tarafından kuruldu. Geçerli-kelepçe altında 10-15 mV genlik içinde aşan EPPs mEPP genlik9doğrusal bir ürün değildir. Örneğin, ortalama mEPP 1 mV, bir EPP 5 mV 5 mEPPs 5 (QC); ürün olarak kabul Oysa, bir EPP 40 mV 40'tan fazla mEPPs ürün olacak. Membran potansiyeli ve asetilkolin reseptörü denge potansiyeli arasındaki farktır EPP için sürüş zorlamak için daha büyük EPPs, bu non-lineer oluşur (~ -10 mV), büyük EPPs sırasında önemli ölçüde azaltır. Çünkü kas membran potansiyeli gerilim tipi kelepçe deneyler sırasında değişmiyor bu sorun gerilim tipi kelepçe deneylerde önlenmiş olur. Bir dezavantajı gerilim tipi kelepçe deneyler daha geçerli-kelepçe kayıt tamamlamak teknik olarak daha zor olmasıdır. Bunu aklýnýzda tutarak, Sigara linearities akım tipi kelepçe kayıtları EPPs10hesapları basit bir matematiksel düzeltme McLachlan ve Martin geliştirdi. Düzeltmeleri de11,12,13iş ama önemlisi, kas zarı özellikleri değil kesintiye varsayıyorum.
Kas zarı özellikleri koşulları ya da kas bozabilir hastalık durumlarında eğitim düşünün özellikle önemlidir. Örneğin, Huntington hastalığı R6/2 transgenik modelinden kas iskelet dinlenme klorür ve potasyum akımları14,15hyperexcitable bir progresif azalma nedeniyle olur. Sonuç olarak mEPPs ve EPPs R6/2 iskelet kas güçlendirilmiş. Kesinlikle, Ek etkenler mEPPs ve EPPs değiştirebilir. SNARE-proteinler8' e ilgili gibi görünüyordu EPPs değişiklikleri bulunan farklı bir model Huntington hastalığı fare (R6/1) ile çalışma. Neden değiştirilmiş nöromuskuler iletim mekanizmaları değerlendirmek için gerilim tipi kelepçe kullanarak değiştirilmiş kas zarı özellikleri etkilerini ortadan kaldırmak faydalı olacaktır. Bir son çalışmada, R6/2 nöromuskuler iletim burada açıklanan tekniği kullanarak her iki akım ve gerilim kelepçe koşullar altında incelenmiştir. Motor endplates tamamını gerilim-% 1 hata klempe ile daha az iki microelectrodes endplate16uzunluğu sabit içinde yerleştirerek. Bu gerilim tipi kelepçe gösterildi ve R6/2 kas nöromuskuler iletim zıt ölçümleri vermiştir akım tipi kelepçe kayıtları düzeltti. Bu kas zarı özellikleri üzerinde değişiklik yapılmış Eğer EPPs sigara linearities düzeltmek zor olabileceğini vurgular ve kas membran özelliklerini bağımsız voltaj-kelepçe kayıtlarını edinme yararları göstermektedir. Burada sunulan Protokolü koşulları veya sinaptik iletimi ve postsinaptik membran özelliklerini etkileyen hastalık durumlarında incelenmesi için idealdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="806">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Olympus Compound Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51WI</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x Objective</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">UMPLFLN10XW</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">40x Objective</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">LUMPLFLN40XW</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:216px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">BF150-86-7.5</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:183px;">Santa Barbara Instruments Group</td>
			<td style="width:119px;">ST-7XMEI</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:216px;">Axoclamp 900A Amplifier</td>
			<td style="width:183px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">2500&#8208;0179&#160;&#160;</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mater-9 Pulse Generator</td>
			<td style="width:183px;">AMPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iso-flex Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:183px;">AMPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software</td>
			<td style="width:183px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">1-2500-0180</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentric Bipolar Electrode</td>
			<td style="width:183px;">FHC</td>
			<td style="width:119px;">CBDSH75</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ball-joint Manipulator</td>
			<td style="width:183px;">Narishige&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Non-metalic Syringes 34 Gauge</td>
			<td style="width:183px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">MF34G-5</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nikon Stereomicroscope</td>
			<td style="width:183px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ800N</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">No. 5 Forceps</td>
			<td style="width:183px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:216px;">Spring Scissors</td>
			<td style="width:183px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15006-09</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">No. 2 Forceps</td>
			<td style="width:183px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5Q41</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microdissecting Scissors</td>
			<td style="width:183px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-5912SC</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:183px;">Dow Corning</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2404019862</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hair Removal Cream</td>
			<td style="width:183px;">Nair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:216px;">Grass SD9 Stimulator</td>
			<td style="width:183px;">Grass Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:216px;">Model P-1000 Micropipette Puller</td>
			<td style="width:183px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;">P-1000</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System</td>
			<td style="width:183px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">Low Pass Bessell Filter</td>
			<td style="width:183px;">Warner Instrument Corp.</td>
			<td style="width:119px;">LPF-8</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">Left-handed Micromanipulator</td>
			<td style="width:183px;">Siskiyou Corp.</td>
			<td style="width:119px;">MX1641/45DL</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">Right-handed Micromanipulator</td>
			<td style="width:183px;">Siskiyou Corp.</td>
			<td style="width:119px;">MX1641/45DR</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:216px;">Single Motion Controler</td>
			<td style="width:183px;">Siskiyou Corp.</td>
			<td style="width:119px;">MC100e</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="161">
			<td height="161" style="height:161px;width:216px;">Crossed Roller Micromanipulator</td>
			<td style="width:183px;">Siskiyou Corp.</td>
			<td style="width:119px;">MX1641R</td>
			<td style="width:288px;">This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="3" height="21" style="height:21px;width:517px;">All chemicals were orded from Fisher except,</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BTS</td>
			<td style="width:183px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">B315190</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CTX</td>
			<td style="width:183px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">C-270</td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">4-Di-2-Asp</td>
			<td style="width:183px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions

Bu iletişim kuralı geçerli-kelepçe ve gerilim-kelepçe koşullar altında nöromüsküler kavşak üzerinden kayıt sinaptik iletimi için bir teknik anlatılmaktadır. Çünkü bu motor endplate, elektrot kazığa oturtma için nöromüsküler kavşak kolay görselleştirme sağlar bir ince kas levator auris longus (LAL) ex vivo hazırlanması kullanılır. Bu yöntem için kayıt spontan minyatür endplate potansiyelleri ve akımlar (mEPPs ve mEPCs), endplate sinir uyarılmış potansiyeller ve akımlar (EPPs ve EPCs), aynı zamanda motor endplate membran özelliklerini tanır. Bu yöntem elde edilen sonuçları quantal (QC), vezikül yayın siteleri (n) sayısı, vezikül yayın (prel), sinaptik kolaylaştırma ve depresyon yanı sıra kas zarı zaman sabiti (τ olasılığı içerik m) ve giriş direnci. Bu tekniğin uygulamaya fare modelleri insan hastalık hastalığı Birleşik Devletleri anahtar patolojiler vurgulayın ve roman tedavi stratejileri belirlemek. Tam voltaj-tek bir synapse sıkma tarafından bu yöntem bir sinaptik iletimi şu anda mevcut en ayrıntılı analizlerini sağlar.

Şekil 8 geçerli bakliyat (şekil 8A) ve bir LAL fiber akım tipi kelepçe altında gerilim yanıtlarının (şekil 8B) bir 12-hafta-yaşlı vahşi türden R6/2 fare gösterilmektedir. Bu kayıtlar motor endplate alınmıştır mEPPs varlığını gösterir. Kayıtları normal fizyolojik serum çözümde elde edilmiştir. Bu akım tipi kelepçe kayıtları Riçinde ve τm bu li...

Watch this Scientific Journal Video about Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions at JoVE.com

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

levator-auris-longus-preparation-for-examination-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

9.3K Görüntüleme.  Wright State University. Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.

Video: Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo pharmacological studies of the signals essential for the formation and maintenance of mammalian NMJs. However, drug penetration into these muscles after subcutaneous or intramuscular administration is often incomplete or uneven and many NMJs can remain unaffected. Although systemic administration with devices such as mini-pumps can improve the spatiotemporal effects, the invasive nature of this approach can cause confounding inflammatory responses and/or direct muscle damage. Moreover, complete analysis of the NMJs in a hind limb muscle is challenging because it requires time-consuming serial sectioning and extensive immunostaining. 
The mouse LAL is a thin, flat sheet of muscle located superficially on the dorsum of the neck. It is a fast-twitch muscle that functions to move the pinna. It contains rostral and caudal portions that originate from the midline of the cranium and extend laterally to the cartilaginous portion of each pinna. The muscle is supplied by a branch of the facial nerve that projects caudally as it exits the stylomastoid foramen. We and others have found LAL to be a convenient preparation that offers advantages for the investigation of both short and long-term in vivo effects of drugs on NMJs and muscles. First, its superficial location facilitates multiple local applications of drugs under light anesthesia. Second, its thinness (2-3 layers of muscle fibers) permits visualization and analysis of almost all the NMJs within the muscle. Third, the ease of dissecting it with its nerve intact together with the pattern of its innervation permits supplementary electrophysiological analysis in vitro9,5. Last, and perhaps most importantly, a small applied volume (&tilde;50&mu;l) easily covers the entire muscle surface, provides a uniform and prolonged exposure of all its NMJs to the drug and eliminates the need for a systemic approach1,8.

We describe procedures for repeated administration of inhibitors of muscarinic signaling to the levator auris longus (LAL) muscle of young adult mice and for subsequent immunostaining of its neuromuscular junctions (NMJs) in wholemounts. The LAL muscle has unique advantages for revealing in vivo pharmacological effects on NMJs.

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus&#39;un Triple-immün

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Nörobilim

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Eşzamanlı Gerilim-kelepçe ve Amperometri ile Dopamin Film Tek Hücre Ölçümü

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subSubmitochondrial veziküllü Membranların Patch Kelepçe Kayıtlar Sahne&gt; ATPaz veziküllü Hazırlık ve Tekniği

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Astrocyte reaktivite ve nükleer silahların yayılmasına karşı Vitro iskemik benzeri koşullar altında izleme

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Görselleştirme düzleştirilmiş memeli Cortices'deki kortikal modülleri

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Akut omurilik dilimleri hazırlanması gözlemliyorum Gelatinosa nöronlar bütün hücreli yama-kelepçe kayıt için

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks of Parkinson's disease. Yet, much of its biological activity, as well as its aggregation, centrally involves the soluble monomer form of the protein. Elucidation of the molecular mechanisms of aSyn biology and pathophysiology requires structurally highly resolved methods and is sensitive to biological conditions. Its natively unfolded, meta-stable structures make monomeric aSyn intractable to many structural biology techniques. Here, the application of one such approach is described: hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry (HDX-MS) on the millisecond timescale for the study of proteins with low thermodynamic stability and weak protection factors, such as aSyn. At the millisecond timescale, HDX-MS data contain information on the solvent accessibility and hydrogen-bonded structure of aSyn, which are lost at longer labeling times, ultimately yielding structural resolution up to the amino acid level. Therefore, HDX-MS can provide information at high structural and temporal resolutions on conformational dynamics and thermodynamics, intra- and inter-molecular interactions, and the structural impact of mutations or alterations to environmental conditions. While broadly applicable, it is demonstrated how to acquire, analyze, and interpret millisecond HDX-MS measurements in monomeric aSyn.

The structural ensemble of monomeric alpha-synuclein affects its physiological function and physicochemical properties. The present protocol describes how to perform millisecond hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry and subsequent data analyses to determine conformational information on the monomer of this intrinsically disordered protein under physiological conditions.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Subkutan Muskarinik Antagonistleri Yönetim ve Farelerde levator Auris longus'un Triple-immün