Bu yöntem kök hücre ve kanser alanlarında kök hücre heterojenitesi nasıl göründüğü ve hassas kanser hücrelerinde tedavinin nasıl izole edilebildiği gibi temel soruları yanıtlayabilir. Bu çalışmanın en büyük avantajı, hedef alt popülasyonların daha aşağı karakterizasyonu için teknik olarak sağlam tek hücreli gen ekspresyonu analizini vackinozis ile biraraya getirerek birleştirilmesidir. Bu yöntem kanser ve kök hücre heterojenliğini araştırmak için kullanılabilse de, gen astarı ve soy potansiyeli hakkında bilgi verebilir.
Protokolü başlatmak için, RNA/DNA içermeyen bir tezgahta, 390 mikrolitre çekirdeği serbest su, 17 mikrolitre 10%NP-40, 2.8 mikrolitre 10 milimolar dNTP, 10 mikrolitre 0.1 molar DTT ve 5.3 mikrolitre RAsinhibitor'u karıştırarak 96 kuyu için %10 ekstra lysis tamponu hazırlayın. Girdap ve tüp aşağı spin. Daha sonra, 96 kuyulu bir PCR plakanın her kuyuya dört mikrolitre lysis tampon dağıtın ve plakaları yapışkan filmle kapatın.
Alttaki sıvıyı toplamak için plakaları aşağı çevirin. En fazla 24 saat hücre sıralama kadar buz plakaları tutun. FACS makinesi düzgün bir şekilde kurulduktan sonra, 100 mikrolitre leke tamponu yla en az 100 hedef hücreyi yeni bir mikrosantrifüj tüpüne ayırarak hedef popülasyonun yeniden analizini yapın.
FACS sıralanmış örnekleri kaydederek sıralanmış hücreleri analiz eder ve sıralama kapısına son verdiklerinden emin olur. Daha sonra 96 kuyuplakasında ki iyi A1'deki düşüşü ortalayarak tek hücreli plaka sıralamasını ayarlayın. Ortalandığında, boş bir 96 kuyuplakasının kenarındaki tüm kuyularda 50 ila 106 mikrometrelik parçacıkları sıralayın ve tüm kuyuların her kuyunun merkezinde bir hücre olmasını sağlayın.
Yapışkan filmi plakalardan çıkarın. Lin-CD34 artı CD38 eksi hücrelerinden oluşan tek bir hücreyi 96 kuyudan 92'sine ayırın. HER bir hücre için CD45RA, CD49F ve CD90 için immünopopopnotipic profili kaydetmek için FACS sıralama yazılımında indeks sıralamayı etkinleştirin.
PCR amplifikasyonundaki doğrusallık kontrolleri için sırasıyla 10 ve 20 hücreli iki kuyu sıralayın. Wells H1 ve H2 genellikle kullanılır. Hiçbir şablon kontrolleri olarak herhangi bir hücre olmadan iki kuyu tutun, genellikle wells H3 ve H4. Plakaları net yapışkan filmle kapatın ve plakaları bir dakika boyunca 300 kat yerçekiminde döndürün.
Snap kuru buz üzerinde plakaları dondurmak. Sonra eksi 80 santigrat derecede saklayın. İki kat reaksiyon karışımının 632,5 mikrolitresi, 101,2 mikrolitre Taq/SuperscriptIII, 151,8 mikrolitre astar karışımı ve kontrol RNA'sında 0,7 mikrolitre ekleyerek ters transkripsiyon ve spesifik hedef amplifikasyon karışımı yapın.
Çözeltiyi girdap ve tüpün altındaki sıvıyı toplamak için aşağı doğru döndürün. Numuneye eklenmeye hazır olana kadar karışımı buzüzerinde tutun. Sonra, buz üzerinde lysate plakaları eritin.
Doğrusallık ve şablon denetimleri dahil olmak üzere 92 kuyuya daha önce hazırlanmış ters transkripsiyon ve özel hedef amplifikasyon karışımının 8,75 mikrolitresini ekleyin. Kalan dört kuyuya 8,75 mikrolitre ters transkripsiyon kontrol karışımı ekleyin. Daha sonra plakaları açık yapışkan filmle kapatın ve alttaki sıvıyı toplamak için plakaları döndürün.
Preamp programına göre plakayı bir PCR makinesinde çalıştırarak ters transkripsiyon ve belirli hedef amplifikasyonu gerçekleştirin. 96 kuyulu bir plakanın her kuyusuna üç mikrolitre adet azar lama reaktifi boru sulayarak, azar lama yükleme plakasını hazırlayın. Her astarın üç mikrolitresini, tek tek kuyulara, astar yükleme plakasında ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın ve aşağı çevirin. Plakayı döndürdükten sonra, seyreltme plakasını, 8 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu 96 kuyunun tüm kuyularına boşaltarak hazırlayın. Seyreltme plakasına iki mikrolitre güçlendirilmiş numune ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın. 10 saniye boyunca plaka girdap tarafından karıştırın. O zaman tabağı aşağı çevir.
Daha sonra, 352 mikrolitre ana karışımı 35,2 mikrolitre numune yükleme reaktifi ile dikkatlice karıştırarak numune yükleme karışımını hazırlayın. Numune yükleme plakasını, 96 kuyulu bir plakanın her kuyusu için 3,3 mikrolitre yükleme karışımı nı karıştırarak hazırlayın. Seyreltilmiş numuneden 2,7 mikrolitreyi numune yükleme plakasının her kuyuya ekleyin.
Plakayı yapışkan filmle kapatın ve aşağı çevirin. Yeni bir 96'ya 96 mikroakışkan çip çıkar. Hareket ettirilebildiklerinden emin olmak için, girişleri kapağı olan bir şırıngayla dürterek hazırlayın.
Talaşı 45 dereceye yatırıp valfaşağı yaslarken şırıngaların tüm hacmini her vanaya ekleyin. Çipi IFC kumandasıyla başedin. Her bir titre girişi, tsay yükleme plakasındaki kuyuların her birinden 4,25 mikrolitre ile yükleyin ve kabarcıklardan kaçının.
Kabarcıklar kuyuda görünürse, bir pipet ucu ile kaldırın. Her numune girişine numune yükleme plakasındaki kuyuların her birinden 4,25 mikrolitre yüklemeye devam edin, kabarcıklardan kaçının ve kabarcıklar bunları pipet ucuyla çıkarırken görünürse. Çipi Entegre Fluidics Devre denetleyicisi veya IFC denetleyicisi ile yükleyin.
Çipin eşit göründüğünü ve tüm odaların dolu olup olmadığını kontrol edin. Bantla dokunarak talaşın yüzeyindeki tozu çıkarın. Son olarak, çokkatlı mikroakışkan gen ekspresyonu platformunda çip çalıştırın.
Başarılı bir çalıştırmanın ısı haritası, yaklaşık yedi ila 25 TT'lik güçlü bir sinyalle örnekler arasında eşit olarak yayılan ifadeyi görüntüler. Kontrol RNA çivili bu amplifikasyon eğrisi tüm kuyular yaklaşık 10 CT çok az hiçbir varyasyon ile net bir ifade olduğunu doğrular, ön amplifikasyon ve qPCR reaksiyonları tüm hücreler için başarılı olduğunu doğrulayan. Boyut küçültme kullanarak hücre grupları arasındaki benzerlikleri görselleştiren İlke Bileşen Analizi veya PCA, moleküler olarak farklı hücre kümelerini birbirinden ayırmak için yararlı olabilir.
Farklı moleküler kümelerden gelen hücrelerin immünopfenotipini belirlemek için, index FCS dosyasını FlowJo'ya yükleyin. Komut dosyası düzenleyicisini açın ve dizin komut dosyasını yapıştırın, Çalıştır'a basın. Her hücre ayrı bir geçitte olacak.
Her hücreyi düzen düzenleyicisine ekleyin ve dosya sample_complete_data.xls bulunan SCXV'nin moleküler olarak tanımlanmış grubuna göre renklendirin. FACS çizimleri, kümeler arasında ayrım yapmak ve işlevsel analiz için onları izole etmek için kullanılabilecek hematopoetik kök hücre belirteçleri CD90 ve CD45RA için hücre yüzeyi işaretleyici ifadesini gösterir. Bu prosedürü takiben, yeni keşfedilen alt popülasyonların RNA dizilimi veya in vitro ve in vivo deneyleri gibi diğer teknikler, moleküler mekanizmanın bu heterojenliğe neden olduğu ve alt popülasyonun işlevsel olarak nasıl farklılık gösterdiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Bu strateji, araştırmacıların sadece normal ve malign hematopoyoniste heterojenliği araştırmakla kalmadı, aynı zamanda keşfedilen alt popülasyonları daha fazla incelemek için prospektif olarak izole etmek için de kullanılabileceğini ortaya çıkar.
