Bu protokol, zaman içinde çözülen seri kristalografik deneyler sırasında sık karşılaşılan sorunların veri kalitesinden ödün vermemelerini sağlamak için tasarlanmıştır. Bu yöntemin en büyük avantajlarından biri bireysel kristal sistemlerine adaptasyonudur. Yüksek hızlı kamera ekstrüzyon testi de bize doğrudan ekstrüzyon kararlılığını ölçmek için izin verir.
İlk olarak, enjeksiyondan yaklaşık 30 dakika önce 100 mikrolitrelik bir şırıngaya 50 mikrolitre kristal yüklü monoolein bazlı LCP yükleyin. Vakum ortamına enjeksiyon için, beş mikrolitre MAG 7.9 ve beş mikrolitre sıvı parafini ikinci bir şırınganın arkasına yükleyin. Şırıngayı dikey olarak tutarak, hava kabarcıklarını şırıngadan dışarı at.
Şırıngayı MAG 7.9 ve parafin ile standart bir şırınga bağlayıcısına bağlayın. Ve karışımın küçük bir hacim bağlayıcı iğne ucunda görünür kadar yavaşça piston üzerinde basarak beyit hava temizler. Numuneşin içine hava sokmamak için şırınga çiftini araba alarak şırınga çiftine bağlayın.
Numuneyi çiftleyiciden birden fazla kez geçirerek lipid ve parafini karıştırın. Daha sonra, başka bir 100 mikrolitre şırınga premix LCP 20 mikrolitre yükleyin. Boş şırıngayı beyitten çıkarın ve önceden karıştırılmış LCP'yi standart bir şırınga beyiti kullanarak şırınga içeren kristale takın.
Daha sonra, örnek 100 kez beyit ten geçirin. Kübik faz içine örnek getirmek için, monoolein üç mikrolitre ekleyin ve 50 kez karıştırın. Monoolein fazlalığından kaçınmak için saydam bir faz oluşana kadar bu işlemi tekrarlayın.
Numune sertliği ve ekstrüzyon için bir ön test olarak, boş şırıngayı şırınga beyitinden ayırın ve şırıngayı dikey olarak tutarak, beyitten az miktarda numune alma. Ekstrüzyon numunesi dik bir silindir oluşturuyorsa, numune ekstrüzyon testi için hazırdır. Daha önceden karıştırılmış LCP ekleyerek numunenin toplam hacmini 100 mikrolitreye ayarlayın.
Numune şırıngayı ve iki boş şırıngayı üç yönlü şırınga beyitine takın. Numunenin yarısını ikinci şırıngaya geçirerek ve numunenin her iki yarısını aynı anda üçüncü şırıngaya bastırarak en az 50 kez karıştırın. Kristallerin homojen dağılımını doğrulamak için karışık numuneyi içeren şırıngayı stereo mikroskop altına yerleştirin.
Akış hızlarının doğru olduğundan emin olmak için bir HPLC pompasını ve tüm su hatlarını temizleyin. Daha sonra enjektörün hidrolik aşamasını temizle. Ardından, kamerayı açın ve sağlanan yazılıma bağlayın.
Görsel geri bildirim için çalışan canlı bir video yla, meme ucunu çerçevenin ortasına yerleştirin ve üç eksenli sahneyle odak noktası haline getirin. Kameradaki kare hızını saniyede 1.000 kare olarak ayarlayın. Ardından, çözünürlüğü 512 piksele ayarlayın.
Kare hızına göre ayarlanan pozlama süresiyle, enjektör görünene kadar aydınlatma düzeyini ayarlayın. Enjektör ucunu sola sola ortalayıp çerçevenin üst üçte birinde yer alabilmek için yeniden konumlandırın. Kamerayı zaman atlama modunda ayarlayın.
Aralığı 30 saniyeye, tekrarları 40 kata ayarlayın. Tetikleyici modunu rastgele ayarlayın. Ve 1.000 kaydetmek için kare sayısını girin.
Şimdi, rezervuarı test numunesinin 20 mikrolitresi ile yükleyin ve kılcal başlığı takın. Dolgulu hazneyi enjektöre takın. Daha sonra, gaz hattını nozuldaki bağlantı noktasına takın ve gaz akışını başlatın.
Bunu takiben, aynı anda pompa ve kamera kaydı başlatın. Pompa basıncı beklenen bitiş saatine yakın keskin bir şekilde rampalı olana kadar ekstrüzyonu izleyin. Daha sonra, kayıt durdurmak, pompa kapatın ve kabartma vanası açarak sistem basıncı havalandırma.
Bunu takiben, analiz yazılımı ile video dosyasını açın ve ölçüm araçlarını kalibre edin. Ekstrüzyonda izlenebilir bir özelliğin bulunduğu videoda bir kare bulun. Kare numarasını kaydedin.
Ardından, videoyu aynı özelliğin görünür olduğu ancak önceki adımdaki konumundan hareket ettiği bir çerçeveye ilerletin. Kare numarasını kaydedin. Düz çizgi ölçüm aracını kullanarak, analiz ölçüsü ile özelliğin başlangıç ve bitiş noktasından uzaklığı ölçün.
Videonun her bölümü için önceki adımları birkaç kez yineleyin. Son olarak, veri serisini çizin. Burada açıklanan işlem için ideal başlangıç malzemesi, enjektör için viskoz taşıyıcı ortama dahil edilen yüksek mikrokristal yoğunluklarıdır.
Protein kristalleri proton pompalanan bakteri rodopsin üzerinde TRSFX verileri toplamak için kullanılmıştır, hangi fotoem emilimi sonra meydana gelen ultra hızlı değişiklikler ortaya. Üç yönlü bir beyit kullanılarak numune hazırlığından sonra, şırıngadaki malzemenin görsel incelemesi örnek homojenliğini gösterir. Ve mikroskop görüntüleri kristallerin yoğunluğunu doğrulayabilir.
Teslimat ortamı açık ve viskoz olduğunda örnek kübik fazdadır. Bulanık karışımlar, numunenin sünger veya lamellar fazda olduğunun bir göstergesidir, ancak yüksek kristal yoğunluğu LCP'nin berraklığını gizleyebileceğinden kesin değildir. Sünger fazını belirlemek için bir alçak basınç testi, şırınga pistonluyu numuneden çekerek yapılabilir.
Jet testi sırasında, örnek neredeyse sabit bir hızda hareket eden uzun sürekli bir LCP sütunu ekstrüzyon gerekir. Damlama modunda çalışan örnekler viskozitenin çok düşük olduğunu gösterir. Bir sütun oluşturan örneklerden elde edilen veriler, ekstrüzyonun deneysel parametreler tarafından dikte edilen minimum hızın üzerinde kaldığını göstermelidir.
Bu protokol kullanılarak optimizasyon yapıldıktan sonra seri kristalografik veriler uzman bir tesiste toplanabilir. Bu işlevini yerine getirirken tüm protein konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkaracaktır.
