Bu farklılaşma için asal hücrelere herhangi bir kök hücre hattı veya farklılaşma protokolü uygulanabilir basit bir tedavi yöntemidir. Tek yapmanız gereken hücre kültürü bakım ortamına %1-2 oranında DMSO eklemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı, pluripotent kök hücrelerin farklılaşma potansiyelini, hücreleri farklılaşma için astarlayarak herhangi bir soyuna önemli ölçüde artırmasına olanak sağlamasıdır.
DMSO tedavisi, hücrelerin hasta kaynaklı iPSC'lerden ayırt edilerek hücre replasman tedavisi, hastalık modellemesi ve ilaç taraması için kullanılmasına olanak tanıyan şansı artırır. Embriyonik gelişim sırasında alt proliferasyon, farklılaşma ve spesifikasyonu kontrol eden düzenlemenin erken başlangıcına yol açabilir. DMSO tedavisinin yaklaşık 50 insan embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücre hatlarında farklılaşmayı artırdığını gösterdik.
Diğer laboratuvarlar fare ve primat gibi diğer türlerin kök hücreleri için yararlı olduğunu göstermiştir iken. Farklılaşmanın başlangıcından bir gün önce, tipik bakım ortamınıza 24 saat boyunca %1 veya %2'lik bir konsantrasyonla DMSO ekleyin. DMSO tedavisinden 24 saat sonra ortam değiştirin ve her zamanki farklılaşma protokolünüze devam edin.
El yazması talimatlara göre hücreleri büyütün. Hücreler uygun bir birleşimi ulaştığında, onları ayırmak ve tek bir hücre süspansiyon hazırlamak. Trippan mavisi gibi bir canlılık işareti kullanarak hemositometre veya otomatik hücre sayacı ile canlı hücreleri sayın.
24 saatlik DMSO ön arıtmada %80-90 biraraya gelmek için hücreleri 500,000 ila 1 milyon hücre arasında kaplanmış altı kuyulu bir plakaya yerleştirin. Hücreleri 24 saat boyunca karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra, medya aspire ve% 1-2 DMSO çözeltisi ile değiştirin.
Hücrelerin farklılaşmadan önce 24-28 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. 48 saat kuluçkaya yatsanız, 24 saat sonra ortamı taze DMSO solüsyonu ile değiştirin. 3D kültür farklılaşması elde etmek için, büyümek ve bir hücre süspansiyon hücreleri toplamak.
Canlı hücreleri sayın ve rock inhibitörü ile kök hücre medyasında kaplamasız, düşük bağlı altı iyi plaka içinde plakalayın. Tipik olarak, 3D insan pluripotent kök hücre küreleri 24 saat içinde oluşacaktır. Hücrelerin karbondioksit kuvözde 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin.
El yazması talimatlara göre önceden ısıtılmış kök hücre medyasında %1-2 DMSO hazırlayın. Kuluçkadan sonra ortamı değiştirmek için plakayı 30 derece ile 45 derecelik açıya doğru yatırın ve hücre kürelerinin kuyunun dibine yerleşmesine izin verin. Hücreleri aspirasyon ve yavaşça DMSO çözeltisi onları yeniden askıya.
Hücrelerin karbondioksit kuvözde 37 derecede 24-48 saat kuluçkaya yatmasını bekleyin. 2B kültürler için açıklandığı şekilde DMSO'lu hücreleri önceden tedavi edin ve noggin ve SB431542 stok çözümleri hazırlayın. Üç ila dört günlük medya değişikliği için nakavt DMEM'de yeterli %10 nakavt serum replasmanı veya KOSR hazırlayın.
El yazmasında açıklandığı gibi önceden ısıtılmış KOSR nakavt DMEM'e noggin ve SB431542 ekleyerek ektodermal farklılaşma ortamı hazırlayın. DMSO ön işlemden sonra, hücrelerden aspirasyon ortamı ve her kuyuya iki mililitre farklılaşma ortamı ekleyin. Hücrelerin 37 santigrat derecede karbondioksit inkübatörde üç ila dört gün kuluçkaya yatırmasına izin verin, her gün medyanın yerine taze farklılaşma faktörleri verin.
DMSO ön tedavi, tedavi edilmeyen hücrelere göre hücre büyüme hızında geçici ve doza bağlı bir düşüşe neden olur. Bu azalma çoğalması hücreden hücreye temasbir artış ile ilişkilidir, özellikle belirgin olan 2%DMSO tedavi hücrelerde. Hücreler her mikrop tabakasının prototimopik belirteçleri için sabit ve lekeli olduğunda, bu farklılaşmış mikrop tabakası hücrelerinin artan oranda% 2 DMSO ön tedavi sonuçları görülebilir.
Örneğin, SOX17 endoderm hücrelerini görselleştirmek için lekeli oldu. DMSO'nun merkezi sinir sistemi progenitor hücre tiplerine farklılaşma üzerindeki etkisini araştırmak için, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler nöral progenitor hücrelere veya oligodendrocyte progenitor hücrelere farklılaştırılabilir. Kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, 2% DMSO ön tedavi nöral progenitor hücre belirteci Pax6 ifadesini artırır.
Benzer şekilde, ön tedavi oligodendrocyte progenitor hücre belirteci Olig2 ifade hücrelerinin oranını artırır. Ayrıca, ilk DMSO tedavisi in-vivo transplantasyon sonrasında insan embriyonik kök hücre kaynaklı hücre fonksiyonunu geliştirir. Farklılaşmış pankreas atası hücreleri immünoeksik farelere nakledildiğinde, işlevleri glikoz zorluğuna veya KCl stimülasyonuna yanıt olarak test edilebilir.
Hücre işlevselliğinde iyileşmeler iki haftadan 16 haftaya kadar transplantasyon sonrası belirgindir. Dikkate alınması gereken en önemli husus, kök hücrelerinizin bisiklete binme veya iki katına çıkarma süresidir. DMSO tedavisinin uzunluğu hücrelerin bisiklet süresi ile aynı olmalıdır.
İlk DMSO tedavisinin ardından, tedavi hücre döngüsünün G1 fazında büyümeyi teşvik yardımcı olarak, hücre çoğalması ve hücre döngüsünün kök hücrelerde nasıl düzenlendiğini anlayabiliriz. Diferansiye hücreler hastalıkla ilgili mekanizmaları anlamak için, diğer hücre tipleri ile birlikte, tümörijenite tahlillerinde ve fonksiyonel tahlillerde veya transplantasyon çalışmalarında, farklılaşmış hücrelerin bir hastalık fenotipini kurtarıp kurtaramayacağına karar vermek için kullanılabilir.
