Liz'in geliştirdiği protokol whitefly döllenme oranını belirlememizi sağlıyor. Bu tekniğiuygulamak, beyaz sineklerin davranış ve ekolojisini anlamamızı sağlayacaktır. Whiteflies haplodiploid, bu nedenle döllenme oranı oviposition seks oranına eşittir.
Bu protokol, bilgimize göre, beyaz sinekler için açıklanan ilk protokoldür ve üç saat içinde tamamlanabilir. Başlamak için, eklemek ve yetişkin whiteflies kaldırmak için Petri çanak kapağında gizli bir delik yapmak. Bir nem odası ayarlayın ve ince bir sonda yapmak için erimiş pipet ucu içine rahat bir çalışma açısında ince bir iğne takarak bir sonda moda.
İsteğe bağlı olarak, whitefly yumurta daha kolay kullanımı için ısı ile elongate cam pipet ipuçları. Sonra, dişi beyaz sinekler temiz bir yaprak üzerinde oviposit izin, bir Petri kabında agar sığacak şekilde kesilmiş. Whitefly oviposition sırasında, sabun ve su ile bir mikroskop slayt temizleyin.
İyi kurulayın ve sıvılar daha kolay görülebilir damla ve yumurta oluşturmak için izin vermek için bir ucu üzerinde parafin film bir parça germek. Yumurta dechorionate için, yetişkin kaldırma ve yumurta toplama hemen önce parafin film% 83 sodyum hipoklorit çamaşır suyu çözeltisi damla eklemek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Çamaşır suyu ve buzul asetik asit her ikisi de aşındırıcı.
Onlar bir başlık veya iyi havalandırılan alanda eldiven ile ele alınmalıdır. DAPI de bir tahriş edici ve eldiven ile ele alınmalıdır. Daha sonra, yaprak yetişkin beyaz sinekler çıkarın ve bir mikroskop altında yaprak yerleştirin.
Pedicel yaprak kaldırılır kadar dikkatle tabanından her yumurta kaldırın. Bu protokolü gerçekleştirmeden önce birçok yumurta üzerinde pratik yapın. Yumurtaların tabanından yavaşça kaldırın ve yumurta pedisel'in yapraktan çıkarıldığını görebildiğinizde tamamen yapraktan kaldırın.
Çamaşır suyu her damla için 2-3 yumurta aktarın ve 10 dakika bekletin. Yumurtaları onarmak için, çamaşır suyunu atmak için cam bir pipet kullanın. Sonra, buzul asetik asit damlaları ekleyin ve üç dakika bekleyin.
Sonra, buzul asetik asit kaldırmak ve Clarke çözeltisi damla ekleyin. Daha sonra, çözeltinin çoğu buharlaşana kadar 10 dakika bekleyin. % 70 etanol damla ekleyin ve 10 dakika tekrar bekleyin.
Yumurtaleke için, ilk herhangi bir artık etanol çıkarın. Sonra, pH'ı yediye yakın almak için yumurtalara 1xPBS damlaları ekleyin. Kurumasını önlemek için mikroskop kaydırasını nem odasına koyun.
30 dakika sonra, 1xPBS çıkarın ve mililitre DAPI başına 1 mikrogram damla ekleyin. Mikroskop kaydırasını karanlık bir nem odasına koyun ve en az 15 dakika bekleyin. Yumurtayıkamak için önce DAPI çözeltisini çıkarın.
Sonra yumurta 1xTBST damla ekleyin. Beş dakika sonra, 1xTBST kaldırın. Toplam üç yıkama için bu yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
Son yıkamadan sonra parafilmdeki tüm yumurtaları mikroskop kaydırağının temiz bir kısmına dikkatlice pipetleyin. Fazla TBST'yi çıkarın ve 20 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Son olarak, yumurta üstüne temiz bir kapak slayt yerleştirin, uzun süreli depolama için açık oje ile kapak slayt mühür, ve floresan mikroskop kullanarak görüntüleme devam.
DAPI nükleer boyama takip yumurta dechorionation bir floresan mikroskop ile gözlendiğinde döllenme ve embriyo seks atama izin verdi. Dişi pronükleus hem döllenmiş dişi yumurtanın hem de döllenmemiş erkek yumurtanın merkezine yakındır ve sperm sadece dişi yumurtanın tepeye yakın parlak bir çizgi olarak görülebilir. Bu tekniğin bir uygulama bakteriyel endosymbionts beyaz sineklerin birincil cinsiyet oranlarını etkileyip etkilemediğini belirlemektir.
Örneğin, Rickettsia enfekte ve enfekte olmamış B.tabici beyaz sinekler tarafından yatırılamış yumurtaların birincil cinsiyet oranları iki tedavide cinsiyet oranı arasında anlamlı bir fark göstermedi. Yetişkinliğe yetiştirilen yumurtalara gelince, Rickettsia'da enfekte olmuş ve enfekte olmamış yetişkinler için benzer sonuçlar görüldü, hiçbir kanıt sunmadı, en azından bu çalışmada, Rickettsia'ya bulaşmış dişiler tarafından daha fazla döllenme oranları için. Bu protokolü kullanarak, bir interspesifik sperm yumurta döllemek olup olmadığını belirleyebilirsiniz.
Döllenme gözlenmezise, bir geri ve sperm kadın spermatheca bakarak emzirme sırasında transfer olup olmadığını görmek için bakabilir. Döllenme gerçekleşirse, bir melez yavru gelişiminin canlılığını belirlemek için döllenme oranı ile yetişkinlerin cinsiyet oranı karşılaştırabilirsiniz.
