Diş posasından kök hücre elde etmek için standart bir yol kötü verimli, ve bu birkaç değişken bağlıdır. Protokolümüz, olguların %90'ında tedavi edilen dişlerden kök hücrenin başarılı bir şekilde izole edilmesine olanak sağladı. Birkaç hafta içinde çok sayıda hücre elde etmek en büyük avantajdır.
Bu bize rejeneratif tıp hücre kullanmak ve bu yararlı aracı ile diğer bilim adamları sağlayan bir biyobanka oluşturmak için izin verir. Diş açma işlemi Dr.Constantino Santacroce tarafından yapılacaktır. Daha sonra, protokol Stefano Martellucci, makalenin ilk yazarı benim laboratuvar, doktora öğrencisi tarafından gösterilecek.
Başlamak için, hastadan üçüncü azı zinasını ayıklayın, pbs ile hızlıca durulayın, orta ile 15 mililitrelik bir test tüpü koyun ve iki saatten az bir sürede laboratuvara aktarın. Bir biyolojik tehlike başlık altında, bir koronal kesme geçiş, paralel ve teğet, hamuru odasının çatı yoluyla diş açmak için bir kesici kullanın. Küçük bir ekskavatör ile, yavaşça hamuru çıkarın ve bir test tüpü yerleştirin.
Daha sonra PBS ile üç kez yıkayın ve 10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant çıkarın. Hank'in çözeltisindeki peleti yeniden askıya alın ve numuneyi petri kabına aktarın.
10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g santrifüj ile Hank çözeltisi çıkarın. Sonra, tek kullanımlık bir neşter ile, yaklaşık bir milimetre lik dilimler halinde hamuru bölmek ve tip IV kollajenaz bir mililitre ekleyin. Daha sonra, 10 dakika oda sıcaklığında 2, 500 kez g örnek santrifüj.
Supernatant çıkarın ve orta pelet resuspend. Kültür bir T25 şişesi kök hücreler için 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit özel. Kuluçka döneminde, kültür ortamını her üç günde bir değiştirin.
Yapışık hücreler birleştiğinde, hücrelere bir mililitre tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 derecede üç dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, tripsin eylemini durdurmak için bir-beş oranında dört mililitre kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonuna altı dakika boyunca 259 kez g'de santrifüj edin. Supernatant çıkarın.
Sonra, yaymak için bir T25 şişesine hücreleri yerleştirin. Daha sonra hücreleri bir mililitre tripsin-EDTA ile 37 derecede üç dakika ayırın. Hücre süspansiyonuna 259 kez g'de altı dakika santrifüj edin.
Supernatant çıkarın ve sitoflorimetrik analiz için hücreleri test etmeye devam edin. Geçici prion protein susturma adım gerçekleştirmek için, ilk kültür 24 saat boyunca kültür ortamı iki mililitre ile altı iyi plakalar insan diş hamuru kök hücreleri. Daha sonra, her numuneye küçük müdahale eden RNA PrP ortamının 400 mikrolitresini ekleyin ve onları 6 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
siRNA PrP ortamını atmadan, kültür ortamının 1,6 mililitresini bir-beş oranında ekleyin ve hücreleri 37 derecede 72 saat bekletin. Kuluçka döneminden sonra, supernatant çıkarın ve oda sıcaklığında üç kez PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra, nöronal kültür ortamının iki mililitre ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede bir kuvözde yedi ila 14 gün boyunca saklayın.
Kuluçka döneminden sonra hücreleri oda sıcaklığında üç kez iki mililitre PBS ile yıkayın ve nöronal yüzey antijenlerini test etmek için Batı leke analizine geçin. Nöronal indüksiyon işlemini gerçekleştirmek için, kültür 2 milyon insan diş hamuru kök hücreleri altı kuyu plakaları, kadar 28 gün posa ayırma. Her üç günde bir, supernatant atın.
Oda sıcaklığında iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve nöronal kültür ortamının iki mililitresini değiştirin. Yedi ila 14 gün sonra, hücreleri bir mililitre tripsin-EDTA ile 37 santigrat derecede üç dakika ayırın. Daha sonra, trypsin eylem durdurmak için bir-beş oranında kültür ortamı dört mililitre ekleyin.
Akış sitometri sitometri ile insan diş hamuru kök hücreleri karakterize etmek için, kültür kültür ortamının iki mililitre ile altı iyi plakalar hücrelerin mililitre başına 2 milyon. 28 gün post-dental hamuru ayırma veya nöronal kültür ortamı ile ek bir 14 gün sonra, hücreleri ayırmak için üç dakika için 37 derece santigrat tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Daha sonra, tripsin eylemini durdurmak için bir-beş oranında dört mililitre kültür ortamı ekleyin ve altı dakika boyunca oda sıcaklığında 259 kez g santrifüj edin.
PBS'de 300 mikrolitre %4 paraformaldehit ile tedavi edilmeyen veya tedavi edilmeyen hücreleri 10 dakika boyunca dört santigrat derecede düzeltin. Sonra, santrifüj, supernatant atın ve ek bir 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS% 1 non-iyonik yüzey aktif madde ile hücreleri permeabilize. Sonra, tekrar santrifüj, supernatant atın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında PBS bir mililitre% 5 yağsız kurutulmuş süt ile engelleme gerçekleştirin.
Bir mililitre PBS ile üç kez yıkayın ve hücreleri bir saat boyunca oda sıcaklığında anti-CD105, anti-CD44, anti-STRO-1, anti-CD90, anti-CD73, anti-beta-üç-tubulin, anti-NFH ve anti-GAP43 monoklonal antikorlarla kuluçkaya yatırın. Daha sonra, altı dakikalık aralıklarla pbs bir mililitre ile tekrar üç kez hücreleri santrifüj, ve sonra bir ek saat oda sıcaklığında anti-fare PE veya anti-tavşan CY5 monoklonal antikorlar ile kuluçka. Bağışıklık-pozitif hücreleri gating için ikincil antikorlar kullanın ve bir akış sitometre ile tüm örnekleri analiz.
Kültür 2 milyon hücre insan diş hamuru kök hücreleri mililitre başına altı iyi plakalar ile kültür ortamı iki mililitre. 21 ve 28 gün post-dental hamuru ayırma veya nöronal kültür ortamı ile ek bir yedi ila 14 gün sonra, hücreleri ayırmak için üç dakika boyunca 37 derece santigrat tripsin-EDTA bir mililitre ekleyin. Sonra, santrifüj, supernatant atın ve sonra 10 dakika boyunca dört derece santigrat pbs% 4 paraformaldehit ile örnekleri düzeltmek.
Sonra, santrifüj, supernatant atın ve sonra 10 dakika boyunca oda sıcaklığında PBS% 1 non-iyonik yüzey aktif madde ile permeabilize. Supernatant çıkarın ve bir saat boyunca oda sıcaklığında tavşan anti-PrP monoklonal antikor ile hücreleri leke. Son olarak, santrifüj, supernatant atın ve daha sonra ek bir saat oda sıcaklığında anti-tavşan CY5 monoklonal antikor ile kuluçka.
Akış sitometresi ile tüm örnekleri analiz edin. Posa ayrımından sonra, insan diş hamuru kök hücre kümeleri çevre üzerinde genişletildi. EGF/bFGF tarafından indüklenen nöronal farklılaşma dan önce ve sonra bu hücrelerin büyümesi arasında yapılan karşılaştırmada hücre morfolojisi ve nörit lerin büyümesinde önemli değişiklikler saptandı.
Tedavi edilmeyen insan diş hamuru kök hücreleri CD44, CD90, CD105, CD73 ve STRO-1 gibi çok güçlü mezenkimal stromal spesifik yüzey antijenleri ifade. Uygun nöronal indüksiyon uyaranlarından sonra, bu hücreler beta-üç-tubulin, NFH ve GAP43 gibi spesifik nöronal belirteçleri ifade etti. Tedavi edilmeyen veya tedavi edilmeyen hücreler CD14 ve CD19 gibi hematopoetik belirteçleri ifade etmedi.
28 gün sonra prion proteini insan diş posası kök hücrelerinde ilgili negatif kontrole göre erken ifade edildi ve EGF/bFGF tarafından indüklenen nöronal farklılaşma sürecinden sonra ekspresyonu arttı. Batı leke analizi, EGF/bFGF uyaranlarından önce sRNA tarafından prion proteininin susturulmasının nöronal belirteçlerin beta-üç-tubulin ve NHF ekspresyonunu engelleyerek insan diş posası kök hücrelerinin nöronal farklılaşma sürecini etkileyebileceğini göstermiştir. En önemli şey, hücreleri posadan ayırmak için enzimseçimidir.
Aslında, enzim çok agresif ise, hücreler zarar görebilir ve büyüme ve farklılaşma kapasitesi tehlikeye olabilir. Diş hamuru kök hücreleri rejeneratif tıp alanında in vivo ve in vitro çalışmalarda istihdam edilebilir mükemmel bir deneysel modeldir. PrP diş posakök hücrelerinin nöronal farklılaşma sürecinde önemli bir rol oynadığından, bu belirteç nörodejeneratif hastalıklarda etkili bir hedef olarak mükemmel bir aday olabilir.
Tavsiye etmek için en önemli yönü hastaların sağlık durumu, bulaşıcı hastalıkların yokluğu gibi.
