Name: detection of copy number alterations using single cell sequencing
Uploaded: 2017-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Biz bu yazının yorumları için Stuart Levine teşekkür ederiz. Bu çalışma Sağlık Hibe GM056800 National Institutes ve Angelika Amon için Kathy ve Curt Mermer Kanser Araştırma Fonu tarafından ve Koch Enstitüsü Destek Hibe P30-CA14051 tarafından kısmen desteklenmiştir. Angelika Amon da Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Biyomedikal Araştırma Glenn Vakfı&#39;nın bir araştırmacı. KAK NIGMS Eğitim Hibe T32GM007753 tarafından desteklenmektedir.

1. Tek Hücreleri İzolasyon <ol><li> microaspirator hazırlayın <ol><li> aspiratör tüp montajı net plastik ucunu çıkarın ve 3/16 &quot;iç çaplı bir 1 metrelik PVC boru bir ucunu dar ucunu. </li><li> 3/6 &quot;iç çapı 1 metrelik PVC boru diğer ucunu bir 0.2 mikron şırınga filtresi çıkışını takın. </li><li> 5/16 &quot;iç çapa sahip bir 6 inç uzunluğunda PVC boru donanımının bir ucuna 0.2 mikron bir şırınga filtreden girişini yerleştirin. </li><li> İsteğe bağlı: yarısında 5/16 &quot;iç çapı 6 inç uzunluğunda PVC boru kesin ve iki yarısı arasında bir in-line su tuzağı yerleştirin. </li><li> 1 ml mezuniyet 5 ml plastik serolojik pipet kırmak ve 5/16 &quot;iç çapı ile PVC boru açık ucunu kırık ucunu. </li><li> Bir aspiratör borusu düzeneğinin esnek ucunda (şeffaf plastik uç içine 5 ml plastik serolojik pipet çıkışını takın) Çıkarmıştı. </li><li> depolama için, steril bir plastik tüp ile aspiratör boru montaj kırmızı ağızlık kapsamaktadır. </li><li> Bir Bunsen beki alev yakınında tüp orta getiren ve tüpün iki ucundaki gerilim uygulayarak 10-30 mikron iç çapı bir cam kılcal tüp dışarı çizin. iki potansiyel aspiratör iğneler oluşturmak için ortada çizilen tüp kırın. sadece bazı tüpler tek hücre toplamak için uygun bir iç çapı ile sona erecek birkaç tüpleri ile bu adımı yineleyin. </li><li> depolama için, bir 15 cm&#39;lik Petri kabındaki modelleme kil iki şeritler yerleştirin ve şeritler arasında aspiratör iğne sabitleyin. </li></ol></li><li> hücreleri seç <ol><li> Hücre tipine ve deney için uygun tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Örneğin, bu gibi uygun bir ortam ihtiva eden bir konik tüp tripsinizasyon ve transfer hücreler tarafından insan fibroblast hücre hatları hasat hücreler olarak yapışmış olan hücrelerin hazırlanması için. </li><li> Önce, sırasında ya dafter tek bir hücre süspansiyonu (o tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için ne kadar sürer bağlı olarak), kurulum tüm genom amplifikasyonu için kaput hazırlanıyor. <ol><li> % 10 çamaşır suyu ile kaput, pipet kutuları ve pipet uçları yüzeyini aşağı Sprey ve bir kağıt havlu ile silin. % 70 etanol ile bu adımı yineleyin. </li><li> 96 oyuklu bir PCR plaka, tek tek oyuklara tüm genom amplifikasyonu (WGA) kit su 8 uL ekleyin, her bir hücre için bir de sekanslanacak olan. Buz üzerinde 96 oyuklu bir doku kültür plakasının ve bir yerden bir kapakla 96 gözlü PCR plakası kapatılır. </li></ol></li><li> 15 cm&#39;lik bir Petri kabı içinde 10 ml ortamı veya fosfat tamponlu tuz (PBS) 1000 hücreleri ekleyin ve kabına yapışan hücreler önlemek için buz üzerinde çanak yerleştirin. </li><li> 10X objektif bir ışık mikroskobu buz kapak ile Petri kabındaki hücrelere ve 96 PCR plaka getirin. </li><li> yavaşça th çizilmiş ucunu hafifçe vurarak aspiratör iğne açılmasını artırmaksert bir yüzeye e aspiratör iğne ucu kırılır şekilde. microaspirator açık ucunu aspiratör iğne geniş ucunu takın. </li><li> mikroskop sahnede hücreleri içeren Petri kabı yerleştirin. Ağızda aspiratör kırmızı ağızlık yerleştirin. hücreleri içeren Petri kabı taşımak için aspiratör iğne ve diğer yandan taşımak için tek bir elinizi kullanın. Tek hücreleri tanımlamak sekanslanacak olan. </li><li> ağız emme kullanarak, ortam veya PBS ~ 1-2 mcL ile birlikte aspiratör iğne içine tek bir hücreyi çizin. 96 gözlü PCR plaka tek bir kuyu içine su 8 uL hücreyi aktarın. hücreyi aktarırken kabarcıkları tanıtan kaçının. </li><li> Hücrelerin istediğiniz sayı izole edilene kadar adımı tekrarlayın 1.2.7. buz üzerinde PCR plaka tutun ve toplama hücreleri arasındaki kapak ile örtülü. Hücreleri almış kuyu işaretleyin. <ol><li> tek hücre toplama ederken, bütün g 10X tek hücre parçalama ve parçalanma tampon çözülmeenome amplifikasyon kiti. hücrelerin istenilen sayıda toplama sonra, tüm genom amplifikasyonu hemen geçin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Tüm Genom Büyütme <ol><li> , Tüm genom amplifikasyonu sırasında kirlenmesini önlemek bir doku kültürü kaput içinde tüm reaktifler ekleyin filtreleri ile pipet uçları kullanın ve kuyularda arasında pipet değiştirmek için. </li><li> tüm genom amplifikasyonu (WGA) kiti bir çalışma parçalama ve parçalanma tampon çözeltisi hazırlayın. En fazla 32 hücrelerinin her biri için, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, proteinaz K çözeltisi 10x tek hücre lisis ve parçalanma tamponu, 2 uL 32 uL birleştirir. çözümler karıştırmak için tüp Vortex. </li><li> her oyuğa lizis ve parçalanma tampon çözeltisi çalışma 1 mcL ekleyin ve yukarı pipet ve aşağı karıştırın. </li><li> plaka Kapak ve bir plastik filmle tüm kuyuları mühür. Kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> foll olarak Termal döngüakımları: 50 ° C, 1 saat ve 99 ° C, 4 dakika. </li><li> buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> tüm genom amplifikasyon kiti çalışan bir kütüphane hazırlık tampon çözeltisi hazırlayın. her bir hücre için, 1 x tek hücre kütüphanesi hazırlanması tamponu, 2 ul ve mikrosantrifüj tüpü içinde bir kütüphane sabitleme çözeltisi 1 uL birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüpü içinde birçok hücreler için çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> plastik filmi çıkarın ve her bir kütüphane hazırlanması tampon çözeltisi çalışma 3 uL ekleyin. karıştırmak için iyi yukarı ve aşağı içeriğini pipetle. plastik film değiştirin. Not: Wells filmde delikler başlayana dek plastik film tüm genom amplifikasyonu süreci boyunca yeniden kullanılabilir. Bu durumda, yeni bir plastik film geçin. </li><li> Kısaca, bir mini plaka spinner plaka santrifüj 2 dakika boyunca 95 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> buz ve kısaca plaka soğutunmini plaka spinner plaka santrifüj. </li><li> Plastik filmi çıkarın her kuyuya 1 ul kütüphane hazırlık enzim ekleyin ve yukarı iyi içeriğini pipet ve aşağı karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta kütüphane hazırlık enzim tutun. plastik film değiştirin. </li><li> 16 ° C, 20 dakika, 24 ° C, 20 dakika, 37 ° C, 20 dakika, 75 ° C, 5 dakika, 4 ° C &#39;de sabit: Kısaca aşağıdaki mini plakası döndürücü ve termal döngüsü içinde plaka santrifüj. </li><li> buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. </li><li> tüm genom amplifikasyon kiti bir çalışma amplifikasyon karışımı hazırlayın. Her hücre için, 48.5 ul su, 7.5 ul 10x büyütme ana karışımı ve bir mikrosantrifüj tüp içinde 5 uL WGA DNA polimeraz birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüp içinde birkaç hücreler için çalışma karışımı hazırlayın. buz üzerinde çalışan karışımı tutun. </li><li> Plastik filmi çıkarın amplifikasyon karışımı çalışan 61 mcLde yukarı ve aşağı her sıra ve pipet içeriğine karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta çalışan amplifikasyon karışımı tutun. plastik film değiştirin. </li><li> 95 ° C, 3 dakika, 94 ° C&#39;de 25 döngü, 30 saniye 65 ° C, 5 dak, 4 ° C &#39;de sabit: Kısaca şu şekilde mini plaka spinner plaka ve termal döngüsü santrifüj. </li><li> 3. adımda kullanılmak üzere, 20 ° C - ayrı bir mikrosantrifüj tüpü ve saklamak için, her numune devri 60 uL. </li><li> Her numune (örnek 15 uL, yani 3 uL 6x DNA yükleme boyası) geri kalan hacim DNA yükleme boyası ekleyin ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde Her reaksiyondan 5 uL çalıştırın. NOT: başarıyla 250 ila 1,000 bp bir smear olarak görünür güçlendirilmiş hücreler. bir karalama göstermek veya sadece bir soluk smear görünmüyor numuneler yararlı sıralama verilerini elde etmek olası değildir. </li></ol> 3. Sıralama <ol><li> paramanyetik boncuklar ile örnekleri arındırın. <ol><li> ThaBuz üzerinde ağırlık DNA örnekleri. Çözelti homojen olması ve en az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe boncuk Vortex para-manyetik boncuk kadar. </li><li> Temiz bir mikrosantrifüj tüpü içine, her bir DNA numunesi 20 uL aktarın. Numunenin geri kalan kısmı, -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Her DNA örneği ve karıştırmak için vorteks paramanyetik boncuk 30 mcL (1.5x) ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Aşama 3.4 kullanılmak için oda sıcaklığında boncuk stok solüsyonu bırakın. </li><li> 2 dakika süreyle manyetik tüp şerit üzerinde tüpler yerleştirin veya boncuk bir pelet oluşturur ve kadar süpernatant açıktır. </li><li> P200 pipet kullanarak, boncuk bozmadan mümkün olduğunca süpernatant kadar kaldırın. </li><li> DNA boncuk karışımı% 80 etanol içinde 180 uL ekleyin. boruları etanol çözeltisi ile boncuk &quot;durulama&quot; mıknatıs göre birkaç kez çevirin. </li><li> P200 pipet kullanarak, çekmenin, aslında etanol yıkama kadar kaldırınboncuk bozmadan ble. </li><li> 3.1.6 ve 3.1.7 tekrarlayın. </li><li> Hava yaklaşık olarak 10 dakika ya da daha fazla etanol görünene kadar boncuk kurutun. boncuklar kırık görünür bir sonraki adıma geçin ya da tüpün duvarı düşmek. </li><li> manyetik şerit örnekleri çıkarın. boncuklardan DNA elüte boncuk tekrar süspansiyon örnekleri girdaba 10 mM Tris pH 8.0, 40 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Kısaca tüpün altındaki sıvı toplama ve en az iki dakika için bir manyetik şerit üzerinde boru tüpleri örnekleri santrifüj. boncuk bozmadan temiz mikrosantrifüj tüpler içine eluent aktarın. </li></ol></li><li> örnek normalleştirme <ol><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, her bir numune konsantrasyonunu belirlemek. konsantrasyonları 10 ile 30 ng / ml aralığında olmalıdır. </li><li> 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak 0.2 ng / ml, her örnek seyreltilir. Aşağıdaki adımlar asgari i gerektirirBu seyreltme 5 uL Temel giriş. </li></ol></li><li> Kütüphane hazırlanması <ol><li> Kütüphane hazırlık seti 13 yönergeleri izleyerek sıralama kütüphaneleri hazırlayın. </li></ol></li><li> nihai temizleme <ol><li> Adım 3.1 göre örnekleri temizleyin. 50 bp, 75 bp, ya da 150 bp okuma uzunlukları sırasıyla 1.5x, 1x veya 0.6x hacmini örnek boncuk oranını kullanın. 10 mM Tris pH 8.0 15 ul ile elüte. </li><li> Kütüphanede 14 boyutu dağılımını kontrol etmek için bir parçası analizörü örnekleri çalıştırın. boyut dağılımı eşit 150 900 bp yayılmalıdır. </li></ol></li><li> qPCR kullanarak örnekleri sayısal olarak <ol><li> Kütüphane Niceleme Kiti kullanılarak, kit talimatlarına 15&#39;e göre bir qPCR reaksiyon ayarlayın. Pozitif standartları (kit DNA standartları) ve negatif standartları (su veya başka boş çözelti) eklemek için bir sütun boş bırakın. </li><li> fol olarak Termal döngüdüşükler: 95 ° C, 5 dakika (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ile 95 ° C, 30 saniye (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ve 2.5, 60 ° C, 45 saniye (rampa 35 döngü ° C / sn). </li></ol></li><li> havuzu <ol><li> akış hücresi üzerinde birçok şerit ihtiyaç vardır nasıl belirleyin ve hat başına bir grup ile, gruplar halinde örnekleri bölün. </li><li> Numunelerin her bir grup için, aşama 3.5.2 arasında qPCR verilere dayanarak düşük konsantrasyon ile örnek seçmek ve 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak bu konsantrasyona kadar bu gruptaki tüm örnekleri normalleştirmek. </li><li> birlikte, her grup örnekleri havuz. </li></ol></li><li> Ardışık <ol><li> Standart prosedürler 16 aşağıdaki nesil dizileme makinede yük havuzları. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi NOT: Unix tabanlı ortamda bu bölümde programları ve komut dosyalarını çalıştırmak için gereklidir. onların in aşağıdaki protokolde belirtilen yazılımı yükleyin<html> enstalasyonda kılavuzları. Tüm komut https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/ bulunabilir. <ol><li> FASTX-Toolkit sürüm 0.0.13 17&#39;den fastx_trimmer kullanarak 40-nt okur Trim. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq </li><li> Varsayılan seçenekleri 18 ile BWA sürüm 0.6.1 kullanarak uygun referans genomu (fare için MM9, insana hg19) okur hizalayın. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq&gt; example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq&gt; example.sam </li><li> Daha sonra sıralamak ve endeks elde edilen BAM dosya SAMTools sürümü 0.1.19 19 kullanılarak, chrM ve rastgele kromozomlarına hizalamalarını çıkarın. grep -v -w chrM example.sam | grep -v rasgele&gt; example.filtered.sam | Samtools -uSh example.filtered.sam görmek samtools sıralama - example.filtered samtools endeksi example.filtered.bam </li><li> CNVs tespit HMMcopy başlat= &quot;Xref&quot;&gt; 20 <ol><li> genomu için GC yüzdesi referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde gcCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için &quot;500000 -w&quot; seçeneğini kullanın. Adım 4.2 kullanılan Fasta referans dosyası aynı sürümünü kullanın, ancak emin chrM yapmak ve rastgele kromozomlar Fasta dosyadan kaldırılır. gcCounter -w 500000 mm9.fa&gt; mm9_gc.wig </li><li> mappability için kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde generateMap.pl kullanın. uzunluğu okumak belirtmek için &quot;40 -w&quot; seçeneğini kullanın. Adım 4.4.1 kullanılan aynı Fasta referans dosyasını kullanın. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig </li><li> genomu için bir mappability referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde mapCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için &quot;500000 -w&quot; seçeneğini kullanın. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig&gt; mm9_map.wig </li><li> Her BAM dosyası için bir kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde readCounter kullanın. readCounter 500000 example.filtered.bam&gt; input.wig -w </li&gt; <li> R komut dosyalarında referans dosyalarına yollarını değiştirmek (run_hmmcopy.mm9.r veya run_hmmcopy.hg19.r), 4.4.1 (örneğin, mm9_gc.wig) ve 4.4.3 (örneğin, mm9_map yukarıda oluşturulan dosyaları kullanabilirsiniz. sırasıyla, GC yüzdesi referans dosyası ve mappability referans dosyasına bakın değişkenler gfile ve MFILE için peruk). Sonra sağlanan R komut &quot;run_hmmcopy.mm9.r&quot; ya da &quot;run_hmmcopy.hg19.r&quot; çalıştırın. R CMD TOPLU run_hmmcopy.mm9.r veya R CMD TOPLU run_hmmcopy.hg19.r </li><li> BAM dosyaları bir dizi toplu işlem için, (VS) segmentleri arama ve değişkenlik puanları hesaplamak için paketinde sağlanan komut &quot;HMMpipe.pl&quot; tek bir klasörde BAM dosyaları koymak ve çalıştırın. biçimi uygulayın: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9 </li></ol></li><li> CNVs 21 tespit etmek için DNAcopy çalıştırın. <ol><li> benzersiz her BAM dosyasından okur eşlenen ayıklamak için SAMtools sürüm 0.1.19 kullanın. samtools görüntülemek -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i &quot;^ @ | XT A: U&quot; | samtools -Shu görünümü -&gt; example.mapped.bam </li><li> BAM PCR çiftleri 22 dosya işaretlemek için Picard sürüm 1.94 yılında MarkDuplicates kullanın. MarkDuplicates.jar GİRİŞİ jar java = example.mapped.bam ÇIKIŞ = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true </li><li> Sürüm 2.17.0 eşlenen sayısı için bedtools olarak coveragebed kullanımı sağlanmıştır YATAK dosyası &quot;mm9.500k.dynamic.win.bed&quot; ya da &quot;hg19.500k.dynamic.win.bed&quot; 23 önceden tanımlanmış dinamik 500kb eşlenebilir pencerelerinin her okur . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sıralama -k1,1 -k2,2n&gt; example.nondup.counts </li><li> sağlanan GC içeriği referans dosyası &quot;mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt&quot; ya da &quot;hg19.500k.dynamic.win.fa dayalı okuma sayar normalleştirmek için sağlanan Perl betiği&quot; normalizeGC.pl &quot;kullanın. gc.txt &quot;. perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts&gt; example.bam.norm.counts </li><li> segmentleri aramak için sağlanan R komut &quot;dnacopy.r&quot; kullanın. R CMD TOPLU dnacopy.r </li></ol></li><li> CNVs tespit <ol><li> 4.4.6 hesaplanan VS 0.26 aştığı için hücreleri hariç. </li><li> Hangi medyan günlük 2 oranı fazla 0.4 (farazi kazanç) ya da daha az -0.35 (varsayılan kayıp) sadece bu içerecek şekilde 4.4.6 HMMcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. </li><li> segmenti ortalama 0.6 daha fazla 1.32 veya daha az sadece bu hangi eklemek 4.5.5 yılında DNAcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. </li><li> Sadece HMMcopy ve DNAcopy hem farazi kazanç veya varsayılan kaybı tespit bölgelerde CNVs çağırarak, 4.6.2 ve 4.6.3 segmentleri örtüşüyor. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kahlem, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+Level+Alterations+Reflect+Gene+Dosage+Effects+Across+Multiple+Tissues+in+a+Mouse+Model+of+Down+Syndrome.">Transcript Level Alterations Reflect Gene Dosage Effects Across Multiple Tissues in a Mouse Model of Down Syndrome.</a> Genome Res. 14 (7), 1258-1267 (2004).</li><li>Torres, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Aneuploidy+on+Cellular+Physiology+and+Cell+Division+in+Haploid+Yeast.">Effects of Aneuploidy on Cellular Physiology and Cell Division in Haploid Yeast.</a> Science. 317 (5840), 916-924 (2007).</li><li>Itsara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Analysis+of+Large+Copy+Number+Variants+and+Hotspots+of+Human+Genetic+Disease.">Population Analysis of Large Copy Number Variants and Hotspots of Human Genetic Disease.</a> Am. J. Human Gen. 84 (2), 148-161 (2009).</li><li>Sudmant, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+diversity,+population+stratification,+and+selection+of+human+copy-number+variation.">Global diversity, population stratification, and selection of human copy-number variation.</a> Science. 349 (6253), aab3761 (2015).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+tumor+progression+from+genomic+heterogeneity.">Inferring tumor progression from genomic heterogeneity.</a> Genome Res. 20 (1), 68-80 (2010).</li><li>Torres, L., Ribeiro, F. R., Pandis, N., Andersen, J. A., Heim, S., Teixeira, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+genomic+heterogeneity+in+breast+cancer+with+clonal+divergence+between+primary+carcinomas+and+lymph+node+metastases.">Intratumor genomic heterogeneity in breast cancer with clonal divergence between primary carcinomas and lymph node metastases.</a> Breast cancer res and treat. 102 (2), 143-155 (2007).</li><li>Yates, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nat. Med. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Forsberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+somatic+structural+changes+in+the+nuclear+genome+of+human+blood+cells.">Age-related somatic structural changes in the nuclear genome of human blood cells.</a> Am. J. Human Gen. 90 (2), 217-228 (2012).</li><li>Laurie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+from+birth+to+old+age+and+its+relationship+to+cancer.">Detectable clonal mosaicism from birth to old age and its relationship to cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 642-650 (2012).</li><li>Jacobs, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detectable+clonal+mosaicism+and+its+relationship+to+aging+and+cancer.">Detectable clonal mosaicism and its relationship to aging and cancer.</a> Nat. Gen. 44 (6), 651-658 (2012).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Whittaker, C. A., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+sequencing+reveals+low+levels+of+aneuploidy+across+mammalian+tissues.">Single cell sequencing reveals low levels of aneuploidy across mammalian tissues.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (37), 13409-13414 (2014).</li><li>Knouse, K. A., Wu, J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+megabase-scale+somatic+copy+number+variation+using+single-cell+sequencing.">Assessment of megabase-scale somatic copy number variation using single-cell sequencing.</a> Genome Res. 26 (3), 376-384 (2016).</li><li>. KAPA Library Quantification Kit Available from: <a target="_blank" href="https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/">https://www.kapabiosystems.com/product-applications/products/next-generation-sequencing-2/library-quantification/</a> (2016)</li><li>. DNAcopy Available from: <a target="_blank" href="https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html">https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DNAcopy.html</a> (2016)</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat. Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).</li><li>Navin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+evolution+inferred+by+single-cell+sequencing.">Tumour evolution inferred by single-cell sequencing.</a> Nature. 472 (7341), 90-94 (2011).</li><li>Szulwach, K. E., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Genetic+Analysis+Using+Automated+Microfluidics+to+Resolve+Somatic+Mosaicism.">Single-Cell Genetic Analysis Using Automated Microfluidics to Resolve Somatic Mosaicism.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135007 (2015).</li><li>Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Detection+of+Single-Nucleotide+and+Copy-Number+Variations+of+a+Single+Human+Cell.">Genome-Wide Detection of Single-Nucleotide and Copy-Number Variations of a Single Human Cell.</a> Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+in+breast+cancer+revealed+by+single+nucleus+genome+sequencing.">Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing.</a> Nature. 512 (7513), 155-160 (2014).</li><li>Zhang, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromothripsis+from+DNA+damage+in+micronuclei.">Chromothripsis from DNA damage in micronuclei.</a> Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).</li><li>Macaulay, I. C., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Genomics:+Advances+and+Future+Perspectives.">Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives.</a> PLoS Genetics. 10 (1), e1004126 (2014).</li><li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome+sequencing:+current+state+of+the+science.">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nat. Rev. Gen. , 1-14 (2016).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Geleneksel olarak, bu tür FISH ve SKY olarak sitolojik yöntemler gerekli tek hücre düzeyinde CNVs ve anöploidi belirlenmesi. Şimdi, tek bir hücre sıralama bu tür sorulara için alternatif bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır. bu genom ve yüksek çözünürlüklü hem olduğu gibi tek hücreli sıralama FISH ve SKY üzerinde avantajlara sahiptir. Uygun kalite kontrol yöntemleri uygulandığında bu FISH ve SKY doğasında melezleme ve yayma eserler duyarlı değildir Dahası, tek hücre sıralama daha güvenilir bir CNVs değerlendirilmesini ve anöploidi sağlayabilir. Ancak, tek bir hücre sıralama son uygulamaların birçok yöntem kapsamlı duyarlılık değerlendirilmesi ve özgünlüğü ile doğrulanmış ve analizler edilmemiştir. Gerçekten de, diğer çalışmalarda kullanılan analitik yaklaşımlar bazı yanlış pozitif KNV 12 çağrıları yüksek frekanslarda (&gt;% 50) ile ilişkilidir. biz tarif yaklaşım titizlikle kn hücreleri kullanılarak test edilmiştirKNV tespiti 12 duyarlılık ve özgüllüğünü doğru ve yanlış keşif oranlarını belirlemek ve optimize etmek için kendi CNV yükü. 10 Mb aşan kalite kontrol ve bu protokolü açıklanan analitik yaklaşımlar, 5 Mb kazançlarının yaklaşık% 20, 5 Mb kayıplarının% 75&#39;i ve tüm CNVs kullanılarak tespit edilebilir. Tek hücre sıralama yanlış keşif oranının belirlenmesinde zor olsa da, biz% 25 daha az olduğu tahmin var. Bu protokol, çeşitli kaynaklardan gelen hücrelere uygulanabilir, komut KNV algılama çözünürlüğünü ayarlamak için değiştirilebilir, ve protokol genomik değişiklikler diğer türleri tanımlamak için adapte edilebilir. Orada tek hücre içine taze dokuları ayrışan araçlarının çeşitli ve birçok yayın cilt 24 ve beyin 25 gibi belirli dokular için optimize prosedürleri açıklanmaktadır. o fo verdiğinden Biz Mikroaspirasyon tarafından tek hücrelerin izole tercih<html> Her bir hücrenin R görsel değerlendirme sekanslanacak olan. Bununla birlikte, floresans ile aktive edilen hücre sıralama (FACS) 26 ve mikroakışkan cihazlar 27 tarafından tek hücrelerin izole edilmesi de mümkündür. Tek hücre izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu elle gerçekleştirilir, izole etmek ve tek bir seferde kırk hücrelere kadar yükseltmek için uygun olur. Yüksek kaliteli tek hücre sıralama verileri elde etmek için, tek bir hücre genomlarının amplifikasyonu düzgün ve tam olması çok önemlidir. Bu liziz ve amplifikasyon verimi hem de izole edilmiş tek hücrelerin kalitesi dizi verinin kalitesi üzerinde önemli bir etkisi olduğunu belirledik. Bu nedenle, hücreleri hücreler izole hemen sonra başlamalı hemen önce izolasyonu ve tüm genom amplifikasyonu için kendi doğal ortamından hasat edilmelidir. adım 2.3-2.6 de tarif edildiği gibi, ayrıca, parçalama ve parçalanma adımı tam olarak izlenmelidir. &quot;&gt; Algoritmalar duyarlılık ve özgüllük 12 üzerindeki etkilerinin karşıt, KNV algılama çözünürlüğünü değiştirmek için ayarlanabilir. Tetraploidi 11 ayar tam kromozom anöploidi tespit eşikleri ayarlamak da mümkündür. Ancak, biz bulmak tüm genom amplifikasyonu esnasında katılan gürültü küçük varyantları 12 tespitini zorlaştırmaktadır olarak yaklaşım CNVs 5&#39;inden Mb tespit edebilir. tüm genom amplifikasyonu yaklaşımlar ileri geliştirmeler, sonuçta tek bir hücre sıralama kullanılarak KNV algılama çözünürlüğünü arttırmak gerekir. Tek hücre sıralaması sadece kopya sayısı değişikliklerinin araştırılması hem de tek nükleotid değişimleri 28, 29 ve bir yapısal versiyonunun 30 sağlar. tek bir hücre izolasyonu için protokol bu que cevap uygulanabilirparagrafındaki. Bununla birlikte, tüm genom amplifikasyonu yönteminin seçimi, belirli uygulamaya bağlıdır. Polimeraz zincir reaksiyonu dayanan bu protokol, tarif edilen yöntem, bu amplifikasyon önyargı 32 daha düşük seviyeleri ile ilişkili olduğu için kopya sayısı değişiklikleri tespit etmek için uygundur. Bu tür tek nükleotid polimorfizm genomik değişiklikler, diğer türde araştırmak için, tüm genom amplifikasyonu için diğer yöntemler 31, 32 daha uygun olduğuna inanılmaktadır.

DNA kopya sayısı değişiklikler birkaç baz çifti büyüklükleri değişebilir tüm kromozomlar (anöploidi) ila (CNVs) (kopya sayısı varyantları). Genomun büyük bölgeleri etkileyen kopya sayısı değişiklikleri kadar genler 1, 2 binlerce ifadesini değiştirerek önemli fenotipik sonuçlar doğurabilir. Toplu dizileme veya mikroarray bazlı yöntemler, 3, 4 ile tespit edilebilen bir nüfusun bütün hücrelerde bulunur CNVs. Ancak, popülasyonlar da nüfus ya da hatta tek hücrelerinin bir alt kümesi mevcut CNVs ile, genetik olarak heterojen olabilir. Genetik heterojenite bilinmiyor sonucu 5, 6, 7, 8, 9, aynı zamanda normal dokularda da tümör gelişimini sürücü, kanser yaygındır ve <sup&gt; 10. Geleneksel olarak, genetik heterojenite sitolojik yaklaşımlar veya dökme sıralama yoluyla değerlendirildi. Böyle situ hibridizasyon (FISH), kromozom yayılır ve spektral karyotipleme (SKY) floresan olarak sitoloji yaklaşımlar, tek tek hücrelerin içinde bulunan tanımlama değişikliklerin yarar var ama melezleme ve 11 yayılan eserler nedeniyle yüksek hata oranlarına sahiptir. Bu yaklaşımlar da kendi çözünürlük sadece açığa kopya sayısı sınırlıdır birkaç megabases kapsayan değişmektedir. Ardışık veya toplu DNA mikroarray&#39;ler, doğruluk ve çözünürlük olsa daha yüksek, daha az duyarlıdır. popülasyon bazlı yaklaşımlar ile genetik heterojenite tespit etmek için, varyantlar popülasyonunda hücre önemli bir fraksiyonunda mevcut olmalıdır. tek hücre genomik DNA&#39;yı büyütmek için yöntemler ortaya mümkün tek hücre genomunu dizilemek için yaptı. Tek hücre sequencing uygun kalite kontrol yöntemleri uygulanmaktadır yüksek çözünürlük, yüksek hassasiyet ve, yüksek doğruluk 12 avantajlara sahiptir. Burada, tek bir hücre içinde megabaz ölçekli kopya sayısı değişimleri tespit etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz, bağlayıcı adaptörü PCR kullanılarak genomik DNA yükseltmek nesil dizileme için kütüphaneler hazırlamak ve kopya numarası gizli Markov modeli ve dairesel ikili segmentasyon hem varyantları tespit, Mikroaspirasyon tarafından tek hücreleri izole.

<table><tbody><tr><td>Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>PVC tubing (ID 3/16&quot;, OD 5/16&quot;, ~1 foot)</td><td>VWR</td><td>89068-500</td><td></td></tr><tr><td>PVC tubing (ID 5/16&quot;, OD 7/16&quot;, ~6 inches)</td><td>VWR</td><td>89068-508</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 &amp;micro;m)</td><td>VWR</td><td>28144-040</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette (5 mL)</td><td>BioExpress</td><td>P-2837-5</td><td>Any plastic 5 mL pipette should suffice</td></tr><tr><td>In-Line Water Trap for Oxygen Use</td><td>Amazon.com</td><td>700220210813</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)</td><td>VWR</td><td>34502-99</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>VWR</td><td>470156-850</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (150 mm diameter)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td>Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells</td></tr><tr><td>Hard-Shell&amp;nbsp;Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR&amp;nbsp;Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSS9601</td><td>Any 96-well PCR plate should suffice</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>62406-081</td><td>Any 96-well tissue culture plate should suffice</td></tr><tr><td>GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit</td><td>Sigma</td><td>WGA4</td><td></td></tr><tr><td>Microseal &#039;A&#039; Film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>Mini plate spinner</td><td>Thomas Scientific</td><td>1225Z37</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096&amp;nbsp;</td><td>Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate</td></tr><tr><td>Agencourt Ampure Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Any similar magnetic tube strip should suffice</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1012</td><td></td></tr><tr><td>Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4845&amp;nbsp;</td><td>This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.</td></tr></tbody></table>

detection of copy number alterations using single cell sequencing

Tek hücre çözünürlükte genomik değişim tespiti, normal dokularda, kanser ve mikrobik popülasyonların genetik heterojenliği ve evrim karakterize edilmesi için önemlidir. Genetik heterojenite değerlendirmek için geleneksel yöntemler düşük çözünürlük, düşük hassasiyet, ve / veya düşük özgüllük ile sınırlı kalmıştır. Tek hücre sıralama uygun analiz yüksek çözünürlük, yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük ile genetik heterojenite tespit etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada tek hücrelerin izolasyonu, tüm genom amplifikasyonu, sekanslama ve analiz için bir protokol sağlar. Bizim yaklaşım tek hücrelerde megabase ölçekli kopya sayısı varyantlarının güvenilir tanımlanması için izin verir. Bununla birlikte, bu protokol yönleri de tek hücre genetik değişikliklerin diğer tip araştırmak için uygulanabilir.

Monte aspiratör Şekil 1A benzer görünmelidir. İğne o ama çok geniş bir büyük hacimli tek bir hücre ile çizilmiş bir tek hücre karşılamak için yeterince geniş olacak şekilde çizilmelidir. 10X alan (Şekil 1B) bir ila beş hücre olduğunda tek hücre aspire en kolay yoldur. Tüm genom amplifikasyonu başarılı ise, örnek bir agaroz jeli üzerinde leke olarak gösterilir (Şekil 2, bölmeler, 1, 2, 4, 5, 6, ve 7) olacak. Bir soluk veya eksik smear başarısız amplifikasyon reaksiyonu gösterir ve örnek sıralı olmamalıdır (Şekil 2, 3 şeritleri ve 8). Kütüphane hazırlandıktan sonra, numune parçası boyutu dağılımı, bir fragmanı analizöründe kapiler elektroforez ile değerlendirilmelidir.Hazırlanabilmişse kütüphaneleri 150 900 bp fragmanı, boyutları çok daha dağılımına sahip olacaktır (Şekil 3, A, B). Başarısız bir kütüphane hazırlanması yamuk parçası boyutu dağılımına neden olur ve bu kütüphaneler (Şekil 3C) sıralanmamalıdır. gizli Markov modelinin (HMMcopy) ve dairesel ikili bölümleme (DNAcopy) üzerinden dizi verilerinin işlenmesi tahmini kopya sayısının parça halinde her bir hücrenin genomu ayrıştırma olacaktır. Bu segmentler daha sonra tek bir hücre (Tablo 1) kazanç ya da kaybı ile tutarlıdır tahmini kopyalama sayısı ile bu tespit etmek filtrelenebilir. HMMcopy ve DNAcopy Bunlar süzülmüş segmentler daha sonra yüksek güven CNVs tanımlamak için üst üste edilmelidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig1.jpg" /> 1. Tek hücre izolasyonu rakam. (<html> A) Bir microaspirator toplandı. (B) 10X alan gösteren hücreleri (oklar) ve microaspirator iğne (sağ alt köşe) ayrışmış. 10X alanında bir ila beş hücre olduğunda tek hücre aspire en kolay yoldur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55143/55143fig2.jpg" /> 2. Tüm genom amplifikasyon rakam. tüm genom amplifikasyonu ürünleri 5 ul agaroz jel elektroforezi. başarılı bir şekilde 1 kb 100 bp&#39;den parlak smear görünür amplifiye Numuneler (kulvarlar 1, 2, 4, 5, 6 ve 7) ve dizilebilir. başarıyla soluk lekeleri ya da hiç smear (kulvarlar 3 ve 8) üretecek yükseltmek yoktur ve sıralı olmamalıdır örnekler.large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55143/55143fig3.jpg" /> Şekil 3. kütüphane hazırlanması. Bir fragman analizörü Temsilcisi sonuçlar. grafikleri Y ekseni üzerinde X ekseninde ve bağıl floresan birimi (RFU) üzerine (bp olarak) fragmanı boyutunu gösterir. Her grafiğin sağında bir simüle jel şerit olduğunu. (A) 150 ve 900 bp arasında ve keskin zirveleri ya da bir tarafa doğru önyargısız eşit dağıtımı ile, ideal bir örnek için bulundu. Bu örnek, dizileme için kabul edilebilir. Bir boyut dağılımı ile iyi bir örnek (B) Sonuçlar, düşük değerli parçası boyutları eğilmiş. Bu en uygun olmasa da, numune hala dizilenebilmektedir. (C) ağırlıklı olarak küçük fragman boyutları ile, başarısız bir örnek bulundu. Bu büyük olasılıkla tagmentation aşaması esnasında uzun inkübasyon kaynaklanırKütüphane hazırlama. Bu örnek sıralanmamalıdır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55143/55143fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="7"> HMMcopy </td></tr><tr><td> Numune </td><td> bölüm </td><td> Chr </td><td> Başlama </td><td> Son </td><td> Belirtmek, bildirmek </td><td> Medyan </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 23 </td><td> chr8 </td><td> 144.500.001 </td><td> 146.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.5008794 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 29 </td><td> chr10 </td><td> 67.000.001 </td><td> 134.500.000 </td><td> 6 </td><td> 0.4031945 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 52 </td><td> chr19 </td><td> 1 </td><td> 20000000 </td><td> 6 </td><td> 0.4616884 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> 57 </td><td> chrY </td><td> 1 </td><td> 59.500.000 </td><td> 2 </td><td> -1,506532 </td></tr><tr><td colspan="8"> DNAcopy </td></tr><tr><td> Numune </td><td> krom </td><td> Başlangıç bin </td><td> bitiş bin </td><td> Başlama </td><td> Son </td><td> Seg ortalama </td><td> Seg med </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr10 </td><td> 88 </td><td> 197 </td><td> 62.612.945 </td><td> 129.971.511 </td><td> 1,4688 </td><td> 0.157 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chr19 </td><td> 0 </td><td> 31 </td><td> 0 </td><td> 28.416.392 </td><td> 1,4141 </td><td> 0,1674 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrX </td><td> 77 </td><td> 126 </td&gt; <td> 51.659.160 </td><td> 95.343.369 </td><td> 1,3548 </td><td> 0,1874 </td></tr><tr><td> D15-4998 </td><td> chrY </td><td> 0 </td><td> 14 </td><td> 0 </td><td> 23.805.358 </td><td> -2,7004 </td><td> 0,3591 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Veri analizi. Tek bir hücreden HMMcopy ve DNAcopy tarafından oluşturulan Filtreli segmentler. Bu iki sonuç örtüşen 67 130 Mb gelen kromozom 10 üzerindeki bir kazanç yanı sıra 0 ila 20 Mb gelen kromozomda 19 bir kazanç ortaya koymaktadır. Biz kromozomun 19 proksimal kısmında kazançlar tek hücre sıralama 12 bir dışlayıcı olduğunu bulduk.

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing at JoVE.com

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

detection-of-copy-number-alterations-using-single-cell-sequencing

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K Görüntüleme.  Massachusetts Institute of Technology.  Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar. 

Video: Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Kanser Araştırmaları

Detection of Rare Mutations in CtDNA Using Next Generation Sequencing

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. However, the application of this method is challenging due to its low sensitivity in analyzing the trace amount of ctDNA in the blood. Furthermore, the method may generate false positive and negative results from this sequencing and subsequent analysis. To improve the feasibility and reliability of ctDNA detection in the clinic, here we present a technique which enriches rare mutations for sequencing, Enrich Rare Mutation Sequencing (ER-Seq). ER-Seq can distinguish a single mutation out of 1 x 107 wild-type nucleotides, which makes it a promising tool to detect extremely low frequency genetic alterations and thus will be very useful in studying disease heterogenicity. By virtue of the unique sequencing adapter&#39;s ligation, this method enables an efficient recovery of ctDNA molecules, while at the same time correcting for errors bidirectionally (sense and antisense). Our selection of 1021 kb probes enriches the measurement of target regions that cover over 95% of the tumor-related driver mutations in 12 tumors. This cost-effective and universal method enables a uniquely successful accumulation of genetic data. After efficiently filtering out background error, ER-seq can precisely detect rare mutations. Using a case study, we present a detailed protocol demonstrating probe design, library construction, and target DNA capture methodologies, while also including the data analysis workflow. The process to carry out this method typically takes 1-2 days.

This manuscript describes a technique for detecting mutations of low frequency in ctDNA, ER-Seq. This method is differentiated by its unique use of two-directional error correction, a special background filter, and efficient molecular acquirement.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

The analysis of circulating tumor DNA (ctDNA) using next-generation sequencing (NGS) has become a valuable tool for the development of clinical oncology. ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, and prediction of treatment resistance. Starting from the hypothesis that androgen receptor (AR) gene copy number (CN) gain is a frequent event in metastatic castration resistance prostate cancer (mCRPC), we propose to analyze this event in cfDNA as a potential predictive biomarker.
We evaluated AR CN in cfDNA using 2 different real-time PCR assays and 2 reference genes (RNaseP and AGO1). DNA amount of 60 ng was used for each assay combination. AR CN gain was confirmed using Digital PCR as a more accurate method. CN variation analysis has already been demonstrated to be informative for the prediction of treatment resistance in the setting of mCRPC, but it could be useful also for other purposes in different patient settings. CN analysis on cfDNA has several advantages: it is non-invasive, rapid and easy to perform, and it starts from a small volume of serum or plasma material.

This manuscript describes the copy number variation analysis performed in serum or plasma DNA using real-time PCR approach. This method is suitable for the prediction of drug resistance in castration resistant prostate cancer patients, but it could be informative also for other diseases.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal gastric mucosa. Recently, we detected CDH1a transcript variant in fresh-frozen tumor tissues obtained from patients with GC. The expression of this variant in tissue samples was investigated by the chip-based digital PCR (dPCR) approach presented here. dPCR offers the potential for an accurate, robust, and highly sensitive measurement of nucleic acids and is increasingly utilized for many applications in different fields. dPCR is capable of detecting rare targets; in addition, dPCR offers the possibility for absolute and precise quantification of nucleic acids without the need for calibrators and standard curves. In fact, the reaction partitioning enriches the target from the background, which improves amplification efficiency and tolerance to inhibitors. Such characteristics make dPCR an optimal tool for the detection of the CDH1a rare transcript.

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

The manuscript describes a chip-based digital PCR assay to detect a rare CDH1 transcript variant (CDH1a) in fresh-frozen normal and tumor tissues obtained from patients with gastric cancer.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Genetik

Comparative Lesions Analysis Through a Targeted Sequencing Approach

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective anti-tumor strategies. Although concerns are frequently raised due to differences in sample processing and depth of coverage, next-generation sequencing of solid tumors have unraveled a highly variable degree of ITH across tumor types. Capturing the genetic relatedness between primary and metastatic lesions through the identification of clonal and subclonal populations is critical to the design of therapies for advance-stage diseases. Here, we report a method for comparative lesions analysis that allows for the identification of clonal and subclonal populations among different specimens from the same patient. The experimental approach described here integrates three well-established approaches: histological analysis, high-coverage multi-lesion sequencing, and immunophenotypic analyses. In order to minimize the effects on the detection of subclonal events by inappropriate sample processing, we subjected tissues to careful pathological examination and neoplastic cell enrichment. Quality controlled DNA from neoplastic lesions and normal tissues was then subjected to high coverage sequencing, targeting the coding regions of 409 relevant cancer genes. While only looking at a limited genomic space, our approach enables evaluating the extent of heterogeneity among somatic alterations (single-nucleotide mutations and copy-number variations) in distinct lesions from a given patient. Through comparative analysis of sequencing data, we were able to distinguish clonal vs. subclonal alterations. The majority of ITH is often ascribed to passenger mutations; therefore, we also used immunohistochemistry to predict functional consequences of mutations. While this protocol has been applied to a specific tumor type, we anticipate that the methodology described here is broadly applicable to other solid tumor types.

This article describes a method to identify clonal and subclonal alterations among different specimens from a given patient. Although the experiments described here focus on a specific tumor type, the approach is broadly applicable to other solid tumors.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Assessing intra-tumoral heterogeneity (ITH) is of paramount importance to anticipate failure of targeted therapies and design accordingly effective ...

Davranış

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biyomühendislik

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Efforts to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The establishment of high-throughput, massively parallel "next-generation" sequencing has aided the discovery of many such mutations. To enhance the clinical and translational utility of this technology, platforms must be high-throughput, cost-effective, and compatible with formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples that may yield small amounts of degraded or damaged DNA. Here, we describe the preparation of barcoded and multiplexed DNA libraries followed by hybridization-based capture of targeted exons for the detection of cancer-associated mutations in fresh frozen and FFPE tumors by massively parallel sequencing. This method enables the identification of sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving all targeted genes. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus conferring high sensitivity for detecting low frequency mutations.

We describe the preparation of barcoded DNA libraries and subsequent hybridization-based exon capture for detection of key cancer-associated mutations in clinical tumor specimens by massively parallel "next generation" sequencing. Targeted exon sequencing offers the benefits of high throughput, low cost, and deep sequence coverage, thus yielding high sensitivity for detecting low frequency mutations.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Biyoloji

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient&#8217;s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.

Array Comparative Genomic Hybridization Array CGH for Detection of Genomic Copy Number Variants

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a diagnostic service laboratory.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron transport chain. Unlike the diploid nuclear genome, most cells contain many more copies of mtDNA, ranging from less than 100 to over 200,000 copies depending on cell type. MtDNA copy number is increasingly used as a biomarker for a number of age-related degenerative conditions and diseases, and thus, accurate measurement of the mtDNA copy number is becoming a key tool in both research and diagnostic settings. Mutations in the mtDNA, often occurring as single nucleotide polymorphisms (SNPs) or deletions, can either exist in all copies of the mtDNA within the cell (termed homoplasmy) or as a mixture of mutated and WT mtDNA copies (termed heteroplasmy). Heteroplasmic mtDNA mutations are a major cause of clinical mitochondrial pathology, either in rare diseases or in a growing number of common late-onset diseases such as Parkinson's disease. Determining the level of heteroplasmy present in cells is a critical step in the diagnosis of rare mitochondrial diseases and in research aimed at understanding common late-onset disorders where mitochondria may play a role. MtDNA copy number and heteroplasmy have traditionally been measured by quantitative (q)PCR-based assays or deep sequencing. However, the recent introduction of ddPCR technology has provided an alternative method for measuring both parameters. It offers several advantages over existing methods, including the ability to measure absolute mtDNA copy number and sufficient sensitivity to make accurate measurements from single cells even at low copy numbers. Presented here is a detailed protocol describing the measurement of mtDNA copy number in single cells using ddPCR, referred to as droplet generation PCR henceforth, with the option for simultaneous measurement of heteroplasmy in cells with mtDNA deletions. The possibility of expanding this method to measure heteroplasmy in cells with mtDNA SNPs is also discussed.

Here we present a protocol for measuring absolute mitochondrial (mt)DNA copy number and mtDNA deletion heteroplasmy levels in single cells.