Standart numune hazırlama, mikrokristallerin x-ışını kırınım deneyleri sırasında iyi bir sinyal-gürültü elde etmeyi zorlaştırır. Bu protokol, arka planda oluşan kristallerin kaynaklarını kontrollü bir şekilde azaltmayı amaçlamaktadır. Zımba dondurma robotik ve kriyoTEM ızgaralarının kullanımı, mikrokristalleri tekrar tekrar manipüle etmek, çevredeki sıvı hacmini azaltmak ve numunenin hızlı vitrifikasyonunu sağlamak için sağlam bir platform sağlar.
Izgaraları işlemek için gereken el becerisi, geleneksel kristal hasadı için gerekene benzer. Bir diğer önemli faktör, numune kullanımını azaltmanın anahtarı olan kristalizasyon çözeltisi kullanılarak ilk blotting parametrelerinin belirlenmesidir. Başlamak için, otomatik dalma dondurucuyu üreticinin talimatlarına göre kurun ve soğutun.
Kullanımdan hemen önce, ışıma kriyoTEM ızgaralarını 15 miliamper akım ve 0,39 milibar basınçla 25 saniye boyunca boşaltır, ardından ışıma deşarj ızgaralarını kapalı bir Petri kabında tutun. Numune odasının bağıl nem oranını %90'a, şişkinlik süresini ise beş saniyeye ayarlayın. Lekeleme tamamlandıktan sonra dalma dondurucusunun numuneyi otomatik olarak daldıracak şekilde ayarlı olduğundan emin olun.
Kristalizasyon kuyusunun ve rezervuarın mührünü açın. Damlanın hacmini korumak için kristal damlasına iki ila beş mikrolitre rezervuar çözeltisi ekleyin. Rezervuar çözeltisinin 10 mikrolitresini daha sonra kullanmak üzere 0,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve kristalleşme damlasının kurumasını önlemek için kuyuyu yeniden haline koyun.
Tek bir kızdırma deşarj ızgarası seçmek ve ızgarayı karbon tarafı şişkin koldan uzağa bakacak şekilde cihaza yüklemek için dalma donduran önseçimleri kullanın. Izgarayı tutan kanatları, karbon tarafı şişkin kolla yüzleşecek şekilde döndürün. KriyoTEM şebekesinin desteksiz tarafına iki mikrolitre rezervuar çözeltisi uygulamak için 2,5 mikrolitre pipet kullanın.
Izgarayı karbon tarafı şişkin koldan uzağa bakacak şekilde döndürün ve rezervuar sıvısını ızgaranın karbon film destek tarafına dikkatlice uygulayın. Şişkinlik işlemini başlatın ve ızgaranın yüzeyinden patlama dalgası görünene kadar karbon yüzeyinden çekilen sıvıyı gözlemleyin. Patlama dalgası görünmüyorsa, şişkinlik kolu ızgaradan çekilmeden önce blotting süresini bir ila iki saniye artırın.
Kristalizasyon plakasını ışık mikroskobu altına yerleştirin ve hedefi görüş alanı içinde iyi konumlandırın. Dalma dondurucusunda taze bir kızdırma deşarj ızgarası yerleştirin ve rezervuar sıvısını daha önce gösterildiği gibi ızgaranın desteksiz tarafına uygulayın. Karbon film destek tarafı dalma dondurucusunun örnek bağlantı noktasına bakacak şekilde ızgarayı döndürün.
Geçici contayı kristalizasyon plakasından soyun ve kristalizasyon damlasını tekrar tekrar hafifçe emiş etmek için iki mikrolitrede ayarlanmış pipeti kullanın. Emişli mikrokristal bulamacın iki mikrolitresini dalma dondurucusunda aktarın ve tüm numuneyi kriyoTEM ızgarasının karbon tarafına uygulayın. Şişkinliği başlatın ve patlama dalgasını gözlemleyin, ardından hemen dalma dondurmayı başlatın.
Izgarayı sıvı etandan sıvı nitrojene batırılmış ızgara kutusuna hızla aktarın. Izgarayı dondurduktan ve dayadıktan sonra, dalma derin dondurucuyu sıfırlayarak dalmış ızgarayı sıvı etandan geri çek. Izgarayı tutan kanatçıkları dalma dondurucusundan çıkarın ve ızgarayı ışık mikroskobu altına yerleştirin.
İnce odağı ayarlayın ve kristallerin ızgaradaki yoğunluğunu değerlendirin. KriyoTEM ızgarasını SEM'e yükledikten sonra, numuneyi hizalayın ve elektron ışınını açın. Başlangıçta tüm ızgarayı 45X büyütmede değerlendirin ve görüntüyü kaydedin, ardından tek tek kristaller açıkça gözlemlenene kadar tek tek ızgara karelerinin daha yakından incelenmesi için büyütmeyi artırın.
Izgaranın etrafında hareket edin ve durağan görüntüleri yakalayın, ızgaraların düz olmasını ve karbon destek filminin büyük ölçüde sağlam olmasını sağlayın. Kristali çevreleyen vitrifiye sıvının dar bir halesine sahip çok sayıda tek kristal olduğundan ve deliklerin karbon destek filminde göründüğünden emin olun. Izgaranın görüntülerini gözlemlerken ve yakalarken, vitrifiye sıvının geniş bölgelerinin bulunmadığından, altıgen buzun veya yüzey buzunun ızgaraya dağılmadığını ve kristallerin üst üste binmediğinden ve destek filmine eşit olarak dağıtılmadığını emin olun.
Büyük bir köpük dewar içinde, numune kartuşuna yüklenen gerekli sayıda VMXm numune tutucuyu soğutun. Numune yükleyicideki numune konumunun üzerine sıvı azot ekleyin. Mikrokristal yüklü ızgaralar içeren ızgara kutusunu numune yükleyicisinin ızgara kutusu girintisine hızlı bir şekilde aktarın ve kapağı gevşek ve döndürülebilir tutmak için kapağı hafifçe sökün.
Izgara kutusunun dışını kaldırın ve ızgarayı numune tutucusuna düz bir şekilde döşemek için ızgarayı döndürün. Önceden soğutulmuş circlip aracını ızgara açıklığında ızgaranın üzerine hızlı bir şekilde yerleştirin ve daireyi takmak için düğmeye basın. Numune tutucusuna yaklaşık 1,5 santimetre sıvı azot ekleyin.
VMXm örnek tokmaklarını kullanarak yüklü numune tutucuyu dikkatlice kaldırın ve numune kartuşuna geri yerleştirin. Kartuşun üst kısmındaki pimin kapaktaki deliğe girmesini sağlayarak kartuşun kapağını değiştirin. KriyoTEM ızgaralarında hazırlanan mikrokristallerin taramalı elektron mikrografileri minimum arka plan dağılımı gösterdi.
Izgara fazla sıvıdan arındırılmıştı ve kristalleri çevreleyen dar bir sıvı halesi gözlendi. Polihedral kristaller ayrı ayrı ve kümeler halinde gözlendi. Biraz daha büyük insülin kristalleri de izole kristallerle birlikte bazı topaklamalar gösterdi.
Çok büyük mikrokristaller de kriyoTEM ızgaralarına başarıyla monte edildi. Karbon destek filmindeki delikler açıkça görülüyordu, bu da güçlü şişkinlik olduğunu gösteriyordu. Birçok örnek, şişkinlik süresindeki değişim ve mikrokristallerin konsantrasyonu nedeniyle daha fazla optimizasyon gerektirdi.
Kristallerle aşırı yüklenen ızgaralar şişkinlik verimliliğini azaltır ve tek bir kırınım görüntüsünde birden fazla kafes kaydedilir. Yüksek viskoziteli kristalizasyon çözümleri için kısa şişkinlik süresi aşırı ıslak bir numuneye neden olabilir. Daha düşük viskoziteli kristalizasyon çözümü için, kısa bir şişkinlik süresi ızgaraların bir tarafındaki mikrokristallerin çalınmasına neden olur.
Optimum numune hazırlama, yüksek sinyal-gürültü oranıyla mümkün olan en yüksek çözünürlükte yüksek kaliteli x-ışını kırınım verileri toplamak için VMXm'in tüm yeteneklerinden yararlanmayı mümkün kılar. Kristalizasyon çözümünün ilk şişirmenin belirlenmesi, minimum örnek kullanmanın anahtarıdır. Örnek çok sınırlıysa, yoğunluk değerlendirmesini atlayın.
Sonuçta, seyreltilmiş bir örneğe sahip olmak daha iyidir. Bu numuneler artık VMXm Beamline'da x-ışını kırınım deneyleri, mikrokristal elektron kırınımı veya mikro ED'den önce odaklanmış iyon ışını frezeleme için hazırdır.
