Bugün bir larva Zebrafish PDX Modeli tanıtmak için gidiyoruz. Bu model, ilaç yanıtlarını değerlendirmek için ksenogreftteki benzer bir hücresel bileşimi daha iyi taklit edebildikleri ve karşılaştırmalı analizlerimizle sonuçların tutarlılığını daha da artırdıkları için önemlidir. Bu tekniğin iki ana avantajı vardır.
İlk olarak, hücreleri farklı floresanlara etiketlemek için çeşitli standart kimyasal boyalar kullanıyoruz, bu da hücresel bileşimlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve anagrafik fazın yeteneğinin izin inmesine olanak sağlıyor. İkinci olarak, aynı zamanda zebra balıkinsan hücrelerinin genel hayatta kalma süresini artırır, onların genetik modifikasyon, hangi ilaç testi için daha uzun bir gözlem penceresi sağlar. Bu teknik pankreas kanseri olan hastalar için kişiselleştirilmiş tıp için potansiyel bir model sağlar ve aynı zamanda pre-klinik tümör ilaç ön değerlendirmesi için.
Bu yöntem aynı zamanda diğer tümör hücrelerini izlemek veya in vivo zebrabalığında ksenogreftli tümör hücresi yok ve daha uzun gözlem süresi için hücre sağkalımını iyileştirmek için de kullanılabilir. Enjeksiyon plakasını hazırlamak için, E3 çözeltisinde %1 agarose 50 mililitrelik bir çözelti hazırlayın. Agarose eriyene kadar çözeltiyi kaynatın.
10 santimetre Petri kabına tüm çözeltiyi dökün ve zebrabalığı embriyo fiksasyon kalıbını yüzeye yerleştirin. Agarose çözeltisi tamamen katılanınca kalıbı çıkarın. Enjeksiyon iğneleri hazırlamak için, iki iğne içine 0,9 milimetrelik bir iç boyutu ile 10 santimetre cam kılcal çekmek için bir iğne çekmece kullanın.
Bir mikroskop ve forceps kullanarak, bir açıklık oluşturmak için iğne ucunu kesti. İlk olarak, 7-9 PM civarında bir çiftleme tankı içine yetişkin Zebrafish bir ila iki çift yerleştirin. Ertesi sabah saat 8'de döllenmiş yumurtaları toplayın. Döllenmiş yumurtaları 40 mililitre taze E3 çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
28.5 santigrat derecede kuluçkaya yat. İlk olarak, bir Petri çanak içine toplanan pankreas kanseri örneği aktarın. PBS ile 5-6 kez doku durulayın ve bir milimetre küp parçalar halinde doku kesmek için bir neşter kullanın.
Daha sonra, parçalanmış dokuyu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve beş mililitre HBSS içeren. Kollajenaz tip dört, hyalurodinaz ekleyin ve BURADA gösterilen son konsantrasyonlarda BIR DNaase. Pipet karışımı yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için.
Karışımı %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 15-20 dakika kuluçkaya yatırın. Pipet karışımı her beş dakikada bir birkaç kez yukarı ve aşağı. Tüpe yedi mililitre DMEM ekleyin.
Santrifüj 110 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika. Daha sonra, supernatant decant ve DMEM tümör karışımı yeniden askıya. Karışımı, grup bir ve grup 2 olarak adlandırılan üç mililitre tam büyüme ortamı içeren iki altı santimetrelik Petri kabına koyun.
Her iki grubu da %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, büyük hücre tipleri olarak kanser hücrelerini bırakarak, aşırı büyümüş fibroblastlar kaldırmak için grup bir orta içine pankreas kanseri fibroblastlar 100x inhibitörü ekleyin. Önceki koşulları kullanarak kuluçkaya yatın.
Lentivirüs ürettikten sonra, 30-40% yoğunluğu ile 12-iyi plaka içine enfekte hücreleri tohum. %5 karbondioksit kuvözde hücreleri bir gecede 37 derecede kültüredin. Ertesi gün, mililitre başına sekiz mikrogram konsantrasyonda polibren içeren serum içermeyen orta 500 mikrolitre ile orta değiştirin.
4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, orta ve 12 saat boyunca tekrar kuluçka ya da lentivirus ek 100 mikrolitre ekleyin. 12 saat sonra, ek bir 36 saat için tam orta ve kuluçka iki mililitre ile orta değiştirin.
36 saat sonra floresan işaretlerini kontrol edin. Enfekte hücreleri hasat ve mililitre başına bir milyon hücrenin son konsantrasyonu ile bire bir oranında karıştırın. Hücreleri 110 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve 50 mikrolitre enjeksiyon çözeltisi içinde hücre karışımını yeniden askıya alın.
Zebrabalığı larvalarını anestezi ettikten sonra modifiye E3 ile dolu enjeksiyon plakasına aktarın. Mikrocapiller iğne içine karışık hücre süspansiyon 25 mikrolitre alın ve mikroenjeksiyon manipülatör içine iğne takın. Enjeksiyon basıncını ve zamanı ayarlayın ve 50 ila 80 hücreyi döllenme sonrası 48 saatlik zebra balığının sarısı kesesine enjekte edin. İlk olarak, post-zenografted Zebrafish larvaları 32 santigrat derecede 40 mililitre karışım çözeltisine aktarın.
12 kuyulu bir plakanın her kuyuya 10 zenografted larva yerleştirin. Sonra larvaları dört gruba ayırın. Kontrol grubunu %0,1 DMSO içeren E3 ile tedavi edin ve diğer grupları Gemcitabine ve/veya Navitoclax ile tedavi edin.
Tüm larvaları 32 derecede iki gün kuluçkaya yatırın. Tedavi sonrası zenogreftli larvalar anestezi den sonra %3 metil selüloza yerleştirin. Yanal görünümden larvagörüntü için bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın.
Ardından, kırmızı ve yeşil floresan sinyallerinin yoğunluğunu ölçmek için resim J ve grafik ped yazılımı kullanın. Bu çalışmada, birincil kanser doku hücreleri pankreas kanseri fibroblastlar inhibitörleri eklenmesi olmadan veya sindirim sonrası tam orta içine tohumlu. Kanser hücreleri ve fibroblastlar iki farklı popülasyon olarak zenginleştirilmiştir.
Inhibitörleri olmayan popülasyonda fibroblastlar hakimken, inhibitörlerin eklenmesinden sonra kanser hücresi büyümesi hakimdir. BCL2L1'de yeşil veya kırmızı floresan proteinleri ifade eden iki lentiviral ambalaj vektörü üretilmiştir. Virüs tabanlı floresan etiketleme hücrelerin hayatta kalma durumunu temsil eder.
Karışık kanser hücreleri ve fibroblastlar 48 saat sonra döllenme zebrabalığı sarısı kesesi içine enjekte edilir ve daha sonra iki gün boyunca Gemcitabine ve / veya Navitoclax ile tedavi edilir. Farklı popülasyonlarda hücre viabilities ve zenogreft hücresel bileşimi ilaç tedavisine yanıt olarak değiştirilir. Tümörlerin farklı işleme, itiraz edilmesi gerekebilir çeşitli adımlar vardır, hücre sindirim süresi de dahil olmak üzere, ilaç tedavi dozu, ve benzeri.
Bu teknik, araştırmacıların standart bir CGX veya PDS tsasından Zebrabalığı kullanmalarına yardımcı olur. Sabit oranlarda farklı hücrelerin karıştırılması ve enjeksiyonu sayesinde ilerleme bantlarını hücre büyümesi ile karşılaştırarak ölçer. Kişisel koruma büyük önem, özellikle ambalaj lentivirus.
Uygun olduğunda maske ve eldiven takın ve cilde karışmamaya çalışın.
