İç içe rt-PCR tüm Lyssaviruses tespit etmek için geliştirilmiştir, tüm dahil olmak üzere 16 ICTV onaylı ve iki roman Lyssavirus türleri. Bu yöntemin doğrulanması Çin'de klinik kuduz tanı ve gözetim 10 yıl içinde 9000'den fazla hayvan beyin örnekleri kullanılarak kanıtlanmıştır. İç içe olan RT-PCR sadece taze beyin dokusu örneklerinde değil, aynı zamanda bozulmuş numuneler üzerinde de inandırıcı sonuçlar üretebilir.
Bu yöntemin su baskını, beyin omurilik sıvısı, tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerini tahsin etmek için kullanılabilir, böylece bu yöntem ültimatom tanılarına uygulanabilir. PCR taşıma kontaminasyonunu en aza indirmek için, negatif ve pozitif kontroller hazırlamak önemlidir Adımlar atmak gerçekten önemlidir. Örneğin, her RNA ekstraksiyon için hazırlanması gereken, PCR kurmak ve jel elektroforez fiziksel olarak ayrı alanlarda çalıştırılmalıdır.
Ayrıca, peptid zincirinde kuduz kontaminasyonunu önlemek için RNA ekstraksiyonu ve ters transkripsiyonda spiral bantların kullanılması tavsiye edilir. Ajanlarınızı buzüzerinde hazırlamak, eldivenlerinizi düzenli olarak değiştirmek ve ribonükleaz içermeyen malzemelerin kullanılması ribonükleaz girişini önler ve RNA'nın bozulmasını önler. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi kuduz şüphesi doku, deri biyopsisi, tükürük, beyin omurilik sıvısı veya RABV enfekte hücre kültüründen RNA ayıklayın.
Devam etmeye hazır olduğunuzda, gerekli reaktifleri dondurucudan alın ve buzda tutun. Kullanmadan önce her reaktifi eritmeye ve girdap haline getirin. CDNA'ya viral RNA'nın ters transkripsiyonu için buz üzerindeki her örnek için 12 mikro litre reaksiyon karışımı ve bir temiz odada metin protokolünün Tablo 1'inde belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik santrifüj tüpü hazırlayın.
Pipetleme varyasyonlarını hesaba katmak için, gerekenden en az bir reaksiyon boyutu daha büyük bir ana karışım hacmi hazırlayın ve ardından reaksiyon karışımını 0,2 mililitrelik PCR tüplere bölün. Şablon odasındaki bir PCR iş istasyonunda, reaksiyon karışımına numunenin veya kontrollerden birinin sekiz mikrolitresini ekleyin. Pozitif kontrol sabit RABV suşu CVS11 ile enfekte hücre kültüründen çıkarılan RNA ise negatif kontrol Rnase içermeyen çift distile su içerir.
Her tüpün içeriğini ilk girdap ve kısa bir süre santrifüj ederek karıştırın. Bundan sonra reaksiyon tüplerini bir termocycler'a yükleyin. Metin protokolünde belirtildiği gibi cDNA sentez programını ayarlayın ve çalıştırın.
İlk olarak, gerekli reaktifleri alın ve kullanıma hazır olana kadar temiz bir odada buz üzerinde tutun. Hazır olduğunuzda, çözülme ve girdap reaktifler. Daha sonra, metin protokolünün Tablo 2'sinde belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpteki her numune için 48 mikrolitre ilk yuvarlak PCR karışımı hazırlayın ve reaksiyon karışımını 0,2 mililitreLIK PCR tüplere bölün.
Şablon odasındaki bir PCR iş istasyonunda, ilk yuvarlak PCR karışımına iki mikrolitrelik cDNA örneği ekleyin. Pozitif kontrol olarak iki mikrolitre CVS11 cDNA ve negatif kontrol olarak iki mikrolitre çift distile su ekleyin. Ardından, mühürlü tüpleri metin protokolünün Tablo 3'te listelenen parametrelerini kullanarak pcr termocycler ve döngüye aktarın.
Başlamak için, metin protokolünün Tablo 4'te belirtildiği gibi 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpteki her numune için 48 mikrolitre ikinci yuvarlak PCR karışımı hazırlayın ve reaksiyon karışımını 0,2 mililitreLIK PCR tüplere bölün. İkinci tur PCR karışımına ilk tur PCR ürününden iki mikrolitre ekleyin. PCR bu tur için negatif bir kontrol olarak çift distile su ekleyin.
Daha sonra, metin protokolünün Tablo 3'te listelenen parametreleri kullanarak PCR termobisikletgerçekleştirin. İlk olarak, Tris-asetat EDTA 100 mililitre agarose 1.5 gram ekleyin ve iyice eritmek için bir mikrodalga fırında ısıtın. Daha sonra, %0.01'lik son konsantrasyonda ethidyum bromür ekleyin Jeli kalıba dökün ve en az 30 dakika ortam sıcaklığında katılaşmaya bırakın.
Yükleme örneklerini, her PCR ürününden beş mikrolitreyi bir mikrolitre 6x yükleme tamponu ile karıştırarak hazırlayın. Ayrı ayrı kuyulara örnekleri ve uygun DNA belirteci yükleyin ve boya hattı jel aşağı yaklaşık% 75-80 olana kadar 120 volt yaklaşık 30 ila 45 dakika jel çalıştırın. Çalışma tamamlandığında, gücü kapatın ve elektrotları güç kaynağından ayırın.
Daha sonra jeli dikkatlice jel kutusundan çıkarın. DNA parçalarını görselleştirmek ve fotoğraflamak için bir UV jeli belgeleme cihazı kullanın. İç içe geçen ters transkripsiyon PCR'yi metin protokolünde belirtildiği şekilde karakterize edin.
18 Lyssavirus türünü tespit etmek için iç içe bir RT-PCR'nin sonuçları burada gösterilmiştir. PCR pozitif kontroller, beklenen bandı ilk turda 845 baz çiftinde ve ikinci turda 371 baz çiftinde gösterir. Negatif kontroller için bant görülmez.
18 Lyssaviruse'ın da pozitif kontrolle aynı iki bandı ürettiği görülür ve iç içe geçen RT-PCR'nin 18 Lyssavirüs'ün tümini tespit ettiğini gösterir. Plazmidlerin 16'sı iki tur PCR'de etkili amplifikasyona sahipken, ikisi Aravan virüsü ve Ikoma virüsü sırasıyla birinci veya ikinci turda yükseltilir. Yöntemin duyarlılığı farklı Lyssavirus plazmidlerin saptanmasında, mikrolitre başına 2,24 ile 240 molekül arasında değişen değerlerarasında farklılık gösterir.
Bu farklılıklar, viral dizi çeşitliliği nedeniyle astarlar ve şablonlar arasındaki uyuşmazlıklara bağlanabilir. İç içe pcr ile test edilen klinik örneklerden 9,624 beyin dokularının fat ile test edilenlerle karşılaştırılması, iç içe geçen RT-PCR'nin %100 hassasiyet ve özgüllük olarak %99,97 oranında olduğunu göstermektedir. Tüm on laboratuvar, iç içe vraklı RT-PCR'nin yüksek özgüllüğe ve tekrarlanabilirliğe sahip olduğunu gösteren, yanlış negatif veya yanlış pozitif olmayan, FAT'e uygun olarak %100 iç içe RT-PCR sonuçları elde etmiştir.
RT-PCR artık Kuduz teknolojilerini kullanmak için OIE tarafından tavsiye edilir. Ve iç içe olan RT-PCR'miz 2018 yılında Çin'de kuduz teknolojilerinin ulusal standardı olarak kanıtlanmıştır.
