O RT-PCR aninhado foi desenvolvido para detectar todos os Lyssaviruses, incluindo todas as 16 ictv aprovadas e duas novas espécies de Lyssavirus. A validação deste método foi comprovada utilizando mais de 9.000 amostras cerebrais animais em 10 anos de diagnóstico e vigilância clínica da raiva na China. O RT-PCR aninhado não só pode produzir resultados críveis em amostras de tecido cerebral fresco, mas também em amostras degradadas.
A inundação deste método pode ser usada para avaliar amostras de fluidos biológicos, como fluido cefalorraquidiano, saliva e urina, assim este método pode ser aplicado em diagnósticos de ultimato. Para minimizar a contaminação por transporte da PCR, é importante preparar controles negativos e positivos É muito importante tomar medidas. Por exemplo, para cada extração de RNA precisa de preparação, a configuração do PCR e a eletroforese de gel devem ser operadas em áreas fisicamente separadas.
Também é recomendado o uso de fitas espiral na extração de RNA e transcrição reversa, a fim de evitar a contaminação da raiva na cadeia de peptídeos. O manuseio adequado, como preparar seus agentes no gelo, trocar luvas regularmente e usar materiais livres de ribonuclease, impedirá a introdução de ribonuclease e eliminará a degradação do RNA. Para iniciar este procedimento, extrair o RNA de tecido suspeito de raiva, biópsias de pele, saliva, fluido cefalorraquidiano ou cultura celular infectada pelo RABV, conforme descrito no protocolo de texto.
Quando estiver pronto para prosseguir, remova os reagentes necessários do congelador e mantenha-os no gelo. Certifique-se de descongelar e vórtice cada reagente antes de usar. Para transcrição reversa do RNA viral para cDNA prepare 12 micro litros de mistura de reação para cada amostra no gelo e um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 1 do protocolo de texto em uma sala de limpeza.
Para explicar as variações de pipetação, prepare um volume de mixagem mestre pelo menos um tamanho de reação maior do que o necessário e, em seguida, divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro. Em uma estação de trabalho PCR em uma sala de modelo, adicione oito microliters da amostra ou um dos controles à mistura de reação. O controle positivo é extraído da cultura celular infectada com a cepa CVS11 de rabv fixo, enquanto o controle negativo contém água dupla destilada sem Rnase.
Misture o conteúdo de cada tubo pelo primeiro vórtice e, em seguida, por centrifugação breve. Depois disso, carregue os tubos de reação em um termociclador. Configure e execute o programa de síntese cDNA conforme descrito no protocolo de texto.
Primeiro, recupere os reagentes necessários e mantenha-os no gelo em uma sala de limpeza até estar pronto para usar. Quando estiver pronto, descongele e vórtice os reagentes. Em seguida, prepare 48 microliters de mix pcr de primeira rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 2 do protocolo de texto e divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro.
Em uma estação de trabalho PCR em uma sala de modelo, adicione uma amostra de dois microliter do cDNA no mix PCR da primeira rodada. Inclua dois microliters de CVS11 cDNA como um controle positivo, e dois microliters de água dupla destilada como um controle negativo. Em seguida, transfira os tubos selados para um termociclador PCR e pedale usando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto.
Para começar, prepare 48 microliters de mix pcr de segunda rodada para cada amostra em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito na Tabela 4 do protocolo de texto e divida a mistura de reação em tubos PCR de 0,2 mililitro. Adicione dois microliters do produto PCR da primeira rodada no mix PCR da segunda rodada. Inclua água dupla destilada como um controle negativo para esta rodada de PCR.
Em seguida, execute o termociclismo PCR utilizando os parâmetros listados na Tabela 3 do protocolo de texto. Primeiro, adicione 1,5 gramas de agarose a 100 mililitros de Tris-acetato EDTATE e aqueça-o em um forno de micro-ondas para dissolvê-lo completamente. Em seguida, adicione brometo de etídio a uma concentração final de 0,01% Despeje o gel no molde e deixe-o solidificar à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos.
Prepare as amostras de carregamento misturando cinco microliters de cada produto PCR com um microliter de 6x tampão de carga. Carregue separadamente as amostras e o marcador de DNA adequado nos poços e execute o gel por aproximadamente 30 a 45 minutos a 120 volts até que a linha de corante esteja aproximadamente 75 a 80% abaixo do gel. Quando a corrida estiver concluída, desligue a energia e desconecte os eletrodos da fonte de energia.
Em seguida, remova cuidadosamente o gel da caixa de gel. Use um dispositivo de documentação de gel UV para visualizar e fotografar os fragmentos de DNA. Caracterize o PCR de transcrição reversa aninhado conforme descrito no protocolo de texto.
Os resultados de um RT-PCR aninhado representativo para detectar 18 espécies de Lyssavirus são mostrados aqui. Os controles positivos do PCR mostram a banda esperada em 845 pares de base na primeira rodada e em 371 pares de base para a segunda. Nenhuma banda é vista para os controles negativos.
Todos os 18 Lyssaviruses são vistos produzindo as mesmas duas bandas que o controle positivo, indicando que o RT-PCR aninhado detectou todos os 18 Lyssaviruses. Enquanto 16 dos plasmídeos têm amplificação eficiente em duas rodadas de PCR, dois deles, o vírus Aravan e o vírus Ikoma, são amplificados apenas na primeira ou segunda rodada, respectivamente. A sensibilidade do método varia na detecção de diferentes plasmídeos lyssavírus, de valores que variam de 2,24 a 2.240 moléculas por microliter.
Essas diferenças podem ser atribuídas aos desencontros entre os primers e os modelos devido à diversidade de sequências virais. Uma comparação de 9.624 tecidos cerebrais de amostras clínicas que são testadas por PCR aninhado versus aqueles testados com FAT mostra que o RT-PCR aninhado como sensibilidade de 100% e uma especificidade de 99,97%A concordância entre os dois métodos é de 99,07%Dez outros laboratórios de raiva foram convidados a realizar o teste para validar ainda mais o RTD-PCR. Todos os dez laboratórios obtiveram resultados aninhados de RT-PCR que estão 100% de acordo com o FAT, sem falsos negativos ou falsos positivos, indicando que o RT-PCR aninhado tem alta especificidade e reprodutibilidade.
O RT-PCR agora é recomendado pela OIE para o uso de tecnologias de raiva. E nosso RT-PCR aninhado foi provado como o padrão nacional de tecnologias antirrábicas na China em 2018.
