Protein sentezi hataya yatkındır. Ancak, hatalar fizyolojik stres altında adaptif olabilir. Daha önce mikobacterium'daki belirli çeviri hatalarının antibiyotik toleransına katkıda bulunduğunu göstermiştir.
Belirli hata oranlarını ölçebilmek bu bakteri-adaptif mekanizmayı hedeflememizi sağlar. Bu tekniklerin başlıca avantajları, kütle spektrometresi ile tespit edilmesi kolay olmayan küçük hata oranlarının ölçülmesinde fonksiyon kazancı muhabirlerinin son derece hassas olmasıdır. Nluc/GFP tnösü, bakterilerin aşırı yol tutuşu ve düzgünkullanımını önleyemediği için orta işlem taramasına olanak tanır.
Prosedürü gösteren doktora öğrencisi Yue-Meng Chen olacak. Bugün bu iki muhabiri bu video aracılığıyla kullanma prosedürünü göstereceğiz. Başlamak için, yabani tip ve mutasyona uğramış mikobakteriyel muhabir suşları ile 7H9 orta iki mililitre aşılamak.
Bir ila iki gün veya 600 nanometrede OD sabit faza ulaşana kadar 37 derecede salla. Aliquot ve 0,5-1 civarında 600 nanometre bir OD elde etmek için seyreltin. Sonra, mililitre başına 50 nanogram son konsantrasyona ATC ekleyin.
Hemen yanlış çeviri oranları üzerindeki etkilerini ölçmek için el yazmasına göre kültüre farklı dozlarda ksg ekleyin. 37 derecede 4-6 saat sallayarak kuluçka. Sonra, bakteri kültürlerini iki mililitrelik bir tüpe aktarın.
Ve 3, 220 kez oda sıcaklığında beş dakika boyunca bakteri aşağı pelet santrifüj. Santrifüj adımından sonra, supernatant atın ve 1x pasif lysis tampon 40 mikrolitre ekleyerek bakterileri bozun. Resuspended bakteriyel lizate beyaz bir 96-well plaka, örnek başına bir kuyu ya da 20 dakika oda sıcaklığında sallayın aktarın.
Her kuyuya 80 mikrolitre ateş böceği substratı ekleyin. 15 saniye çalkalayın ve parlaklığı bir luminometre ile ölçün. Sonra, her kuyuya 80 mikrolitre Renilla substratı ekleyin.
15 saniye çalkalayın ve parlaklık luminometre ile ölçün. Her koşulun yanlış çeviri oranlarını hesaplamak için düzeltilen değerleri kullanın. Başlamak için, bakteriyel muhabir suşu ile 7H9 orta iki mililitre aşılamak.
Bir ila iki gün veya 600 nanometrede OD sabit faza ulaşana kadar 37 derecede salla. Daha sonra, 7H9 orta 50 mililitre alt kültür ve 600 nanometre de OD geç sabit faza ulaşana kadar büyür. 96-iyi plaka için bakteri aliquoting önce, mililitre başına 50 nanogram son konsantrasyonda ATC ekleyin ve iyice karıştırın.
Net, yuvarlak dipli 96-iyi plaka iyi başına 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, yanlış çeviri oranları üzerindeki etkilerini taramak için seçilen kuyulara farklı dozlarda ksg ekleyin. Numune kuyularından buharlaşmayı sınırlamak için plakanın kenar kuyularına 200 mikrolitre steril su ekleyin.
Plakayı kapatın, titretin ve numuneleri 16 ila 20 saat boyunca 37 derecede ikna edin. Her kuyudan 80 mikrolitre almak için çok kanallı bir pipet kullanın. Örnekleri siyah dipli 96 kuyulu bir plakaya aktarın ve GFP sinyalini luminometre ile ölçün.
GFP sinyalini ölçtükten sonra, plakayı 3, 220 kez 10 dakika santrifüj edin. Daha sonra, 50 mikrolitre süpernatantı beyaz dipli 96 kuyulu bir plakaya aktarın. Sonra, her kuyuya 50 mikrolitre Nluc substrat ekleyin.
İyi karıştırın ve parlaklık luminometre ile ölçün. Son olarak, düzeltilmiş Nluc parlaklık değerini GFP floresansa bölerek Nluc/GFP oranını belirleyin. Bu çalışmada, Renilla firefly muhabir sistemi yabani tip kasugamycin varlığında yanlış çeviri oranını ölçmek için kullanılan ve KsgA silindi S.Smegmatis bir suş.
Sonuçlar ksg azalan yanlış çeviri oranı net bir dozbağımlı şekilde ksg-silme zorlanma iken, ksg daha az güçlü ve yanlış çeviri oranı nın temel kasugamycin tarafından modülasyon direnci nedeniyle daha yüksek olduğunu gösterdi. Kasugamycin'in yanlış çeviri ye ilişkin eylemi de Nluc/GFP muhabiri kullanılarak ölçüldü. Hem Renilla firefly ve Nluc / GFP muhabiri luciferase aktivitesi ölçme içerir.
Küçük pipetleme hataları okumalarda büyük dalgalanmalara neden olabilir. Yeni başlayanlar için, güvenilmez okumaalma olasılığını en aza indirmek için her çoğaltma nın sayısını artırmanızı öneririz.
