Name: a11-positive β-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis
Uploaded: 2018-05-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A11-positive Î²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

Bu eser Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (U1503223, 81673407, 21475131), kar amacı gütmeyen teknoloji Zhejiang Eyaleti (2016 C 37110), Ningbo uluslararası bilim ve teknoloji üzerinde uygulamalı araştırma projesi hibe tarafından desteklenmiştir İşbirliği projesi (2014D 10019), yaşam bilimleri ve sağlık (2015C 110026), Ningbo bilim ve teknoloji proje yaygın zenginlik (2017C 50042), Li Dak toplamı Yip Yio çene Kenneth Li Marine biyofarmasotik Kalkınma Fonu için Ningbo Belediye yenilik ekibinin, ve Ningbo Üniversitesi'nde K. C. Wong Magna fonu.

1. çözüm hazırlık
Not: Tablo malzemeleri reaktif kaynakları için bakın.
<ol><li>%5 Sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 5 g çift distile su 100 mL için eklemek suretiyle hazırlamak. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-oligomer antikor A11 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-Aβ antikor 6E10 çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir anti-fibriler oligomer antikor OC çözümü (1:1, 000) 10 mL % 5 BSA çözeltisi için antikor hisse senedi çözüm 10 µL ekleyerek hazırlayın. Tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Bir Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hisse senedi çözüm 24 g Tris tabanının ve 88 gr NaCl 1000 mL için çift distile su ekleyerek hazırlayın. PH 7.4 için ayarlayın. Çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklayın.</li>
	<li>Tris arabelleğe alınmış serum ve ara-20 (TBST) çözüm ara-20 1 mL 100 mL TBS ekleyerek hisse senedi çözüm ve 900 mL çift distile su hazırlamak.</li>
	<li>Bir ikincil antikor çözüm horseradish ekleyerek 10 µL tarafından peroksidaz (HRP) keçi Anti-tavşan IgG (H + L) 10 mL TBST çözeltisi için hazır olun. Onları tamamen vortexing tarafından mix onları. Çözüm 4 ° c ilâ 1 ay için saklayın.</li>
	<li>Curcumin dimetil sülfoksit (10 mM curcumin hisse senedi çözüm oluşturmak için DMSO) 1 ml 3.68 g geçiyoruz.</li>
	<li>Sentetik Aβ1-42 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (2.5-mg/mL Aβ monomer çözüm oluşturmak için HFIP) 2 ml 5 mg geçiyoruz. 20 dk. yapmak 100 µL aliquots için oda sıcaklığında (25 ° C) yerleştirin ve 6 aya kadar-20 ° C'de depolayın. Not: Bu yordam kısa sürede çalıştırılması gerekir. Pipet ipuçları doğru pipetting emin olmak için kesilmiş.</li>
	<li>Electrochemiluminescence (ECL) sıvı hacim oranı 1:1 ECL sıvı A ve B karıştırarak hazırlayın. Bu çözüm sadece kullanmadan önce hazırlanmalıdır.</li>
</ol>2. numune hazırlama
Not: 2 gün önce analiz kurutma nokta numune hazırlama gerçekleştirin.
<ol><li>Çift distile su 900 µL Aβ1-42 monomer çözüm bir tüp için ekleyin; Aβ1-42 konsantrasyonu 0.25 mg/mL olacaktır. 20 dakika oda sıcaklığında karışımı yerleştirin.</li>
	<li>Hacmi yaklaşık 850 µL olana yüksek saflıkta azot gazı ile çözüm buharlaşır. Aβ1-42 çözüm konsantrasyonu 0.29 mg/mL hakkında olacak. Not: Çözüm zaman zaman HFIP tamamen buharlaşıp emin olmak için sarsılmış. Normalde, buharlaşma, 30 dk sonra kalan çözüm yaklaşık 850 µL birimdir.</li>
	<li>Curcumin hisse senedi çözüm curcumin çalışan bir çözüm (0.2 ve 2 µM) çift distile suyla seyreltik. Aβ1-42çözüm ve çözüm 1:1 bir hacim oranı ile çalışma curcumin karıştırın. Curcumin son konsantrasyonları 0,1 ve 1 µM. Not: Potansiyel oligomer inhibitörleri Aβ1-42 çözüm gerekirse herhangi bir oranda ile karışabilir.</li>
	<li>Çözüm, sürekli olarak bir manyetik karıştırıcı sallamak ( Tablo malzemelerigörmek).<ol>
<li>Manyetik karıştırıcı bir plastik ayırıcı kutusuna düzeltmek. Place 2 manyetik barlar kutusunun 2 köşesine heyecan ve örnek tüpler kutusunun ortasına yerleştirin.</li>
		<li>Kutusu, oda sıcaklığında (25 ° C) 48 h için salla. Not: Manyetik karıştırıcı hızını yaklaşık 60 rpm olduğunu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4 ° C'de 15 dakika tüpler santrifüj kapasitesi ve 18.000 x g. süpernatant toplamak.</li>
</ol>3. dot blot Analizi
Not: Tüm incubations üzerinde yatay bir shaker gerçekleştirilir.
<ol><li>Nitroselüloz membran 1 cm genişliğinde şeritler halinde kesin. Not: Nitroselüloz membran genişliğini deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.</li>
	<li>2-µL örnekleri eşit 2 şeritler (şerit 1 ve 2) 0.5 cm her noktası Aralık ile yerleştirin.</li>
	<li>Damlacık grup üzerinde kuru olana, oda sıcaklığında 5 min için şeritler yerleştirin.</li>
	<li>Şeritler, oda sıcaklığında 30 dk için %5 BSA çözüm ile kuluçkaya.</li>
	<li>Şeritler ile bir TBST çözüm 5 min için oda sıcaklığında durulayın.</li>
	<li>TBST çözüm Aspire edin. 1 h, oda sıcaklığında için şerit bir anti-oligomer antikor A11 çözüm 1 kuluçkaya ve 2 anti-Aβ antikor 6E10 çözümünü ile şerit.</li>
	<li>Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.</li>
	<li>TBST çözüm Aspire edin. Şeritler, oda sıcaklığında 40 min için bir ikincil antikor çözüm ile kuluçkaya.</li>
	<li>Şeritler bir TBST çözüm ile üç kez, her zaman oda sıcaklığında 5 min için durulayın.</li>
	<li>Eşit karma ECL sıvı şeritler yüzey için geçerlidir. Şeritler görüntüleme sistemi bir otomatik Kemiluminesan maruz ( Tablo malzemelerigörmek). Not: Normalde, ECL sıvı 300 µL bir membran yeter. Membran pozlama sırasında nemli tutulmalıdır. Pozlama süresi görüntüleme sistem tarafından otomatik olarak hesaplanır.</li>
	<li>Yarı kantitatif sonuçları elde etmek için ImageJ (Ulusal Sağlık Enstitüleri) veya başka bir görüntü işleme yazılımı kullanarak bir gri tonlamalı analizi yapmak.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lauren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+prion+protein+as+a+therapeutic+target+in+Alzheimer's+disease.">Cellular prion protein as a therapeutic target in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 38 (2), 227-244 (2014).</li><li>De Maio, A., Rivera, I., Cauvi, D. M., Arispe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+amyloid+peptide+oligomerization+and+toxicity+by+extracellular+Hsp70.">Modulation of amyloid peptide oligomerization and toxicity by extracellular Hsp70.</a> Biophysical Journal. 112 (3), 444 (2017).</li><li>Di Scala, C., Chahinian, H., Yahi, N., Garmy, N., Fantini, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Alzheimer's+beta-amyloid+peptides+with+cholesterol:+mechanistic+insights+into+amyloid+pore+formation.">Interaction of Alzheimer's beta-amyloid peptides with cholesterol: mechanistic insights into amyloid pore formation.</a> Biochemistry. 53 (28), 4489-4502 (2014).</li><li>Xiang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fucoxanthin+inhibits+beta-amyloid+assembly+and+attenuates+beta-amyloid+oligomer-induced+cognitive+impairments.">Fucoxanthin inhibits beta-amyloid assembly and attenuates beta-amyloid oligomer-induced cognitive impairments.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (20), 4092-4102 (2017).</li><li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+against+beta-amyloid-induced+synaptic+and+memory+impairments+via+altering+beta-amyloid+assembly+by+bis(heptyl)-cognitin.">Protection against beta-amyloid-induced synaptic and memory impairments via altering beta-amyloid assembly by bis(heptyl)-cognitin.</a> Scientific Reports. 5, 10256 (2015).</li><li>Yam, G. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+amyloid+aggregate+forming+ability+of+TGFBI+mutants+that+cause+corneal+dystrophies.">In vitro amyloid aggregate forming ability of TGFBI mutants that cause corneal dystrophies.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (9), 5890-5898 (2012).</li><li>Tomaselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-to-beta+conformational+transition+of+Alzheimer's+A+beta-(1-42)+peptide+in+aqueous+media+is+reversible:+A+step+by+step+conformational+analysis+suggests+the+location+of+beta+conformation+seeding.">The alpha-to-beta conformational transition of Alzheimer's A beta-(1-42) peptide in aqueous media is reversible: A step by step conformational analysis suggests the location of beta conformation seeding.</a> ChemBioChem. 7 (2), 257-267 (2006).</li><li>Shigemitsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+evidence+for+the+dimer+formation+of+beta+amyloid+peptide+1-42+in+1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.">Nuclear magnetic resonance evidence for the dimer formation of beta amyloid peptide 1-42 in 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol.</a> Analytical Biochemistry. 498, 59-67 (2016).</li><li>Khan, M. V., Rabbani, G., Ahmad, E., Khan, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoroalcohols-induced+modulation+and+amyloid+formation+in+conalbumin.">Fluoroalcohols-induced modulation and amyloid formation in conalbumin.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 70, 606-614 (2014).</li><li>Fang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-hydroxycyclopenicillone,+a+new+beta-amyloid+fibrillization+inhibitor+from+a+sponge-derived+fungus+trichoderma+sp+HPQJ-34.">5-hydroxycyclopenicillone, a new beta-amyloid fibrillization inhibitor from a sponge-derived fungus trichoderma sp HPQJ-34.</a> Marine Drugs. 15 (8), 260 (2017).</li><li>Shiao, Y. J., Su, M. H., Lin, H. C., Wu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Echinacoside+ameliorates+the+memory+impairment+and+cholinergic+deficit+induced+by+amyloid+beta+peptides+via+the+inhibition+of+amyloid+deposition+and+toxicology.">Echinacoside ameliorates the memory impairment and cholinergic deficit induced by amyloid beta peptides via the inhibition of amyloid deposition and toxicology.</a> Food &amp; Function. 8 (6), 2283-2294 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için bir yöntem Aβ1-42 oligomer içeren numune hazırlama ve analiz kurutma bir nokta tarafından A11-pozitif Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlemek için bildirdin. Bizim yöntemleri Aβ1-42 oligomer zengini örnekleri hazırlanması için oldukça basit, güvenilir ve tekrarlanabilir olmakla birlikte, hala fark gereken bazı noktalar vardır. İlk olarak, HFIP sentetik Aβ1-42 peptid dağıtmak için kullanılır. Bir araya getirilmiş Aβ1-42 pepti...

Alzheimer hastalığı (Ah) yaşlı insanlar dünya çapında1etkileyen en önemli nörodejeneratif hastalıklardan birisidir. β-amiloid (Aβ) anormal toplama reklam önde gelen patolojik etken olabilir yaygın olarak kabul edilir. Aβ toplamları Senil plakalar, bir reklam hastaların beyinlerinin biyolojik işaretleri ana bileşenleri vardır. Ayrıca, Aβ toplamları reaksiyonlar özellikle de dahil olmak üzere, reklam ilerledikçe nöronal ölüm sebebi olabilir güçlü nörotoksisite üretmek. Bu nedenle, Aβ oligomer oluşumu inhibisyonu ateş engelleyebilir ve Aβ oligomer inhibitörleri-var geliştirilen hastalığı olarak değiştirme AD tedaviler. Birçok çalışma sentetik Aβ peptid reaksiyonlar içinde vitroformu, türleri Morfoloji ve yapay Aβ reaksiyonlar yapıları keşfetmek ve vitro modelleri2,3 kullanarak Aβ oligomer inhibitörleri araştırmak için kullanılan , 4. ancak, farklı vitro oluşumu protokolleri Aβ oligomer oligomer farklı araştırma grupları arasında eşsiz sonuçlar neden olabilir farklı morfolojik özelliklere sahip yol açabilir. Bu nedenle, bir standart oluşumu protokol Aβ oligomer için acilen ihtiyacı vardı.
Şimdiye kadar çoğu yöntemleri doğrudan Aβ reaksiyonlar algılamak için rapor edilmiştir. İletim elektronik mikroskobu (TEM), Sigara denaturing Jel Elektroforez, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve dot blot Analizi miktar ve/veya morfolojisi Aβ oligomer vitro5, incelemek için kullanılabilir 6. Örneğin, Morfoloji ve Aβ oligomer yapısını TEM içinde görülebilir. Göreli tutarları ve moleküler boyutu Aβ toplamalardan sigara denaturing jel elektroforez tarafından ölçülen. ELISA Aβ oligomer serum, plazma ve beyin dokusu özler belirlemek için kullanılabilir. Son olarak, dot blot analizi, algılamak için kullanılan bir teknik analiz ve proteinler, tanımlama Aβ oligomer farklı örneklerinde göreli yoğunlaşmasını oligomer ve Aβ özgü antikorlar yardımıyla değerlendirmek için kullanılabilir. Jel Elektroforez ve blotting yordamları jeller için gerekli değildir Ayrıca, tahlil kurutma bir nokta önemli zaman tasarrufu sunuyor. Bu nedenle, bu tahlil normalde ekran potansiyel Aβ oligomer inhibitörleri kullanılır. Bu iletişim kuralı genel amacı dot blot Analizi ve ekran Aβ oligomer Aβ1-42 oligomer miktarda çözümlenecek bir Aβ1-42 oligomer zengini örnek, hazırlamak için nispeten basit, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem tarif etmektir Yarı kantitatif deneysel sonuçlar kullanarak inhibitörleri.

<table><tbody><tr><td>A11 (ab126892 Rb pAb to Amyloid Oligomers)</td><td>Abcam</td><td>GR91739-58</td><td></td></tr><tr><td>6E10 (beta-Amyloid Rabbit Ab)</td><td>Cell&amp;nbsp;Signalling Technology</td><td>2454S</td><td></td></tr><tr><td>OC (Anti-Amyloid Fibrils OC Antibody)</td><td>Millipore</td><td>AB2286</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP) Marker Goat anti rabbit IgG (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>A0208</td><td></td></tr><tr><td>A&amp;beta;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt;</td><td>GL Biochem</td><td>52487</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-Hexafiuoro-2-propanol</td><td>Aladdin</td><td>I1523078</td><td></td></tr><tr><td>Curcumin</td><td>Sigma</td><td>C1386</td><td></td></tr><tr><td>Albumin Bovine V</td><td>Solarbio</td><td>A8020</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sangon Biotech</td><td>D920BA0003</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SCR</td><td>30166428</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Solarbio</td><td>T8060</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Dimethyl sulfoxide</td><td>Solarbio</td><td>D8370</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;times;nondenaturing gel PAGE Protein Marker</td><td>Beyotime</td><td>P0016</td><td></td></tr><tr><td>Genshare CFAS anyKD PAGE</td><td>Genshare</td><td>JC-PE022</td><td></td></tr><tr><td>Pure Nitrocellulose Blotting Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>T50189</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>SCR</td><td>10014118</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Super low range&amp;nbsp;protein Marker</td><td>Solarbio</td><td>PR1300</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Membranes</td><td>Immobilon-PSQ</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>BeyoECL Star</td><td>Beyotime</td><td>P0018A</td><td></td></tr><tr><td>Commassie Blue Fast staining solution</td><td>Beyotime</td><td>P0017</td><td></td></tr><tr><td>All - automatic chemiluminescence imaging system</td><td>Tanon</td><td>Tanon 5200</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Adobe</td><td>Photoshop CS6</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic agitator</td><td>Shanghai Huxi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a11-positive &#946;-amyloid oligomer preparation and assessment using dot blotting analysis

Β-amiloid (Aβ) kendi kendine toplamları birleştirmek için içsel bir eğilim ile hidrofobik bir peptit var. Çeşitli toplamları arasında Aβ oligomer yaygın olarak Alzheimer hastalığı (Ah) devam eden önde gelen nörotoksin olarak kabul edilir ve reklam patogenezinde önemli olay olarak kabul edilir. Bu nedenle, Aβ oligomer inhibitörleri ateş önlemek ve hastalık değiştirme olarak geliştirilecek potansiyeline sahip reklam tedaviler. Ancak, farklı oluşumu protokollerin Aβ oligomer reaksiyonlar farklı özelliklere sahip yol açabilir. Ayrıca, etkili bir şekilde ekran Aβ1-42 oligomer inhibitörleri için pek çok yöntem değildir. A11 almışlarsa bir alt kümesiyle toksik Aβ1-42 oligomer Anti-paralel β-sayfa yapıları ile tepki verebilir. Bu protokol için biz nasıl bir sentetik Aβ1-42 peptid vitro bir A11-pozitif Aβ1-42 oligomer zengini örnekten hazırlamak için ve dot blot tarafından göreli A11-pozitif Aβ1-42 oligomer örneklerinde miktarda değerlendirmek için tarif analiz A11 ve Aβ1-42-belirli 6E10 antikorlar. Bu iletişim kuralını kullanan, A11-pozitif Aβ1-42 oligomer inhibitörleri de yarı kantitatif deneysel sonuçlar ekranlı.

Aβ1-42 monomer hazırlık sonra bir Aβ1-42 oligomer oluşturmak olup olmadığını araştırmak için TEM analizi kullanıldı. Hiçbir görünür toplamları HFIP çözünmüş Aβ1-42 monomer örnek (Şekil 1A) tespit edildi. Ayrıca, esas olarak küresel toplamları çapında 10-80 nm gözlendi Aβ1-42 örnekte sallayarak, 48 saat sonra Aβ1-42 reaksiyonlar hazırlık (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about A11-positive Î²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis at JoVE.com

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

a11-positive-amyloid-oligomer-preparation-assessment-using-dot

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.8K Görüntüleme.  Ningbo University. Bu iletişim kuralı bir sentetik peptid vitro üzerinden Aβ reaksiyonlar hazırlamak için ve göreli Aβ oligomer miktarda analiz kurutma bir nokta tarafından değerlendirmek için açıklar.

Video: A11-positive β-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42</subHipokampal Dilimleri Sinaptik Plastisite değer düşüklüğü> İndüksiyon

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Nörobilim

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Biyokimya

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Biyoloji

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding immunostaining (specifically for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1), a calcium binding protein expressed by microglia) and tissue processing for electron microscopy (EM). Methoxy-X04 is a fluorescent dye that crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. Injection of the animals with methoxy-X04 prior to sacrifice and brain fixation allows pre-screening and selection of the plaque-containing brain sections for further processing with time-consuming manipulations. This is particularly helpful when studying early AD pathology within specific brain regions or layers that may contain very few plaques, present in only a small fraction of the sections. Post-mortem processing of tissue sections with Congo Red, Thioflavin S, and Thioflavin T (or even with methoxy-X04) can label &#946;-pleated sheets, but requires extensive clearing with ethanol to remove excess dye and these procedures are incompatible with ultrastructural preservation. It would also be inefficient to perform labeling for A&#946; (and other cellular markers such as IBA1) on all brain sections from the regions of interest, only to yield a small fraction containing A&#946; plaques at the right location. Importantly, A&#946; plaques are still visible after tissue processing for EM, allowing for a precise identification of the areas (generally down to a few square millimeters) to examine with the electron microscope.

This article describes a protocol for visualizing amyloid A&#946; plaques in Alzheimer&#39;s disease mouse models using methoxy-X04, which crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. It allows pre-screening of plaque-containing tissue sections prior to immunostaining and processing for electron microscopy.

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Detecting Amyloid-&#946; Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies on accumulation of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain. A&#946; is produced from the proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &#946;-secretase and &#947;-secretase. In pathological circumstances, the increased &#946;-cleavage of APP leads to overproduction of A&#946;, which aggregates into A&#946; plaques. Since A&#946; plaques are a characteristic of AD pathology, detecting the amount of A&#946; is very important in AD research. In this protocol, we introduce the immunofluorescent staining method to visualize A&#946; deposition. The mouse model used in our experiments is 5&#215;FAD, which carries five mutations found in human familial AD. The neuropathological and behavioral deficits of 5xFAD mice are well-documented, which makes it a good animal model to study A&#946; pathology. We will introduce the procedure including transcardial perfusion, cryosectioning, immunofluorescent staining and quantification to detect A&#946; accumulation in 5&#215;FAD mice. With this protocol, researchers can investigate A&#946; pathology in an AD mouse model.

In the neuropathology of Alzheimer's disease, one of the most crucial characteristics is the deposition of amyloid-&#946;. In this protocol, we describe the method of immunofluorescent staining in 5&#215;FAD transgenic mouse to detect amyloid-&#946; accumulation in plaques. The process of perfusion, cryosectioning, staining and quantification will be described in detail.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disease that contributes to 60-70% dementia around the world. One of the hallmarks of AD undoubtedly lies ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması_{1-42 İndüksiyon}

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Detecting Amyloid-β Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

A11-pozitif β-amiloid Oligomer hazırlama ve değerlendirme sistemini kullanarak Dot Blot Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması 1-42 İndüksiyon

İnsan Kortikal Doku Aβ multimerlerin SDS-PAGE/Immunoblot Algılama Antijen-epitop Alma kullanarak homojenatlarında

Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Nöritik plaklar Alzheimer Hastalığı Fare Modeli Algılama

Yarı denatüre Deterjan-Agaroz Jel Elektroforez Amiloid Toplama taraması

β-amiloid-indüklenen anormallikler Fibrin pıhtısı yapısına spektroskopisi ve elektron mikroskobu tarama Analizi

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

Yöntemleri için algılama sitotoksik Amyloids aşağıdaki enfeksiyon pulmoner endotel hücre Pseudomonas aeruginosa tarafından

Detecting Amyloid-β Accumulation via Immunofluorescent Staining in a Mouse Model of Alzheimer's Disease

Beyinden Amiloid Fibril Çekirdeklerinin Biyokimyasal Saflaştırılması ve Proteomik Karakterizasyonu

Β-amiloid Oligomerik hazırlanması_{1-42 İndüksiyon}