Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Enstitüsü'nden F31DC017053-01A1 (Lenell, PI) ve K23DC014517 (Johnson, PI) hibeleri ile desteklendi.

Bu çalışma New York Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'ne uygun olarak gerçek gerçekleştirildi.
1. Sıçan larinksi diseksiyon
<ol><li>Kurumsal olarak onaylanmış protokole göre sıçanı ötenazi edin. Doku örneklerinde kürk kirlenmesini önlemek için ventral boynu mandibuladan manubriuma tıraş edin ve alkolle sürün.</li>
	<li>10x büyütmeli bir diseksiyon dürbün altında, nefes borusu açığa çıkına kadar neşterle orta hat boyun kesisi oluşturarak tüm larinksi kesinleştirin.</li>
	<li>Dış dıştrinsik gırtlaj kaslarını orta çizgide ayırarak, karaçamı, önps ve diseksiyon makası veya neşter kullanarak ortaya çıkarır.</li>
	<li>Trakea kaudalini üçüncü trakeal halkaya kesin ve diseksiyon makası kullanarak tüm larinksi çıkarmak için hyoid kemiğine bir kesi rostral yapın.</li>
	<li>Dışsal gırtlak dokularını (yemek borusu, tiroid bezi ve dıştrinsik gırtlak kasları) büyütme altında mikrodiseksiyon araçları (cımbız, pim ve mikros makas) kullanarak gırtlaktan çıkarın.</li>
	<li>Mikroscisörlerle, arka krikoarytenoid kasları arasındaki orta çizgiyi bir dönüm noktası olarak kullanarak gırtlağı arytenoidler arasında dorsally olarak ikiye ayırın. Ses kıvrımlarını ortaya çıkarmak için larinksin yanal duvarlarını sabitleyin ve daha sonra mikroscisörlerle ses kıvrımlarının ön komiseri arasındaki tiroid kıkırdayının orta çizgisi boyunca ventral olarak ikiye ayırın (Şekil 1). NOT: Bu adım isteğe bağlı olabilir; larinksi bütün tutmak için atlanabilir. Laringlerin bizeksiyonu, aynı larinksin sağ ve sol taraflarını ayrı ayrı kullanarak birden fazla immünostainasyon tekniğine izin verir.</li>
	<li>Her bir hemi-gırtlağı fosfat tamponlu çözeltide (PBS) ~10 s durulayın ve donma sırasında buz kristali oluşumunu azaltmak için bir görev silecek ile hassas bir şekilde kurulayın.</li>
</ol>2. Largeal dokuyu düzeltin ve/veya flaş dondurun
NOT: Fiksasyon tüm immün sistemi baskılama protokolleri için ideal olmayabilir. Genellikle laringeal dokular diseksiyondan hemen sonra flaş donmuş tazedir. Fiksasyon yapmadan laringeal dokuyu flaş dondurmak için adım 2.1'i atlayın.
<ol><li>Hemi-larynges sabitlemek için dokuları PBS'de% 4 formaldehit ile dolu santrifüj tüpüne 70 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat yerleştirin. Dokuları temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve PBS'de 20 dakika boyunca 3x durulayın. Daha sonra temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de% 20 sakkaroz /% 5 gliserol çözeltisine (~ 18 saat veya doku batana kadar) batırın. DİkKAT: Formaldehit tehlikelidir ve uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla birlikte duman kaputunda kullanılmalıdır.</li>
	<li>Tüm hemi-larynges'i düzgün bir konuma, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile dolu bir kriyo kalıbına yerleştirin. Hemilarynx için, ses kıvrımının medial yüzeyine sahip dokuyu kriyodoldun altına ve vokal kıvrımının boyuna yönüne kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak yerleştirin. Tüm larynges için, arka krikoarytenoidler kriyooldun altına ve kriyomold açıklığının alt kenarına paralel olarak vokal kıvrımının boyuna yönüne bakan dokuyu yerleştirin. NOT: OCT bileşiği içindeki tutarlı gırtlaj yönelimi, sıçan vokal kıvrımının kriyoseksiyonu için kritik öneme sahiptir. Hemilarynx gömülüp dondurulduktan sonra, yönünü değiştirmek için çözülmelidir, böylece birden fazla çözülme-donma döngüsünden doku hasarı riskleri ortaya getirilmelidir.</li>
	<li>Sıvı nitrojenle çevrili çelik bir beherde soğutulmuş izopentan (2-metilbütan) kullanarak flaş donduran dokular. NOT: Beherin yanlarında ve dibinde beyaz çökeltiler oluşmaya başladığında izopentan doku dondurma için en uygun sıcaklığa ulaşır13. Izopentan, sıvı nitrojenden daha yüksek bir termal iletkenliğe sahip olduğu için kullanılır, bu da hızlı donma sırasında doku bloğunun çatlamasını önlemeye yardımcı olur. OTC'deki donma dokusunun daha ayrıntılı bir açıklaması için Kumar ve ark.13'e bakın.</li>
	<li>Her kalıbı önceden etiketlenmiş folyoya sarın ve dehidrasyonu önlemek için ayrı bir dondurucu torbasına yerleştirin ve -80 °C dondurucuda saklanmak üzere transfer edilene kadar hemen kuru buzda saklayın.</li>
</ol>3. Kesit düzleminde kriyoseksiyon hemilarynx
<ol><li>Kriyostattaki oda sıcaklığını, üretici kılavuzu tarafından kas dokusu kesiti için önerilen sıcaklık aralığının (15−25 °C) ortasındaki -20 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Kriyostat kesit kalınlığını 10 μm kalınlığında bölümlere ayarlayın. NOT: Kas lifi kesit analizi için, 10 μm kalınlığındaki bölümler, fiber tipleme analizi için etiketli kas liflerinin tam boyama ve sağlam görüntüleme yoğunluğuna izin vermek için en uygun bölümlerdir14,15,16. Bazı protokoller nöromüsküler hedeflere bağlı olarak farklı kesit kalınlığı gerektirebilir.</li>
	<li>Dokuları kriyostat odasına aktarın, kriyostat numune diskine (chuck) düzgün bir OCT bileşiği katmanı ekleyin ve gömülü doku bloğunu örnek diskteki OCT bileşiğin üzerine yerleştirin. Tirarytenoid (TA) kas lifi analizi için vokal kıvrımının kesitlerini elde etmek için, numuneyi aynaya yapıştırın, böylece ventral tiroid kıkırdağı kriyostat bıçağına ve arytenoid kıkırdak örnek diske bakacaktır. NOT: OCT bileşiği dondurulduğunda beyaz ve opak hale geldiğinden, bu yer işaretlerinin bu aşamada görünmediğini belirtmek önemlidir. Bu görünürlük eksikliği, flaş dondurma aşamasında hemilarynx'in yönünü not etmenin kritik öneme sahip olmasının nedenidir.</li>
	<li>Tiroid kıkırdantının ventral kısmı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.</li>
	<li>Daha sonra tiroid kıkırdılmasının başlangıcından lamina propria, medial TA kasları ve lateral TA kası açığa çıkarana kadar 30 μm kesitleri kırpın ve izleyin. NOT: Gırtlağı simgesel yapılar izlenmeli ve kesit açısının eğik olmadığından emin olmak için tiroid kıkırdajının başlangıcından itibaren her 100 μm'de bir not edilmelidir. Şekil 2 , kesit düzlemdeki iki laringeal yer işareti kümesini 10x büyütmede temsil eder.</li>
	<li>Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 10 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.</li>
	<li>Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın. NOT: Sabit doku IHC hedefine bağlı olarak PBS'de bir haftaya kadar saklanabilirken, düzeltilmemiş doku derhal işlenmelidir.</li>
</ol>4. Boyuna düzlemde kriyoseksiyon hemilarynx
<ol><li>Kriyostat odası tekrar -20 ° C'ye ayarlanmışken, kesit kalınlığını 30 μm'ye değiştirin. NOT: NMJ analizi için, sinir terminali veya motor plakasının parçalanması olmadan gırtlaj kasları içindeki birkaç tam NMJ'yi yakalamak için 30−60 μm arasında bir doku kalınlığı kullanılabilir11,12,17.</li>
	<li>TA kasının NMJ analizi için boyuna vokal katlama bölümleri elde etmek için, numuneleri aynaya yapıştırın, böylece epiglottis kriyostat bıçağına ve trakeal lümen numune diskine doğru aşağı doğru yönelir.</li>
	<li>Tiroid kıkırdağı görünene kadar numune kafasını 100 μm ilerleterek OCT bileşiği kırpın.</li>
	<li>Tiroidin başlangıcından TA kasının lamina propria ve medial ve lateral bölünmelerine kadar 30 μm'lik bölümleri kırpın ve izleyin. NOT: Boyuna düzlemdeki beş laringeal yer işareti seti, doku derinliğinin hedef TA kasına doğru ilerlemesini izlemek için önerilir. Şekil 3 , 10x büyütmede boyuna düzlemdeki laringeal işaretleri temsil eder.</li>
	<li>Hedef TA kasına ulaşıldıktan sonra, 30 μm'de pozitif yüklü slaytlarda bölümler toplayın.</li>
	<li>Lekelendirilmeye hazır olana kadar nemi korumak için bölümleri PBS'de 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Connor, N. P., Suzuki, T., Lee, K., Sewall, G. K., Heisey, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+changes+in+aged+rat+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction changes in aged rat thyroarytenoid muscle.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (7), Pt 1 579-586 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Alterations+in+Myosin+Heavy+Chaing+Isoforms+in+Rat+Intrinsic+Laryngeal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Age-Related Alterations in Myosin Heavy Chaing Isoforms in Rat Intrinsic Laryngeal Muscles.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (11), 962(2002).</li>
<li>Johnson, A. M., Grant, L. M., Schallert, T., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Rat+50-kHz+Ultrasonic+Vocalizations+During+Dopamine+Denervation+and+Aging%3A+Relevance+to+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Changes in Rat 50-kHz Ultrasonic Vocalizations During Dopamine Denervation and Aging: Relevance to Neurodegeneration.</a> Current Neuropharmacology. 13 (2), 211-219 (2015).</li>
<li>Wright, J. M., Gourdon, J. C., Clarke, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+call+categories+within+the+rich+repertoire+of+adult+rat+50-kHz+ultrasonic+vocalizations%3A+effects+of+amphetamine+and+social+context%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple call categories within the rich repertoire of adult rat 50-kHz ultrasonic vocalizations: effects of amphetamine and social context.</a> Psychopharmacology. 211 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Bowers, J. M., Perez-Pouchoulen, M., Edwards, N. S., McCarthy, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp2+mediates+sex+differences+in+ultrasonic+vocalization+by+rat+pups+and+directs+order+of+maternal+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Foxp2 mediates sex differences in ultrasonic vocalization by rat pups and directs order of maternal retrieval.</a> Journal of Neuroscience. 33 (8), 3276-3283 (2013).</li>
<li>Basken, J. N., Connor, N. P., Ciucci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+ultrasonic+vocalizations+and+laryngeal+sensorimotor+neurons+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on ultrasonic vocalizations and laryngeal sensorimotor neurons in rats.</a> Experimental Brain Research. 219 (3), 351-361 (2012).</li>
<li>Ciucci, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+dopamine+synaptic+activity%3A+degradation+of+50-kHz+ultrasonic+vocalization+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduction of dopamine synaptic activity: degradation of 50-kHz ultrasonic vocalization in rats.</a> Behavioral Neuroscience. 123 (2), 328-336 (2009).</li>
<li>Ciucci, M. R., Vinney, L., Wahoske, E. J., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+translational+approach+to+vocalization+deficits+and+neural+recovery+after+behavioral+treatment+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Communication+Disorders%22%5BJournal%5D)">A translational approach to vocalization deficits and neural recovery after behavioral treatment in Parkinson disease.</a> Journal of Communication Disorders. 43 (4), 319-326 (2010).</li>
<li>Nagai, H., Ota, F., Konopacki, R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discoordination+of+laryngeal+and+respiratory+movements+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Discoordination of laryngeal and respiratory movements in aged rats.</a> American Journal of Otolaryngology. 26 (6), 377-382 (2005).</li>
<li>Ma, S. T., Maier, E. Y., Ahrens, A. M., Schallert, T., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+intravenous+cocaine+experience%3A+development+and+escalation+of+pre-drug+anticipatory+50-kHz+ultrasonic+vocalizations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Repeated intravenous cocaine experience: development and escalation of pre-drug anticipatory 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats.</a> Behavioural Brain Research. 212 (1), 109-114 (2010).</li>
<li>Inagi, K., Schultz, E., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anatomic+study+of+the+rat+larynx%3A+establishing+the+rat+model+for+neuromuscular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+and+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">An anatomic study of the rat larynx: establishing the rat model for neuromuscular function.</a> Otolaryngology and Head and Neck Surgery. 118 (1), 74-81 (1998).</li>
<li>Lenell, C., Newkirk, B., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laryngeal+Neuromuscular+Response+to+Short-+and+Long-Term+Vocalization+Training+in+Young+Male+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Laryngeal Neuromuscular Response to Short- and Long-Term Vocalization Training in Young Male Rats.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 62 (2), 247-256 (2019).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), e52793(2015).</li>
<li>McMullen, C. A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+evidence+of+age-related+denervation+in+rat+laryngeal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological evidence of age-related denervation in rat laryngeal muscles.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64 (4), 435-442 (2009).</li>
<li>McMullen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+stimulation-induced+changes+in+the+rodent+thyroarytenoid+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Speech%2C+Language%2C+and+Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Chronic stimulation-induced changes in the rodent thyroarytenoid muscle.</a> Journal of Speech, Language, and Hearing Research. 54 (3), 845-853 (2011).</li>
<li>Lenell, C., Johnson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+laryngeal+muscle+fibers+and+ultrasonic+vocalizations+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in laryngeal muscle fibers and ultrasonic vocalizations in the adult rat.</a> Laryngoscope. 127 (8), 270-276 (2017).</li>
<li>Johnson, A. M., Ciucci, M. R., Connor, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+training+mitigates+age-related+changes+within+the+vocal+mechanism+in+old+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vocal training mitigates age-related changes within the vocal mechanism in old rats.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 68 (12), 1458-1468 (2013).</li>
<li>Feng, X., Zhang, T., Ralston, E., Ludlow, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+neuromuscular+junctions+of+laryngeal+and+limb+muscles+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Differences in neuromuscular junctions of laryngeal and limb muscles in rats.</a> Laryngoscope. 122 (5), 1093-1098 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Nöromüsküler analiz için sıçan vokal kıvrımlarının hazırlanması çeşitli zorluklarla karşı karşıya olabilir. Gırtlağı kasları sadece küçük ve kıkırdakla çevrili değildir, böylece doğrudan hedef kasın çıkarılmasını zorlaştırır, ayrıca gırtlağı anatomik yer işaretlerinin derinliğinde hayvanlar arasında yüksek değişkenlik bulunmuştur. Kesit düzlem protokolünü kaslamak için, ventral tiroid kıkırdajının ilk görünümünden sonra 21−85 bölüm (bölüm başına 10 μ...

Sıçan larinksi, gelişim, yaşlanma, hastalık ve farmakolojik ajanlara yapısal ve fonksiyonel nöromüsküler laringeal adaptasyonları araştırmak için iyi kurulmuş bir modeldir1,2,3,4,5. Histolojik yöntemlerin tutarlılığı, kas hazırlama ve analizinde birden fazla incelik olduğu gibi gırtlağı kıkırdaklar içinde kapsüllenen kasların gırtlağı boyutu, şekli ve topografyası ile ilgili zorluklar olduğu için bu iş kolu için kritik öneme sahiptir1,6,7,8,9,10,11 . Sıçan içsel gırtlağım kaslarının küçük boyutu nedeniyle, tutarlı ve doğru sonuçlar elde etmek için sistematik gömme, dondurma ve kriyoseksiyon kritik öneme sahiptir. Örneğin, sıçan ses kıvrımını koronal düzlemde bölümlerken, içsel gırtlağı kaslarının dördünün nöromüsküler kavşakları (NMJs) doku derinliğinin 1,8 mm'den daha az içinde bulunur11. Bu nedenle, kriyoseksiyon sırasında gırtlaj kas anatomisinin hassas bir şekilde izlenmesi, ilgi alanlarını doğru bir şekilde tanımlamak ve dokunun aşırı bölümünü önlemek için zorunludur. Hedef kasın aşırı gözden belirlenmesi, NMJs11'in sayısının ve topografyasının yanlış tanımlanmasına neden olabilir veya hedef kas dönüm noktası oryantasyon karışıklığı nedeniyle atılırsa örnek boyutunda genel azalmalara neden olabilir12. Laringeal kasların ve ilgili adaptasyonlarının incelenmesi için yeni modeller geliştirildiği için, sonuçların kesin, güvenilir ve çalışmalar arasında tekrarlanabilir olmasını sağlamak için standart çalışma prosedürleri gereklidir.
Bu makalenin amacı, sıçan vokal kıvrımının optimal boyuna ve kesitsel analiz için hazırlanmasını detaylandırmaktır. Kriyoseksiyon sırasında hedef kas yer işaretlerini belirlemek için laboratuvarımızda düzenli olarak kullanılan ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Benzer yöntemler birkaç laboratuvarda kullanılsa da, acemi araştırmacılar tarafından uygulandığında güvenilir ve doğru replikasyon sağlamak için burada literatüre göre daha fazla ayrıntı sağlanmaktadır. Bu öğreticinin amacı, laboratuvarlar ve araştırmalar arasında tutarlılığı artırmak için sıçan vokal kıvrımının immünohistokimyasal (IHC) değerlendirilmesi için standart bir metodoloji sağlamaktır.

<table><tbody><tr><td>2-Methylbutane Certified</td><td>Fisher Chemical</td><td>35514</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>1213101</td><td></td></tr><tr><td>Cryo Tongs SS</td><td>Thermo Scientific</td><td>11679123</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat blades</td><td>C.L. Sturkey D554X50</td><td>22-210-045</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Base Molds 15mm x 15mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>41-741</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Underpads</td><td>Medline</td><td>23-666-062</td><td></td></tr><tr><td>Dissection kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>9996969</td><td></td></tr><tr><td>DPBS - Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>Frozen Section Medium</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td>Bel-Art</td><td>11999054</td><td></td></tr><tr><td>Immunostain Moisture Chamber</td><td>Ted Pella Inc</td><td>NC9425474</td><td></td></tr><tr><td>Needle holders</td><td>Assi</td><td>ASSI.B148</td><td></td></tr><tr><td>Non-Woven Sponges, 4 Ply</td><td>Quick Medical</td><td>9023</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Troemner</td><td>02-217-987</td><td></td></tr><tr><td>Pap pen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td><td>Alfa Aesar</td><td>50-00-0</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Storage Bags</td><td>Fisherbrand</td><td>19240093</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Graduated Measure 32 oz/100 mL</td><td>Polar Ware</td><td>114231B</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Task wiper</td><td>Kimberly-Clark Professional&amp;trade; 34155</td><td>06666A</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisherbrand</td><td>2261840</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Pattern Scissors</td><td>Assi</td><td>ASSI.SAS15RV</td><td></td></tr><tr><td>NOTE: For all supplies, these are examples of equipment to purchase. The exact model is not necessary to complete our methods.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of the rat vocal fold for neuromuscular analyses

Bu öğreticinin amacı histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımının hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu protokol, sıçan gırtlağım diseksiyonu, flaş dondurma ve ses kıvrımlarının kriyoseksiyonu için prosedürleri özetlemektedir. Bu çalışmada hem boyuna hem de kesitsel düzlemlerde kriyoseksiyon vokal kıvrımlarının nasıl ağlaşılacağı açıklanmaktadır. Bu protokolün bir yeniliği, kriyoseksiyon sırasında içsel gırtlağın doğru tanımlanmasını sağlayan ve doku kaybı olasılığını azaltan gırtlağı takibidir. Rakamlar her iki düzlemde de ilerleyici kriyoseksiyon olduğunu gösteriyor. Tiroid kıkırdılmasının ortaya çıkışından tam vokal kıvrımını içeren ilk bölümün görünümüne kadar yirmi dokuz sıçan hemi-larynges kriyoseksiyon ve izlendi. Tam vokal kıvrımı her iki düzlemdeki tüm hayvanlar için görselleştirildi. Tiroid kıkırdajının görünümünden her iki düzlemde de tam ses kıvrımının görünümüne kadar olan mesafede yüksek değişkenlik vardı. Ağırlık, laringeal yer işaretlerinin derinliği ile ilişkili değildi, bu da bireysel değişkenlik ve doku hazırlığı ile ilgili diğer faktörlerin, bölümleme sırasında yer işaretlerinin görünümündeki yüksek değişkenliklerden sorumlu olabileceğini düşündürdü. Bu çalışma bir metodolojiyi detaylandırıyor ve sıçan vokal kıvrımını histokimyasal nöromüsküler araştırma için hazırlamak için morfolojik veriler sunuyor. Yüksek bireysel değişkenlik nedeniyle, aşırı doku ve doku kaybını önlemek için kriyoseksiyon sırasında gırtlağı yer işaretleri yakından takip edilmelidir. Yeterli doku hazırlama ve sıçan larinks içindeki yer işaretlerinin farkındalığı da dahil olmak üzere tutarlı bir metodolojinin kullanılması, çalışmalar genelinde tutarlı sonuçlara yardımcı olacak ve laringeal nöromüsküler mekanizmaları araştırmak için sıçan vokal kıvrımını bir model olarak kullanmakla ilgilenen yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır.

Temsili sonuçlar, vokal egzersizinin laringeal nöromüsküler sistem üzerindeki etkilerinin devam eden bir araştırmasının bir parçasıydı. 29 erkek Fischer 344/kahverengi Norveç sıçanı (12 9 aylık, 17 24 aylık) CO2 inhalasyonu ve ardından bilateral torakotomi ile tartıldı ve ötenaziye tabi tökezlendi.
Prosedürler, lateral ve medial TA kaslarının NMJ'leri ve lif boyutunu etiketlemek için belirtilen protokolü izledi. Gırtlağı simgesel yapıları arasındaki...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses at JoVE.com

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

preparation-of-the-rat-vocal-fold-for-neuromuscular-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.5K Görüntüleme.  New York University School of Medicine. Bu protokol, histokimyasal nöromüsküler çalışma için sıçan vokal kıvrımları hazırlamak için kullanılan yöntemleri açıklar.

Video: Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Nörobilim

Targeted Training of Ultrasonic Vocalizations in Aged and Parkinsonian Rats

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting communication abilities. 1, 2 Targeted training (speech/voice therapy) can improve specific voice deficits,3, 4 although the underlying mechanisms of behavioral interventions are not well understood. Systematic investigation of voice deficits and therapy should consider many factors that are difficult to control in humans, such as age, home environment, age post-onset of disease, severity of disease, and medications. The method presented here uses an animal model of vocalization that allows for systematic study of how underlying sensorimotor mechanisms change with targeted voice training. The ultrasonic recording and analysis procedures outlined in this protocol are applicable to any investigation of rodent ultrasonic vocalizations.
The ultrasonic vocalizations of rodents are emerging as a valuable model to investigate the neural substrates of behavior.5-8 Both rodent and human vocalizations carry semiotic value and are produced by modifying an egressive airflow with a laryngeal constriction.9, 10 Thus, rodent vocalizations may be a useful model to study voice deficits in a sensorimotor context. Further, rat models allow us to study the neurobiological underpinnings of recovery from deficits with targeted training.
To model PD we use Long-Evans rats (Charles River Laboratories International, Inc.) and induce parkinsonism by a unilateral infusion of 7 &mu;g of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into the medial forebrain bundle which causes moderate to severe degeneration of presynaptic striatal neurons (for details see Ciucci, 2010).11, 12 For our aging model we use the Fischer 344/Brown Norway F1 (National Institute on Aging).
Our primary method for eliciting vocalizations is to expose sexually-experienced male rats to sexually receptive female rats. When the male becomes interested in the female, the female is removed and the male continues to vocalize. By rewarding complex vocalizations with food or water, both the number of complex vocalizations and the rate of vocalizations can be increased (Figure 1).
An ultrasonic microphone mounted above the male's home cage records the vocalizations. Recording begins after the female rat is removed to isolate the male calls. Vocalizations can be viewed in real time for training or recorded and analyzed offline. By recording and acoustically analyzing vocalizations before and after vocal training, the effects of disease and restoration of normal function with training can be assessed. This model also allows us to relate the observed behavioral (vocal) improvements to changes in the brain and neuromuscular system.

Voice disorders are debilitating in aging and Parkinson disease. The ultrasonic vocalizations of rats, also affected by these conditions, can be used to study these voice disorders, their neural substrates, and the nature of functional recovery with behavioral intervention.

Yaşlı ve Parkinson Sıçanlar Ultrasonik seslenmelere Hedefe Yönelik Eğitim

Voice deficits are a common complication of both Parkinson disease (PD) and aging; they can significantly diminish quality of life by impacting ...

Subcutaneous Neurotrophin 4 Infusion Using Osmotic Pumps or Direct Muscular Injection Enhances Aging Rat Laryngeal Muscles

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if any, therapies exist that target age-related laryngeal muscle dysfunction. Neurotrophins are involved in muscle innervation and differentiation of neuromuscular junctions (NMJs). It is thought that neurotrophins enhance neuromuscular transmission by increasing neurotransmitter release. The neuromuscular junctions (NMJs) become smaller and less abundant in aging rat laryngeal muscles, with evidence of functional denervation. We explored the effects of NTF4 for future clinical use as a therapeutic to improve function in aging human laryngeal muscles. Here, we provide the detailed protocol for systemic application and direct injection of NTF4 to investigate the ability of aging rat laryngeal muscle to remodel in response to NTF4 application. In this method, rats either received NTF4 either systemically via osmotic pump or by direct injection through the vocal folds. Laryngeal muscles were then dissected and used for histological examination of morphology and age-related denervation.

Here, we present a protocol to describe the use of neurotrophin 4 (NTF4) systemically and directly to remodel rat aging laryngeal muscles.

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Laryngeal dysfunction in the elderly is a major cause of disability, from voice disorders to dysphagia and loss of airway protective reflexes. Few, if ...

Gelişim Biyolojisi

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory system is characterized by its ability to give rise to new neurons even in adult animals. This particular ability is partly due to the presence of OECs which create a favorable microenvironment for neurogenesis. This property of OECs has been used for cellular transplantation such as in spinal cord injury models. Although the peripheral nervous system has a greater capacity to regenerate after nerve injury than the central nervous system, complete sections induce misrouting during axonal regrowth in particular after facial of laryngeal nerve transection. Specifically, full sectioning of the recurrent laryngeal nerve (RLN) induces aberrant axonal regrowth resulting in synkinesis of the vocal cords. In this specific model, we showed that OECs transplantation efficiently increases axonal regrowth.
OECs are constituted of several subpopulations present in both the olfactory mucosa (OM-OECs) and the olfactory bulbs (OB-OECs). We present here a model of cellular transplantation based on the use of these different subpopulations of OECs in a RLN injury model. Using this paradigm, primary cultures of OB-OECs and OM-OECs were transplanted in Matrigel after section and anastomosis of the RLN. Two months after surgery, we evaluated transplanted animals by complementary analyses based on videolaryngoscopy, electromyography (EMG), and histological studies. First, videolaryngoscopy allowed us to evaluate laryngeal functions, in particular muscular cocontractions phenomena. Then, EMG analyses demonstrated richness and synchronization of muscular activities. Finally, histological studies based on toluidine blue staining allowed the quantification of the number and profile of myelinated fibers.
All together, we describe here how to isolate, culture, identify and transplant OECs from OM and OB after RLN section-anastomosis and how to evaluate and analyze the efficiency of these transplanted cells on axonal regrowth and laryngeal functions.

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth of the primary olfactory neurons. This specific property can be used for cellular transplantation. We present here a model of cellular transplantation based on the use of OECs in a laryngeal nerve injury model.

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

A Murine Model of Cervical Spinal Cord Injury to Study Post-lesional Respiratory Neuroplasticity

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed to improve/ameliorate the respiratory failure following high cervical spinal cord injury (SCI). Here we propose a murine pre-clinical model of high SCI at the cervical 2 (C2) metameric level to study diverse post-lesional respiratory neuroplasticity. The technique consists of a surgical partial injury at the C2 level, which will induce a hemiparalysis of the diaphragm due to a deafferentation of the phrenic motoneurons from the respiratory centers located in the brainstem. The contralateral side of the injury remains intact and allows the animal recovery. Unlike other SCIs which affect the locomotor function (at the thoracic and lumbar level), the respiratory function does not require animal motivation and the quantification of the deficit/recovery can be easily performed (diaphragm and phrenic nerve recordings, whole body ventilation). This pre-clinical C2 SCI model is a powerful, useful, and reliable pre-clinical model to study various respiratory and non-respiratory neuroplasticity events at different levels (molecular to physiology) and to test diverse putative therapeutic strategies which might improve the respiration in SCI patients.

Respiratory failure is the leading cause of death following a cervical spinal cord injury. Having a reproducible, quantifiable, and reliable pre-clinical animal model of respiratory failure induced by a partial cervical injury will help to understand the subsequent respiratory and non-respiratory neuroplasticity and allow testing putative repair strategies.

Post-lezyonlu Solunum nöroplastisite Eğitim için Servikal Spinal Kord Yaralanması bir fare modeli

A cervical spinal cord injury induces permanent paralysis, and often leads to respiratory distress. To date, no efficient therapeutics have been developed ...

Tıp

Çok Katmanlı Silikon Vokal Fold Modellerinin 3D Baskısı

Manufacturing Process for Non-Adhesive Super-Soft Vocal Fold Models

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal fold models results in models with undesirable properties, such as stickiness and reproducibility issues. Those vocal fold models are prone to rapid aging, leading to poor comparability across different measurements. In this study, we propose a modification to the manufacturing process by changing the order of layering the silicone material, which leads to the production of non-sticky and highly consistent vocal fold models. We also compare a model produced using this method with a conventionally manufactured vocal fold model that is adversely affected by its sticky surface. We detail the manufacturing process and characterize the properties of the models for potential applications. The outcomes of the study demonstrate the efficacy of the modified fabrication method, highlighting the superior qualities of our non-sticky vocal fold models.&#160;The findings contribute to the development of realistic and reliable vocal fold models for research and clinical applications.

Yazar Spotlight: Fonetik ve Robotik Uygulamalar için Sentetik Vokal Fold Modellerinin İmalatındaki Gelişmeler

This study demonstrates the manufacturing of non-sticky and super-soft vocal fold models by introducing a specific way to create the vocal fold layers, providing a detailed description of the manufacturing procedure, and characterizing the properties of the models.

Yapışkan Olmayan Süper Yumuşak Vokal Fold Modelleri için Üretim Süreci

This study aims to develop super-soft, non-sticky vocal fold models for voice research. The conventional manufacturing process of silicone-based vocal ...

Mühendislik

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include supporting mastication and deglutition, as well as taste-sensing and phonetics. Accordingly, the strength and volume of the tongue can impact the ability of vertebrates to accomplish basic activities such as feeding, communicating, and breathing. Human patients with sleep apnea have enlarged tongues, characterized by reduced muscle tone and increased intramuscular fat that can be visualized and quantified by magnetic resonance imaging (MRI). The abilities to measure force generation and viscoelastic properties of the tongue constitute important tools for obtaining functional information to correlate with imaging data. Here, we present techniques for measuring tongue force production in anesthetized Zucker rats via electrical stimulation of the hypoglossal nerves and for determining the viscoelastic properties of the tongue by applying passive Lissajous force/deformation curves.

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

We describe a surgical procedure in an anesthetized rat model for determining the muscle tone and viscoelastic properties of the tongue. The procedure involves specific stimulation of the hypoglossal nerves and application of passive Lissajous force/deformation curves to the muscle.

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

<meta charset="utf8"></head><body>Kemirgenlerde Laringeal Disfonksiyonu İncelemek için Endoskopik Yaklaşım

Minimally Invasive Murine Laryngoscopy for Close&#45;Up Imaging of Laryngeal Motion During Breathing and Swallowing

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to impair laryngeal function, which results in difficulty&#160;breathing (dyspnea), swallowing impairment (dysphagia), and/or voice impairment (dysphonia). Dysphagia, in particular, can lead to aspiration pneumonia and associated morbidity, recurrent hospitalization, and early mortality. Despite these serious consequences, existing treatments for laryngeal dysfunction are largely aimed at surgical and behavioral interventions that unfortunately do not typically restore normal laryngeal function, thus highlighting the urgent need for innovative solutions.
To bridge this gap, we have been developing an experimental endoscopic approach to investigate laryngeal dysfunction in murine (i.e., mouse and rat) models. However, endoscopy in rodents is quite challenging due to their small size relative to current endoscope technology, anatomical differences in the upper airway, and the necessity for anesthesia to optimally access the larynx. Here, we describe a novel transoral laryngoscopy approach that permits close-up, unobstructed video imaging of laryngeal motion in mice and rats. Critical steps in the protocol include precise anesthesia management (to prevent overdosing that abolishes swallowing and/or risks respiratory distress-related mortality) and micromanipulator control of the endoscope (for stable video recording of laryngeal motion by a single researcher for subsequent quantification).
Importantly, the protocol can be performed over time in the same animals to study the impact of various pathological conditions specifically on laryngeal function. A novel advantage of this protocol is the ability to visualize airway protection during swallowing, which is not possible in humans due to epiglottic inversion over the laryngeal inlet that obstructs the glottis from view. Rodents therefore provide a unique opportunity to specifically investigate the mechanisms of normal versus pathological laryngeal airway protection for the ultimate purpose of discovering treatments to effectively restore normal laryngeal function.

<meta charset="utf8"></head><body>Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesi için minimal invaziv murin laringoskopi

This protocol describes a serial transoral laryngoscopy approach for mice and rats that permits close-up, unobstructed video imaging of the larynx during breathing and swallowing using an optimized anesthetic regimen and finely tuned endoscopic manipulation techniques.

Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesi için minimal invaziv murin laringoskopi

The larynx is an essential organ in mammals with three primary functions - breathing, swallowing, and vocalizing. A wide range of disorders are known to ...

Nöromüsküler Analizler için Sıçan Vokal Kıvrımının Hazırlanması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Hareketi tarafından Modülasyonlu Nöronlar Fizyolojik, Morfolojik ve nörokimyasal Karakterizasyonu

Yaşlı ve Parkinson Sıçanlar Ultrasonik seslenmelere Hedefe Yönelik Eğitim

Osmotik Pompalar veya Doğrudan Kas Enjeksiyonu Kullanılarak Subkutanöz Neurotrophin 4 İnfüzyonu, Yaşlanan Farenin Larinks Kaslarını Arttırır

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Post-lezyonlu Solunum nöroplastisite Eğitim için Servikal Spinal Kord Yaralanması bir fare modeli

Yapışkan Olmayan Süper Yumuşak Vokal Fold Modelleri için Üretim Süreci

Yapışkan Olmayan Süper Yumuşak Vokal Fold Modelleri için Üretim Süreci

Yapışkan Olmayan Süper Yumuşak Vokal Fold Modelleri için Üretim Süreci

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

Solunum ve yutma sırasında gırtlak hareketinin yakından görüntülenmesi için minimal invaziv murin laringoskopi