Bu yöntem, anti-melanojenik faaliyetleri ile fonksiyonel kozmetik ve cilt ajan gelişiminde yararlı olabilir. Bu gerçekleştirmek için var ve sonuç hızlı bir şekilde elde edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem etkileri veya bileşikleri tanımlamak veya araştırmak veya antimelanogenic veya promelanojenik faaliyetleri araştırmak isteyen araştırmacılar için yararlı olabilir.
Tyrosinaz aktivitesi ölçmek için b16-F10 Melanicides beş kez 10 bir hücre kültürü kuluçka için tam ortamda 24 iyi plaka konsantrasyonu kuyu başına dördüncü hücrelere tohumlama ile başlar. Ertesi gün, yeni hazırlanmış test bileşiği ve inhibitör kontrolü veya negatif kontrol ile desteklenen DMEM ile her kuyuda supernatant değiştirin ve başka bir 72 saat için kuvöz plaka dönmek. Tedavi nin sonunda kuyuları kuyu başına 300 mikrolitre soğuk pb ile iki kez durulayın ve plakayı buza yerleştirin.
Sonraki beş dakika sonra hücre lysates toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak her iyi lysis tampon 300 mikrolitre ekleyin. Ortaya çıkan hücre parçacık süspansiyonlarını tek tek 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın. Ve lisatları 14,500 rpm'de iki saniye boyunca üç kez homojenize edin ve hücreler arası Tyrosinaz'ı serbest bırakın.
Santrifüj ile hücre enkaz pelet ve buz üzerinde bireysel 1.5 mililitrelik santrifüj tüpler için supernatants aktarın. Her bir süpernatantın 70 mikrolitresini 96 kuyunun tek tek kuyularına ayırın ve her bir süpernatant kuyuya 140 mikrolitre Tyrosinase substrat çözeltisi ekleyin. Iyi içeriğini karıştırmak için plaka nazik sallayarak.
Sonra plakayı 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın. Ve bir mikroplaka okuyucu üzerinde 475 nanometre de Tyrosinaz aktivitesi ölçmek. Tedavi edilen hücrelerin lysate'sini topladıktan sonra hücrelerin melanin içeriğini ölçmek için.
Santrifüj ile lysates toplamak ve yeni tüpler için supernatants aktarın. 60 santigrat derecede bir saatlik kuluçka için her pelet için normal bir sodyum hidroksit 300 mikrolitre ekleyin. Ardından çözünmüş hücre süspansiyonlarının santrifüjü.
Daha sonra 200 mikrolitre süpernatantı 96 kuyunun her kuyuya aktarın. Ve 400 nanometre dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu üzerinde melanin içeriğini ölçmek. Fontana-Masson Boyama için, tedavi edilen hücreleri 300 mikrolitre soğuk pbs ile iki kez yıkayın ve hücreleri 4 santigrat derecede bir saat boyunca %10 formalin 200 mikrolitre ile düzeltin.
Kalın hücreleri distile suyla durulayın ve her kuyuya 58 ila 68 santigrat derece Amonyak gümüşçalışma çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat kuluçka ya da hücreler sarı-kahverengi renge dönüşene kadar. Lekeli hücreleri distile suyla durulayın ve ardından oda sıcaklığında %0,1 altın klorür içinde iki dakikalık kuluçka makinesi.
Altın klorür işlenmiş hücreleri distile suyla durulayın ve hücrelere 200 mikrolitre sodyum tiyosülfat çözeltisi ekleyin. İki dakika sonra hücreleri tekrar durulayın. Ve hücreleri beş dakika boyunca her kuyuda 200 mikrolitre nükleer hızlı kırmızı ile etiketleyin.
Daha sonra bir ışık mikroskobu altında görüntüleme önce musluk suyu ile lekeli hücreleri yıkayın. Eşik çözümlemesi için, Resim J'deki görüntüleri açın ve görüntüyü seçin, ayarlayın ve Renk Eşiği'ni seçin. Fontana Masson ile boyanmış alanı ölçmek için parlaklık parametre çubuğunu sıfıra ayarlayın ve parlaklığı siyah veya kahverengi lekeli hücrelerin tümünün dahil edildiği noktaya ayarlayın.
Parçacıkları Analiz Et ve Analiz Et'i seçin ve Parçacıkları Analiz Et penceresinde özet kutusunu işaretleyin ve sonuçların bir özetini almak için tamam'ı tıklatın ve verileri elektronik tabloya kopyalayıp yapıştırın. Arbutin tedavisi önemli ölçüde kontrol aracı tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında hücresel Tyrosinaz aktivitesini bastırır. Benzer şekilde Arbutin ile uyarılan hücrelerin melanin içeriği kontrollere göre önemli ölçüde azalır.
Hücreler tedavi grupları arasında morfolojik olarak benzer olmasına rağmen, Arbutin kontrol tedavi hücreleri ile karşılaştırıldığında siyah pigment alanını azaltır. Bu yöntem, bileşik kitaplığımızı kullanarak tarama faaliyetleri için yararlıdır. Hızlı bir şekilde test edilmesi gereken yüzlerce örnek vardır.
Ayrıca bu yöntem melanogenez içeren mekanizmayı araştırmak için de kullanılabilir. Biyoaktif adaylar bileşikler tespit edildikten sonra, biyolojik mekanizmalar veya ticari uygulamalar çalışma onların tanıklığı için.
