X-Ray kristalografisi, proteinlerden elde edilen 3 Boyutlu yapısal bilgileri belirlemek için baskın bir tekniktir. Senkrotron ışını hatları proteinlerin ürettiği küçük, zayıf difüzif kristallerden veri elde etmek için gereklidir. Devasa olan benzersiz bir ışın hattıdır çünkü biyolojik makromoleküllerden veri toplama işlemini tam olarak otomatleştirir.
Örnek montaj, konum ve son veri toplama. Araştırmacıların ışın hattında veri toplamak yerine laboratuvarda zaman geçirmelerine olanak sağladığı için bu tür tam otomasyon çok önemlidir. Işın hattı da akıllı ve ortalama olarak, ışın hattı insanlar tarafından işletilen zaman daha iyi veri toplayabilir.
Bu protokolü başlatmak için, kristal montaj gerçekleştirin ve metin protokolünde açıklandığı gibi Massive one üzerinde ışın süresi isteyin. Protein kristalografi ışın çizgileri veya ISPyB web sitesi için bilgi sistemine gidin. MX denemelerini seçin, deneme numarası ve parolayla giriş yapın.
Sevkiyata tıklayın, yeni ekleyin ve gerekli bilgileri sağlayın. Ardından kaydet'i tıklatın. Paket ekle'yi tıklatın ve istenen bilgileri doldurun.
Kaydet'i tıklatın, ardından kapsayıcı ekle'yi tıklatın. Disk barkod adını verin ve omurga diski seçin, tekrar kaydet'i tıklatın. Kapsayıcı sembolüne tıklayın ve edit ve diskte protein adı, tercih edilen iş akışı ve kristal konumu gibi örneklerle ilgili gerekli bilgileri doldurun.
ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanan proteini seçin. Her bir örneği tanımlamak için benzersiz bir örnek adı girin. İsteğe bağlı olarak, pin barkod tazyik.
İçerecek bilgilerin geri kalanı da isteğe bağlıdır. Her bir örnek için deneme türünü girin. Bu, her kristali işlemek için hangi otomatik iş akışının kullanılacağını tanımlar.
GCSH kristallerinin iğne olduğu göz önüne alındığında, MX tuşuna basın P.Next'i seçin, bir uzay grubuna girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamaları için kullanılacak ve kullanılabilir otomatik veri işleme boru hatları tarafından. İstenilen çözünürlüğü girin.
Bu, kristalden dedektöre ilk kafes taramalarından, karakterizasyondan ve varsayılan veri toplamadan uzaklığı tanımlar. Şimdi, bu sınıra difüzif olmayan kristallerden tam veri kümelerinin toplanmasını önlemek için istenen eşik çözünürlüğünü ayarlayın. Bu, veri depolama alanından tasarruf sağlayabilir ve zamanı analiz eder.
Gerekli bütünlüğü ayarlayın. Sonra gerekli çokluğu ayarlayın. Örnek desteğinde birden fazla kristal bulunursa, analiz edilecek maksimum kristal sayısını ayarlayın.
Varsayılan değer, MX tuşuna basmak için bir veya beştir P.Uygun ışın boyutu da seçilebilir. Uzay grubuna, eğer biliniyorsa, kuvvet uzay grubu sütununa koyun. Sonra kristallerin radyasyon hassasiyetini ayarlayın.
İstenirse, tam veri kümesi koleksiyonu için toplanacak toplam dönüş açısını ayarlayın. Tüm bilgiler sisteme girdikten sonra değerleri kaydedin. Tıklayın, sevkiyatlara geri dönün ve ESRF'ye gönderi gönderme tuşuna basın.
Sevkiyat etiketini yazdırın ve örnekleri gönderin. Kullanıcılar ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile bir pikap düzenlemelidir. Deney günü, numuneler Massive one yüksek kapasiteli çiy-er aktarılır.
Işın hattı bilim adamları daha sonra uzaktan kullanıcılar tarafından takip edilebilir veri toplama, başlatmak. Her farklı örnek türü için, kullanıcılar veri toplamanın başladığını bildiren bir e-posta alır. Tüm iş akışlarındaki tüm adımların yürütülmesi çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir.
Bu, ISPyB'e giriş yaparak kullanıcı tarafından erişilebilir. Sonuçlar da görüntülenebilir ve indirilebilir. Analiz edilen her örnek için ISPyB'deki otomatik denemenin sonuçlarını inceleyin.
ID30A1'de istenilen deneysel oturuma tıklayın. Tercih edilen otomatik işleme ardışık hattını seçin. Doğru alan grubunda yazılan verileri en yüksek tamve en yüksek çözünürlüğe sahip olarak indirin.
Son toplama sonuçlarına tıklayıp indirebilirsiniz. MX basın P iş akışı ESRF ışın hattı Massive tarafından kullanılan tam otomatik olarak monte etmek, x-ışını ışın merkezi, karakterize, ve insan GCSH kristalleri bir dizi tam kırınım veri setleri toplamak. Örnekler monte edildi ve döngü tarayan bir alan için analiz edildi.
Kırınım analizlerinden sonra, veri toplama için kristal içinde dört nokta seçilmiştir. Moleküler replasman ile manuel yapı tayini, tek bir otomatik arıtma döngüsünden sonra yüksek kaliteli elektron yoğunluğu haritası nı ortaya koydu. Bu veri kümesi için, otomatik boru hattı bir noktada üç iki angstrom çözünürlüğü veri kesti.
Ancak, kullanıcılar verileri daha düşük çözünürlükte kesmeye karar verebilir. Sürekli elektron yoğunluğu eterminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görülebilir. İnsan ve büyükbaş hayvanı GCSH'yi ayıran dört ikameden üçü elektron yoğunluğunda kolayca tanımlanabilir.
Bu daha az aspartik asit lizin için daha az açıktır 125 ikame. Hangi yan zincirin elektron yoğunluğu sadece kısmen esneklik nedeniyle çözülür. Şu anda elde edilen model 20 nokta dört yüzde bir R çalışma değeri ve 23 nokta sekiz yüzde R serbest değeri ve daha otomatik ve manuel model oluşturma ve arıtma ek döngüleri ile optimize edilebilir.
Gereksinimleri sisteminize uyarlamak önemlidir. Örneğin, zaten gözlenen çözünürlüğü bilinen bir değere ayarlamak zamandan tasarruf edebilir ve daha iyi veri toplama sağlayabilir. Tam otomatik veri toplama kristalografi demokratikleştirilmiş ve şimdi bile küçük laboratuvarlar bu sadece büyük insan gücü ile daha önce mümkün iken ünlü proje girişmek olabilir.
