Hücre içi patojenlerin mutant kütüphane taraması ve transkripsiyonçalışmaları, konak içinde hayatta kalmak için kullanılan ilgi patojenlerinin genomik ve düzenleyici adaptasyonları hakkındaki anahtar soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniklerin başlıca avantajları, büyük ölçekli araştırma teknikleri olmaları ve hücre içi yaşama adaptasyona objektif bir bakış açısı sağlamalarıdır. Bu tekniklerin etkileri aşı tedavisi için potansiyel hedeflere fikir vererek bu hastalıkla ilişkilendirmek Mycobacterium apse tedavisi doğru uzanır.
Oda sıcaklığında 75 santimetre kare doku kültürü şişelerinde Peptone Maya Glikoz orta 30 mililitre amip Acanthamoeba castellani veya Ac, culturing tarafından başlayın. Bir saat sonra supernatant kaldırmak için 25 mililitrelik pipet kullanın ve yıkama başına karbon veya azot olmadan Ac tampon 10 mililitre ile hücreleri üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tek bir güçlü sallamak ile şişenin altından amip ayırmak ve beş kez 10 taze Ac tampon mil konsantrasyonu başına beş amip için, bir Falcon tüp hücreleri ayarlayın.
Tohum beş kez 10 iyi bir 96-iyi plaka başına dört amip. Yüzen amip tropho-zoites kuyulara uymak için izin vermek için, sallayarak olmadan bir saat boyunca 32 derece santigrat plaka yerleştirin. Bu arada, buz üzerinde bakteri Sıcak, ve kuluçka sonunda her kuyuya çözülmüş bakterilerin beş mikrolitre ekleyin.
32 santigrat derece de 1,5 saat sonra, bir duman kaputunun altında steril bir metal tepsisteril metal tepsi üzerine steril gazlı bez bir yığın üzerine plaka ters koyarak supernatant atın. Her kuyuda her üç kez her kuyuda 200 mikrolitre taze Ac ortamı ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, iki saat boyunca kalan ekstrasellüler mikobakterileri ortadan kaldırmak için, iyi başına amikasin ile takviye taze orta 20 mikrolitre ile co-kültür kuluçka.
Taze Ac ortamda üç yıkar ardından, sadece gösterildiği gibi. Sonra, orta 200 mikrolitre ekleyin, her kuyuya taze amikasin ile takviye, yedi ısı inaktive Escherichia coli bakteri beş kez 10 eklenmesi izledi. 48 saat sonra hücreleri kuyu başına %10 sodyum dodeyl sülfat 10 mikrolitre, 32 santigrat derecede 30 dakika boyunca lyse ile lyse ve %5 koyun kanı içeren Columbia Agar plakalarına 5 mikrolitre lysate yayın.
Her damlaya 25 mikrolitre steril su ekleyerek lysatları daha da seyreltin. Tüm lysates kaplanmış zaman, plastik parafin film ile plakaları mühür ve 37 santigrat derece 3-4 gün boyunca kültürleri kuluçka. Koloniler plakalar üzerinde göründüğünde, kültürleri fotoğraflamak ve bakteri kolonileri en düşük sayıda mevduat tarafından hücre içi büyüme için bozulmuş mutantlar belirlemek.
Hücre içi mikobakteri RNA ekstraksiyonu için, ilk olarak 120 RPM'de 50 mililitrelik tüplerde gliserol ve glikoz ile orta üstel faza gliserol ve glikoz ile takviye 7H9 orta m.apse büyümek. Kültürün sonunda, yıkama başına 10 mililitre Ac tamponu ile bakterileri iki kez yıkayın ve bakteri konsantrasyonu tahmin etmek için O.D.600 ölçün. Sonra, 8.5 kez 10 sekiz mikobakteri için 8.5 kez 10 altı amip taze Ac orta 10 mililitre bir saat kuluçka için 30 derece santigrat ve 80 RPM ekleyin.
Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri hasat ve aynı santrifüj koşulları altında yıkama başına taze Ac tampon 10 mililitre üç kez pelet yıkayın. Sonra herhangi bir ekstrasellüler bakterileri ortadan kaldırmak için amikasin ile desteklenen taze Ac tampon 10 mililitre hücreleri yeniden askıya, ve 30 santigrat derece ve 80 RPM dört saat boyunca hücreleri kuluçka, taze Ac tampon iki yıkar takip. Son yıkamadan sonra, soğuk çözelti üç dört mililitre enfekte amip yeniden askıya, beta merkaptoetanol 280 mikrolitre ile takviye 10 dakika boyunca buz üzerinde amip bozmak için.
Kuluçka sonunda, serbest bırakılan hücre içi bakterileri pelet hücre lizatsan, ve soğuk çözelti üç bir mililitre bakteriyel pelet yeniden askıya. Bu amip RNA veya örnekleri yapmış olabilir proteazlar ile kontaminasyonu önlemek için tüm supernatant kaldırmak önemlidir. Hasat ikinci bir santrifüj ile serbest bakteri, ve ekstraksiyon tampon bir mililitre pelet yeniden askıya.
Sonra 24 saat boyunca negatif 80 santigrat derecede kuluçkaya yat. 500 mikrolitrelik geçiş işaretine kadar zirkonyum boncuk içeren iki milikobakteriyel çözeltiye mikobakteriyel çözeltiyi aktarın ve Tüpleri RNA syn aktivasyonu ve hücre çözünmesini kolaylaştırmak için negatif 80 santigrat derecede 24 saat daha saklayın. Analiz günü, buz üzerinde örnekleri eritin ve 25 saniye boyunca 6000 RPM homojenizasyon iki tur ile hücreleri lyse, 20 saniye için 6000 RPM bir yuvarlak homojenizasyon izledi.
Homojenizasyonun her turu arasında, RNA bozulmasını önlemek için numuneleri buz üzerinde bir dakika soğutun. Homojenizasyon üçüncü tursonra, 20 dakika buz üzerinde örnekleri serin ve her tüp için isoamyl alkol seyreltilmiş kloroform 200 mikrolitre ekleyin. Bir dakika girdap, sonra örnekleri santrifüj ve negatif 20 santigrat derecede 2-3 saatlik kuluçka için sulu faz soğuk izopropanol 0.8 mililitre ekleyin.
Kuluçka sonunda, numuneleri tekrar santrifüj edin ve peletleri 500 mikrolitre soğuk %70 etanolde karıştırmadan yıkayın. Sonra hemen santrifüj ile etanol çıkarın. Bir santrifüj konsantratörü nde pelet kurutmak için supernatant aspire ve DNA / RNA içermeyen su 100 mikrolitre pelet yeniden askıya.
Gösterildiği gibi Mikobakteriyel MRNA ekstraksiyonu, indüklenen ve bastırılmış gen ailelerinin, besin ve mineral kaynağında sınırlı bir ortama veya hipoksik veya asidik bir ortama yanıt vermedeki rollerine göre genleri gruplandırarak değerlendirilmesine olanak sağlar. Oksidatif ve nitrosatif strese karşı direnç, ya da çevresel amip yanıt olarak virülans faktörlerin ekspresyonu. Bu yordamları denerken, toplu iş efektlerini önlemek için kontrollü ve enfekte örneklerin kültür ve RNA yalıtımını aynı anda gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, çift RNA dizilemesi gibi diğer yöntemler konak patojen etkileşimleri hakkında ek soruları cevaplamak için önceden oluşturulabilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra, mikrobiyoloji alanında araştırmacıların amip konak modelinde mikobakteri virülansına doğru önünü açtı. Eğer prosedürde açıklanan adımları takip etmezseniz amip kistler dönüşebilir gibi amip ile çalışan son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.
