X-ışını kristalografisi kullanılarak parça adı verilen daha küçük organik bileşiklerin taranması, ilaç keşfi veya biyokimyasal takım bileşiği gelişimi için başlangıç noktaları olan molekülleri tanımlamak için etkili bir yöntemdir. Kristalografik parça taraması sadece kimliği değil, aynı zamanda incelenen proteinin yüzeyinde parçaların nereye ve nasıl bağlandığını da ortaya koydu. Bu teknik, uygun protein kristallerinin yetiştirilebileceği her biyokimyasal veya tıbbi olarak ilgili protein hedefinde kullanılabilir.
Sonuçların kalitesi, numune işleme kalitesine yakından bağlıdır. Aşağıdaki görsel gösterimin araştırmacıların yüksek kaliteli deneyler yapmalarına yardımcı olacağına inanıyoruz. Prosedürü gösteren tatjana Barthel, doktora araştırmacısı ve laboratuvarımda doktora öğrencisi.
Başlamak için, önceden ısıtılmış eleme plakasının torbasını oda sıcaklığına kadar kesin, ardından kapağı ve folyoyu eleme plakasından çıkarın. Beş mililitre ıslatma çözeltisini reaktif rezervuarında dekant. Daha sonra plakanın 96 rezervuarının her birini 12 kanallı pipet kullanarak 40 mikrolitre ıslatma çözeltisi ile doldurun.
Kolay erişim çerçevesini eleme plakasının üzerine yerleştirin ve cihazın sol ve sağ tarafına kaydırarak birlikte verilen kelepçelerle sabitleyin. Eleme plakasını ve kolay erişim çerçevesini mikroskop altına yerleştirin ve çerçevenin ilgili akrilik cam karoserini hareket ettirerek ilk kuyuyu açın. Taze bir pipet ucu kullanarak rezervuardan iyi içeren parçaya 0,4 mikrolitre ıslatma çözeltisi ekleyin.
Damlanın kurumuş parçayı kapladığından emin olun. En büyük kristalleri içeren kristalizasyon plakasını ikinci mikroskop altına yerleştirin ve kuyulardan birinde sızdırmazlık folyosunu kesin. Uygun büyüklükte bir döngü kullanarak, bir kristali ilk mikroskop altında tarama plakasının kuyusuna aktarın.
Halkayı hazırlanan cam spot plakada yıkayın, ardından dokuya hafifçe dokunarak kurulayın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her transferden sonra bunu yapın. Kristalin düzgün yerleştirildiğından emin olmak için mikroskobu kullanın.
İkinci kristalin prosedürünü tekrarlayın. Bir sonraki kuyuya geçin ve kalan tüm kuyular için prosedürü tekrarlayın. Kristaller eleme plakasındaki 96 kuyunun tümüne aktarıldıktan sonra, tarama plakasını mikroskop altından kolay erişim çerçevesiyle birlikte çıkarın ve tezgaha veya masaya yerleştirin.
Ardından, tarama plakasından kolay erişim çerçevesini çıkarın, eleme plakasını sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve daha önce optimize edilmiş ıslatma süresi boyunca kuluçkaya yatmak için kristalizasyon inkübatörüne veya dolaba yerleştirin. İki saatlik kuluçka yeterlidir, ancak geceleme daha uygun olabilir. Unipuck köpük Dewar'ı üç Unipuck kapağı ile hazırlayın ve yarısı yerde tutarak sıvı nitrojenle doldurun.
Yarı dolu Dewar'ı yedek kulübesine taşıyın ve tamamen kenara doldurun. Tüm deney sırasında üst kenara dolu tutun ve sıvı nitrojeni sık sık değiştirin. Tarama plakasını inkübatörden alın ve folyosunu çıkarın.
Kolay erişim çerçevesini üste yerleştirin. İlk kuyuyu kaydırın. Damladan bir kristal hasat edin ve hızlı bir dikey hareketle daldırarak sıvı nitrojende soğutun.
Örneği uygun pak konumuna getirin ve örnek izleme sayfasında ilgili notları alın. İkinci kristalin prosedürünü tekrarlayın. Bir sonraki kuyuya gidin ve üç pak da dolana kadar diğer kristallerin konumunu tekrarlayın.
Unipuck tabanlarını sıvı nitrojende önceden soğutun ve kapakların üzerine ekleyin. Unipucks'ı bir nakliye dewar veya depolama Dewar depolama rafında saklayın. Ölçüme kadar kriyojenik sıcaklıklarda sıvı nitrojende tutun.
Tarama plakasında kalan numuneler için kristalleri Unipucks'ta toplama ve depolama prosedürünü tekrarlayın. Parça ıslatma ve kristal hasadı yapıldıktan sonra kristal morfolojilerinin değişkenliği burada gösterilmiştir. Biraz bozulmuş görünen kristaller bile dahil edildi, çünkü hala yararlı verilerle sonuçlandılar.
Veriler BESSY II senkrotron'daki 14.1 ve 14.2 kiriş hatlarında toplanmıştı. Her örnek için kırınım veri toplama gerçekleştirildi. Veriler FragMAXapp kullanılarak analiz edildi, işleme için XDSAPP, yapı iyileştirme için fspipeline ve isabet bulma için PenDA kombinasyonuna odaklandı.
Bu, DMSO serbest ıslatma koşulu kullanılarak AR protein kompleksinde 15 isabetle sonuçlandı. F2X giriş ekranının aynı hedefe karşı önceki bir kampanyasında, ıslatma durumundaki DMSO da dahil olmak üzere, 20 isabet bulundu. Bu, DMSO atlanırsa isabetlerin %75'inin tanımlanabileceği anlamına gelir.
Deneyin başarısı için, kristallerin prosedürün her adımı sırasında düzgün ve dikkatli bir şekilde ele alınması çok önemlidir. Kristalografik parça taraması, akademide ve ilaç endüstrisinde sıklıkla uygulanan yaygın olarak kullanılan bir tekniğe olgunlaşmıştır.
