Koenzim A, kısaca CoA denir, hücremetabolizmasında önemli bir kofaktördür. Kantitatif ölçümler hayvan modellerinde beslenme ve hormonal durumlarla meydana gelen değişiklikleri ortaya koymaktadır. Bu yöntem, basit ve güvenilir bir yöntemle, CoA türevleri ve ücretsiz CoA dahil olmak üzere hücresel CoA'nın toplam miktarını ölçüyor.
Beyin demir birikimi ile nörodejenerasyon çeşitli CoA biyosentetik yol genlerinde mutasyonlar ile ilişkilidir. Tüm organizmalar hayatta kalmak, büyüme ve fonksiyon için CoA gerektirdiğinden bu yöntem herhangi bir biyolojik sisteme uygulanabilir. İlk kez araştırmacı olan bir araştırmacı, numune hazırlamada ilk adımlarla mücadele edebilir, burada numuneleri kesinlikle soğuk tutmak ve daha sonra hızlı bir şekilde potasyum hidroksite aktarmak önemlidir.
Potasyum hidroksite aktarılmadan önce toplu olarak alınan numune sayısını sınırlayın ve deneysel numunelerle çalışmadan önce transferle pratik yapın. Birçok araştırmacı daha sonra biyokimyasal analiz için biyolojik örneklerin hazırlanmasında katı faz çıkarma ile tanışmış değildir. Başlamak için, paralel olarak triplicate kültür yemekleri inkübat, biyokimyasal analiz için iki ve canlı hücre sayısının belirlenmesi için bir.
Kültür geç subconfluent yoğunlukları yaklaştığında, örneğin, insan HepG2/C3A hücreleri altı ila sekiz kez 10 bir yoğunluk büyüdü altı veya HEK 293T hücreleri yaklaşık 1.3 kat 10 00 00 00 000-10 00 bir yoğunluk büyüdü, kültürde yapışık hücreleri hasat. Sonra, aynı kültür çanak buz gibi su bir mililitre ekleyin. Hücreleri çanaktaki soğuk suya kazıyın ve hücre süspansiyonuna 400 mikrolitre 0,25-molar potasyum hidroksit ve 1,5 mililitre su içeren bir cam test tüpüne aktarArak pH'ı 12'nin üzerine çıkarın.
Süspansiyonu 10 saniye boyunca yüksekbir şekilde girdaplayarak şiddetle karıştırın. Sonra parafin film ile sıkıca kaplayın ve bir su banyosunda sallayarak olmadan bir saat boyunca 55 santigrat derece kuluçka. Daha sonra, tek azılı Trizma-hidroklorür çözeltisi 160 mikrolitre ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre ekleyin.
10 saniye boyunca yüksek girdap tarafından karıştırın. Bu da pH'ı serbest CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekize çıkarır. Tüpü parafin filmle kaplayın ve mBBr'nin CoA'nın tiyoliyle reaksiyona sayılması için numuneleri iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
İki saat sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu durdurmak için 10 saniye girdap tarafından karıştırın. Tüpte bir yağış oluşur. Sonra, santrifüj 2, 000 kez g 15 dakika.
Çökelmiş hücre enkazını çıkarmak için, katı fazlı ekstraksiyon sütunu temizliği için bir cam test tüpündeki süpernatant'ı aktarın ve kaydedin. Analize başlamadan önce, bir rotamatör-stator homogenizer ile bir prob ve doku bozulması yerleştirmek için tasarlanmış bir cam test tüpüne bir mililitre bir mililitre bir mililitre potasyum hidroksit ekleyin. Tüpü kullanıma kadar buzda tutun.
Dondurulmuş doku parçalarını hızlı bir şekilde tartın ve her örnek için ıslak ağırlığı kaydedin. Dokuyu cam tüpe aktarın ve 30 saniye boyunca dokuyu homojenize edin. Doku tamamen çözülmesinden kaçının.
0.25-molar potasyum hidroksit 500 mikrolitre ekleyin. Girdap 10 saniye yüksekte ve buzda kal. Bu toplam CoA verim coa tiyoesters hidrolize 12 yukarıdaki numunenin pH getiriyor.
Tüpü parafin filmle kaplayın. Kültürlü hücrelerin hazırlanması ve dokuların hazırlanması bu işlemin en kritik adımlarıdır. CoA bozulmasını önlemek için hızlı bir şekilde yüksek potasyum hidroksit eklemek önemlidir.
Hidrolizi desteklemek için titremeden numuneleri su banyosunda iki saat boyunca 55 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, 150 mikrolitre tek molar Trizma-hidroklorür ve 100 milimolar mBBr 10 mikrolitre eklemek ücretsiz CoA ile mBBr reaksiyonu desteklemek için yaklaşık sekiz pH getirmek için. Girdap 10 saniye boyunca yüksekte.
Tüpü parafin filmle kaplayın ve tüm CoA'nın mBBr ile türetilmesini sağlamak için numuneleri karanlıkta iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, asetik asit 100 mikrolitre ekleyin ve yüksek girdap 10 saniye boyunca reaksiyonu durdurmak için. 2, 000 kez g 15 dakika pelet çökelmiş hücre enkaz için santrifüj ve katı faz çıkarma sütunu temizleme için bir cam test tüpü içine supernatant aktarın.
Oda sıcaklığında, piriridil fonksiyonel grubun protonated ve bir aniyon değiştirici olarak işlev sağlayacak yıkama tampon bir mililitre ile her bir mililitre tek kullanımlık 2-2-piriridyl-etil silika jel sütun dengeleyin. Daha sonra, pipet örnek supernatant sütun üzerine supernatant ve eluate toplamak. Sütunu bir mililitre yıkama tamponuyla iki kez ve bir mililitre suyla yıkayın.
Daha sonra, ayrı bir cam test tüpü içine, CoA-bimane toplamak için elüsyon tampon bir mililitre ile iki kez sütun yıkayın. Tüpteki CoA-bimane örneğini azot gazı altında kurutun. Seal, tamamen tüp kapağı, ve eksi 20 santigrat derece saklayın.
HPLC analizi için hazır olduğunuzda, 300 mikrolitre suda numuneyi yeniden askıya alın ve 10 saniye boyunca yükseklere girdap atarak şiddetle karıştırın. Herhangi bir çökelti kaldırmak için 10 dakika boyunca 5.000 kez g olarak bir santrifüj tüp filtresi ve santrifüj için resuspended örnek aktarın. Daha sonra, filtrelenmiş numuneyi HPLC enjeksiyonu için uygun bir cam şişeye aktarın.
Bu çalışmada, temsili bir HPLC profili C18 HPLC sütununda CoA-bimane standardının bekletme süresini göstermektedir. CoA-bimane standardının artan miktarları ayrı ayrı enjekte edildi ve CoA-bimane kromatogramlarında zirvelerin altındaki alanlar CoA-bimane girdisinin bir fonksiyonu olarak çizildi. Standart eğri 393 nanometre dalga boyunda CoA-bimane emicilik büyüklüğünü yansıtıyor.
CoA-bimane floresansı da 393 nanometre uyarma dalga boyu ve 470 nanometre emisyon dalga boyu yansıtıldı. Sonraki HPLC ayırma ve fare karaciğer veya insan kültürlü C3A hücreleri için tipik algılama profilleri burada kırmızı zirveleri ile gösterilir, arasında bir tutma süresi ile 11 ve 12 dakika elüsyon programı kullanılarak. mBBr ile reaksiyon tespit edilebilir sonuçlar vermezse, TRizma-HCl miktarının pH'ı yaklaşık sekize düşürmek için ayarlanması gerekebilir.
Bu bimantürevleri olarak sulfhydryl veya tiyoester moieties içeren ek hücresel molekülleri tespit etmek mümkündür. Örneğin, glutatyon-bimane HPLC yöntemi ile tespit edilebilir. Bu teknik, diğer araştırmacıların tip 2 diyabetin hayvan modelleri gibi metabolik dengesizlikle ilişkili CoA disfonksiyonunun potansiyel rolünü araştırmalarına olanak sağlayacaktır.
Araştırmacılar, katı faz lı ekstraksiyon için kullanılan organik çözücülerle çalışırken kişisel koruyucu ekipman kullanmalıdır.
