Biz özellikle Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau ve Mandy Roscher yılında, DKFZ virüs üretim ve geliştirme biriminin ekip teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Eğitim ve Araştırma (BMBF) ve Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est Uygulamalı Tümör Viroloji ortak Programı çerçevesinde Helmholtz Topluluğu Federal Bakanlığı tarafından desteklenen hibe edilmiştir.

Biyogüvenlik düzeyi 2 olan bir laboratuvar rekombinant parvoviruses (recPV) üretimi için gerekli olduğunu unutmayın. Protokol, iki ana bölümden ayrılır. Birinci kısım (transfeksiyon ile recPV üretimi) protokolü ikinci bölümü (enfeksiyonu yoluyla recPVs üretiminde) inokulum olarak hizmet recPVs minimal miktarda üretmek için gereklidir. Bir kez recPVs küçük bir miktar protokolünün birinci bölümü atlanabilir, üretilen ve rekombinant parvovirüsü, sadece adenovirüs helper yoluyla parvovirüsü kapsid proteinler (bkz. aşağıda) için gen kodlaması sağlayan enfeksiyonu yoluyla amplifiye edilebilir. 1. Transfeksiyon üzerinden recPVs Üretimi 1.1 Viral DNA transfeksiyon Bu ya da katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat dayalı protokol, bu bölümde oluşturulan bir DNA transfeksiyon yöntemi kullanmak mümkündür. Biz genellikle Fugene H kullanırD Transfeksiyon Reaktif. Transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için bir plazmid ifade gelişmiş Yeşil floresan proteini (örneğin pEGFP-N1, Clontech) ile ilave plaka transfekte öneririz. Hücre nüfusunun en az% 50 EGFP-pozitif 24 saat sonra, transfeksiyon sonucunda meydana transfeksiyon verimli ve virüsünün üretimi için optimal olarak kabul edilir. <ol><li> Transfeksiyon günde% 50 hücresel konfluent elde etmek için bir 10 cm plakası, içinde transfeksiyonuyla, tohum 2.000.000 HEK293T hücreleri daha önce 1 saat. % 10 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, 100 ml penisilin başına U ve 100 ug / ml streptomisin ilavesiyle Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 10 ml hücre büyümesi. </li><li> 1.5 ml tüp virüs verme karışımı (01:02:01 molar oranı) hazırlayın: <ol class="lalpha"><li> RecPV vektörünün 3 ug ilgi transgen (EI hastayı-1-GFP 6) barındıran. </li><li> Vektör pCMV / VP 5 6 mikrogram parvovirus kapsid gen birimi barındıran </li><li> 8 mikrogram of adenovirüs kökenli yardımcı plazmid pXX6 7. </li></ol></li><li> 850 ul (20 ul / ng nihai konsantrasyon) ile serum içermeyen aracı kadar olan plazmid karışımı ile seyreltilir. </li><li> 42.5 ul Fugene HD (: mikrogram DNA 2.5:1 oranı ul Fugene) ekleyin. Orta Fugene eklerken tüp tarafında dokunmayın. </li><li> 5-10 saniye yavaşça vorteksleyin. </li><li> 30 dakika oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Transfeksiyon karışımı hücrelere damla-akıllıca ekleyin. Eşit boyunca karışımı dağıtmak için hafifçe sallayın plaka. </li></ol> 1.2 Virüs üretim <ol><li> Hasat önce 72 saat boyunca% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe plakası. Bu süre içinde soyu parvovirüsü parçacıklar parvovirüsü plazmit ile oluşturulmaktadır. </li></ol> 1.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü davlumbaz, bir 15 içine plakadan süspansiyon, bunların orta içinde hücreleri sıyırmak ve transfer aspireml plastik tüp. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje tüpü. </li><li> Üstte kalan% 95 çıkarın. </li><li> Vorteks tüpü yavaşça geri kalan süpernatan (0.5 ml) içine pelletini için. </li><li> -80 Azından tüp dondurmak ° C. Bu aşamada, üretim durdurmak ya protokolü ile birlikte devam etmek mümkündür. </li><li> Süspansiyon eritmeyi ve oda sıcaklığında getirmek. </li><li> 37 sıcak su, sıvı azot banyo ve çözülme içinde süspansiyon Freeze ° C Vortex gayretle 15 saniye için ve donma-çözülme çevrimi fazla iki kez tekrarlayın tüpler. </li><li> 4 azından 15 dakika süreyle 16,000 x g&#39;de santrifüje tüpler ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, tüp ham virüsü ekstresi preparatı içerir. </li><li> Virüs titrasyon (bkz. aşağıda) ile devam edin. GFP genini taşıyan recPV için tipik bir üretim yaklaşık 1 tekabül eden 1-3 x 10 7 viral enfeksiyon birimleri vermelidir -3 x 10 10 viral genom parçacıklar içeren. </li></ol> 1.4 Virüs depolama <ol><li> Uzun süreli saklama için -80 az ham virüs özü içeren tüp dondurmak ° C Bu protokolün bir ikinci bölümünde aşı malzemesi olarak ham viral ekstreler kullanmak mümkündür. </li></ol> 2. Enfeksiyon ile recPVs Üretimi Enfeksiyon yoluyla recPV üretim başlamadan önce, üretmek ve Adenovirüs standart protokol 8&#39;e göre parvovirus VP gen (Ad-VP yardımcısı, 5 açıklanan) taşıyan 5 arındırmak. Aynı zamanda ilgi transgen (örn., yukarıda açıklandığı gibi transfekte yoluyla üretilen) taşıyan recPVs minimal miktarda olması gereklidir. Aşağıda, 175 cm 2 şişe (T175) biçiminde recPV üretimini açıklar. Bu şekilde üretilen virüsü stokunun daha da çok katlı amplifikasyon 10 CellSTACK kültürü odalarına (Corning) içinde gerçekleştirilebilmektedirprotokolünün küçük ayarlamalar teklif ile. 2.1 Enfeksiyon <ol><li> Enfeksiyon günde% 60-80 hücresel konfluense elde etmek için bir T175 şişesi enfeksiyon, plaka 10 milyon NB324K hücreleri 1 gün öncesine. Bir kontrol olarak hücreler aynı sayıda (non-enfekte olmuş hücreler) içeren ikinci bir şişe hazırlayın. Her T175% 5 fetal bovin serumu, 2 mM L-glutamin, ml başına Penisilin 100U ve 100 ug / ml streptomisin ile desteklenmiş bir son hacim olarak Minimum Essential Medium (MEM) 20 ml sahip olmalıdır. </li><li> Ertesi sabah oluşan bir 2 ml plastik tüp içinde virüsü karışımının hazırlanması: <ol class="lalpha"><li> Enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı, enfeksiyöz birim / hücre) de Ad-VP-helper 5 = 10 (1 x 10 8 enfeksiyöz birim karşılık gelen); </li><li> MOI azından recPVs = 0.5 (5 x 10 6 enfeksiyöz birim karşılık gelir). MEM ile 1.5 ml&#39;ye tamamlayın. </li></ol></li><li> T175 şişeye birinde tamamını virüsü karışımı geçerlidir. </li><li> Inkübe37 de 2 saat için şişeye ° C,% 92 nem,% 5 CO2 yavaşça her 15 dakikada çalkalama. </li><li> 37 daha az 20-24 saat boyunca inkübe ° C,% 92 nem,% 5 CO2. </li><li> Taze ortam ile kültürel ortamı değiştirin. </li></ol> 2.2 Virüs üretim 48 saat süreyle% 92 nem,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de inkübe şişeler. Etkin viral üretim göstergesi olarak, sitotoksisite açık işaretleri 36-48 saat sonrası enfeksiyon başlamadan, viral enfekte hücre içeren şişeyi dikkat edilmelidir. 2.3 Virüs hasat <ol><li> Bir doku kültürü olarak davlumbaz, aspire ve bir 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne şişesi orta süpernatan transfer. </li><li> 1.5 ml PBS ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> % 0.25 Trysin-EDTA 1.5 ml hücreleri Trypsinize. Çıkarıldı ve orta hücre süspansiyonu ilave edin. </li><li> Oda sıcaklığında, 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de hücreleri ve süpernatan santrifüjebelgelendiğinden. </li><li> Süpernatant atın. </li><li> Hücre topağı ve yavaşça vorteks hücreleri yeniden süspanse etmek tüpüne TE tampon 1 ml (1 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA, pH 8.7) ilave edilir. </li><li> 37 sıcak su içinde bir sıvı azot içinde çözülme banyo ve hücre süspansiyonu dondurmak ° C. 15 sn için tüp şiddetle Vortex ve donma-çözülme döngüsü üç kez tekrarlayın. </li><li> Hücre genomik ve non-paketlenmiş viral DNA&#39;lar sindirimi için, 37, 30 dakika için 50 U / ml Benzonase Nükleaz ° C ile hücre süspansiyonu Treat. </li><li> 4 de 20 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüje tüp ° C. </li><li> Taze bir tüp içine süpernatant toplayın. Bu aşamada, süpernatan ham virüsü ekstresi preparatı içerir. RecPV-GFP tipik verimleri Bu protokol 1-10 x 10 8 viral enfeksiyon birimlerinin aralığında olmalıdır takiben üretilir. </li></ol> 2.4 Virüs depolama <ol><li> 4 ° C&#39;de kısa süreli depolama için (en fazla 2 ay), mağaza virüs </li><li> Lon için-80 at g süreli saklama (daha uzun süre 2 ay), mağaza virüs ° C </li></ol> 3. RecPV Arıtma <ol><li> Ham lizatları gelen recPVs saflaştırılması için, Zolotukhin ark göre bir iodixanol süreksiz degrade çalıştırmak için önerilir. 9. Bu etkin virüsü saflaştırılması için ham özütü viral (beş T175 şişeler üretim elde) 5 ml en az kullanılarak önermektedir. </li></ol> 4. Rekombinant Parvovirus Titrasyon <ol><li> El-Andaloussi ark açıklandığı gibi recPV titrasyonu gerçekleştirmek. 5 </li></ol> 5.. Kalite Denetimleri <ol><li> NB324K göstergesi hücrelerinde parvovirüsü plak assay yürüten istenmeyen virüslerin kopyelemeye yetkin (RCV) varlığında kontrol etmek için El-Andaloussi ve ark. 5 anlatılan protokolde kullanabilir. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar RecPVs productio bir örneğin adenovirüs genomik elemanlarının varlığında veya yokluğunda, transfeksiyon yoluyla Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Hücreler hastayı-1-GFP (a recPV GFP geni barındıran) veya hastayı-1-lusiferaz (a recPV ateşböceği lusiferaz geni barındıran) ile birlikte pCMV / VP (VP parvovirüsü kapsid proteinleri için kodlayan gen taşıyan plazmid) ile transfekte edildi ile (+ pXX6) veya olmayan (-pXX6) pXX6 plazmid (adenovirüs taşıyan E2A, E4 (orf6) ve VA RNA genleri). Ham hücre ekstreleri arasında eşit hacimde El-Andaloussi ark bildirildiği gibi hücreler ve GFP transdüksiyon ya lusiferaz deneyleri yapıldı. 5 NB324K uygulanmıştır. RecPVs üretiminde belirgin bir artış bizim yöntemi (Şekil 3A, B) takiben elde edilen yaklaşık 5 TU / hücre geleneksel protokollere göre üretim 0,3 GFP transductional birimleri (DS) / hücreden artan pXX6 varlığında elde elde edildi. RecPV verimlilik önemli bir artış (24-kat yaklaşık)ayrıca hastayı-1-lusiferaz (Şekil 3C) söz konusu gözlenmiştir. Bu sonuçlar pXX6 içerdiği genetik malzeme parvovirüsü üretimi artırmak için mümkün olduğunu göstermiştir. Enfeksiyonu yoluyla recPVs üretim temsili bir örnek, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. NB324K hücreleri çeşitli recPVs (şekilde gösterildiği) ve Ad-VP-helper (PV VP kapsid proteinleri kodlayan gen barındıran) ile ko-enfekte edildi. Kadar Ad-VP yardımcısı daha gelişmiş recPV üretime&gt; istenmeyen çoğaltma yetkili viral parçacıkların (Şekil 4B) oluşumunu artırmadan numaralı seribaşı hücre başına 70 TU (Şekil 4A). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> Şekil 1.. Vektörler özerk parvoviruses dayanmaktadır. (A) Üst: transgen VP-kodlayan genlerin kısmını değiştirir ve viral promotor P38 kontrolü altındadır. NS1 / 2 için genlerin rebakımlı ve bunların ifade viral promotör P4 tarafından kontrol edilir. Vektör genom kopyelenmesi ve rekombinant genomunun ambalajları için gerekli olan cis-etkili elementleri içeren parvoviral ITRs tarafından taarruz altında kalır. Altta: bir plazmid, (örneğin, CMV.) Ya da heterolog bir veya otolog (örn. P38.) Promoter (Px) altında VP-genini taşıyan yapısal genlerin bozulması telafi etmek için rekombinant parvovirüsü üretimi sırasında trans temin edilir Rekombinant genomunda. ITR, ters terminali tekrarlayın. Şekil 4 uyarlanmıştır. RecPVs üretimi için kullanılan klasik protokolü (B) şematik görünüm. HEK293T hücreleri geçici olarak viral DNA (vektör ve yardımcı plazmid) ve üç gün sonra transfekte edilir, hücreleri toplanır ve virüsleri hasat edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> Şekil 2. Ile recPVs üretimiAd-VP yardımcı olur. RecPV ve Ad-VP genomların (A) şematik haritalar. RecPV VP bölgenin parçası yerine bir heterolog transgen içerir. Ad-VP parvovirus VP geni barındırır. Bu makalede açıklanan protokol (B) şematik görünümü. NB324K hücreleri recPV ve Ad-VP virüsleri ile birlikte enfekte olmaktadır. Üç gün hücreler hasat edilmiş ve recPV partikülleri hücre lizatı elde edilirler sonra. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> Şekil 3. Adenovirüs tabanlı plazmidler pXX6 tarafından recPV üretiminin uyarılması. 10 cm tabaklar tohumlanmış HEK293T hücreleri, recPVs üretmek için hastayı-1-GFP (A ve B) veya hastayı-1-lusiferaz (C) ile kombinasyon halinde pCMV / VP ile transfekte edildi. Eş zamanlı olarak, hücreler adenovirüs-türetilmiş plazmidler helper pXX6 ya da olmasın, olarak belirtilen ile birlikte transfekte edildi. Üç gün sonrası transfeksiyon, hücreler üç donma ve çözülme döngüleri ile hasat ve parçalanır edildi. Rezil eşit hacimleriE virüsü özleri göstergesi hücreleri NBK uygulandı ve iletimi deneyleri yapılmıştır. (A) konfluent NB324K monotabaka içinde GFP pozitif hücreler gösteren Temsilcisi mikrografları. (B) GFP transdüksiyon tahlillerin Kantitasyonu numaralı seribaşı hücre başına transdüksiyon birimi (TU) olarak ifade . (C) lusiferaz aktivitesi Kantitasyonu nispi lusiferaz birimi (RLU) olarak ifade edilir. El-Andaloussi ark açıklandığı gibi lusiferaz yapıldı. 5. Sütunlar üç ortalama değerler standart sapma çubuklarla çoğaltır temsil eder. + PXX6 sütun üzerine numarası, (B ve C), karşılık vermeden pXX6 varlığında elde recPV virüs titreleri in kat artış gösterir. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> Şekil 4. Reklam rekombinant-VP yardımcı virüsü ile recPV üretimi uyarılması. (A) NB324K hücreleri, enfeksiyon olduğunudaha sonra İçişleri Bakanlığı 10 az saflaştırılmış Ad-VP yardımcı virüsü (Ad-X birim / hücre, Adeno-X Hızlı titresi Takımı ile titre) ile Ted ve aşağıdaki rekombinant parvovirus Chi-HH-1-EGFP 11 (0.1 biriyle süperenfekte TU / hücre) ya da H-1-GFP (0,5 TU / hücre) 5. Bir gün sonrası enfeksiyon, orta değiştirildi ve iki gün sonra, hücreler toplandı ve üç dondurma-ve-çözülme döngüleri ile parçalanır. Ham hücre ekstreleri El-Andaloussi ark göre transdüksiyon deneyi tarafından virüs titreleri belirlemek için kullanılmıştır. 5. TU, iletim birimi. (B) Ad-VP yokluğu varlığında üretilen Viral toplu NB324K göstergesi hücreleri üzerinde plak testi ile çoğaltma yetkili viral parçacıkların (RCV) kendi içeriği için analiz edildi.

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Biz recPV üretim adenoviral genomik elementin varlığını tarafından geliştirilmiş olabilir göstermiştir. Biz transfeksiyon ile adenovirüs genomik elemanı sağlayarak ve recPV ile kombinasyon halinde Reklam-VP-yardımcı ile 100 kat daha fazla eş-hücreleri tarafından enfekte 10&#39;dan fazla kat (0,3-5 TU / hücreden) tarafından recPV verimleri artmıştır geleneksel protokollere karşılaştırılması. Protokol daha adenovirüs genomik elemanlarının teslimat ve enfeksiyonu için kullanılmak üzere Re...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Sigma </td><td> M4655 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td> Fugene </td><td> Roche </td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25300062 </td></tr><tr><td> Benzonase Nükleaz </td><td> Sigma </td><td> E8263 </td></tr><tr><td> Adeno-X Hızlı titresi Seti </td><td> Clontech&#39;in </td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

Bu tür sıçan H-1PV ve MVM olarak Kemirgen parvoviruses (PV), küçük icosahedral, tek sarmallı DNA virüsleri vardır. Genom, sırasıyla 1, yapısal olmayan (NS1 ve NS2) ve kapsid proteinler (VP1 ve VP2) ile ifade düzenleyen iki arttırıcılar ve P4 P38 içerir. Onlar onkolitik ve oncosuppressive yetenekleri için antikanser ilaçları insanlar 2 için patojen olmayan olurken yüksek ilgi gördü. NS1 viral sitotoksisite 3 ana efektör olup. Daha da doğal antineoplastik aktiviteleri arttırmak amacıyla, bu vektörlerin gelen türevler bir terapötik transgen (örn., bir sitotoksik polipeptid, sitokin, kemokin, tümör baskılayıcı geni gibi) 4 ile kapsid proteinleri için kodlayan gen ile değiştirerek elde edilmiştir. Rekombinant parvoviruses (recPVs) vektör NS1 / 2 kodlama dizileri ve viral DNA amplifikasyonu ve paketleme için gerekli olan PV genom telomer korur. ÜretimirecPVs yalnızca tarafından üretici hücre (genellikle HEK293T), oluşur ko-transfekte VP proteinleri için kodlayan gen (Şekil 1) 4 eksprese eden ikinci bir vektör (pCMV-VP) ile hücre. Bu şekilde üretilen recPV vektörler replikasyon bozuk. RecPVs ürettikleri edilmiştir hangi ebeveyn virüsler açısından gelişmiş oncotoxic aktiviteye sahip olduğu ispat rağmen, bunların üretimi önemli bir sorun oluşturmaktadır ve güçlü anti-kanser klinik uygulamalarda bu ajanların kullanımı engellemektedir. Bu kullanımda, diğer protokollere göre daha az 10 kat recPVs üretimi geliştirilmiş HEK293T içine E2A, E4 (orf6) ve VA RNA geni (örn. pXX6 plazmid) içeren bir Reklam-5 türetilmiş vektörün bir giriş bulundu. Bu bulgu, dayanarak, recPVs üretimi artırmak için gerekli olan genomik adenoviral elemanları gibi parvovir içerdiği Reklam-VP-yardımcı olan yeni bir inşaBizi VP gen ünitesi 5. Ad-VP-helper kullanımı, rec-PV üretimi ((örneğin NB324K) olası transferinde zor olan hücre hatlarının yapımı kullanımı, viral enfeksiyon adımları (as plazmid transfeksiyon aksine) tamamen güvenir bir protokolü kullanarak verir Şek. 2). Bu büyük ölçüde nihai ürün 5 kalitesini etkilemeden, üretim süresini ve maliyeti azaltarak, üretilen rekombinant virüs miktarını arttırır bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, recPV büyük ölçekli üretim (süspansiyon hücreleri ve biyoreaktörler) artık makuldür.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems at JoVE.com

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100&#39;den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Adenovirüs kaynaklı Sistemleri Yardımı ile verimli Rekombinant Parvovirus Üretim

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K Görüntüleme.  German Cancer Research Center (DKFZ). Burada biz sadece kullanılan diğer protokollere göre 100'den fazla kat rekombinant parvovirüs üretim verimliliğini artırır hücre enfeksiyonu, dayalı bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, parvovirüsü VP transkripsiyon ünitesi (AD-VP) ihtiva eden 5-bazlı yardımcı yeni bir adenovirüs kullanımına dayanır.

Video: Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Su Sistemleri Virüs Üretim Oranlar tahmin

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

Rekombinant Adeno ilişkili Viral Vektörlerin Üretimi ve Titering

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDA onaylı Vero hücrelerinde Aşı Geliştirme için bir araya getiren Arenavirus üretimi

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

Faj-görüntülenen Sentetik Antikor Kütüphaneler itibaren Ölçeklenebilir Yüksek Verim Seçimi

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

Algılama ve kaldırma nükleaz kirlenme rekombinant prototip köpüklü virüs Integrase saflaştırılması sırasında

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.