Hasta kaynaklı organoid modelleri bu hastalığın genetik ve henotik heterojenliğini yansıttığı için pankreas kanserini incelemek için güçlü ve hızlı bir araç olduğu için bu yöntem önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, organoidlerin sınırlı sayıda kanserden yüksek başarı oranıyla izole edilebilen ve downstream analizi için in vitro hızla genişletilebilen olmasıdır. Organoidlerin sitotoksik ilaçlara verdiği tepkinin incelenmesi, tümörlerin neden tedaviye dirençli hale geldiğini anlamamıza ve daha etkili tedavi stratejileri tanımlamamıza yardımcı olabilir.
Bu işlem başlamak için, kuvözden hazırlanan 12 kuyulu plakayı alın. Steril bir hücre kaldırıcı ile, yavaşça kuyunun alt kazıma önlemek için emin olurken tam ortamda yüzen olduğu gibi bodrum membran özü kubbe kaldırın. P1000 pipet kullanarak, BME kubbesini ve ortamı dikkatlice 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Her organoid içeren kuyu için bu adımı tekrarlayın. Bir mililitre soğuk bazal ortamla hasat edilen her kuyuyu hafifçe yıkayın ve bu yıkamayı organoidleri içeren tüpe aktarın. Çözeltiyi ve organoidleri P1000 pipetle iyice karıştırın ve 200 kez g'de beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün.
Süspansiyon içinde organoidler ve bir organoid pelet içeren BME tabakası tüpün alt kısmında görünür. BME ve organoid tabakakaybını önlemek için supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Tüpü buza yerleştirin.
Tüpe 10 mililitre buz gibi hücre kurtarma çözeltisi ekleyin ve ters çevrilerek iyice karıştırın. Her üç dakikada bir inversiyon la karıştırırken 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yat. Bundan sonra, santrifüj 200 kez g beş dakika.
BME tabakası gitmiş olmalıdır ise organoid pelet belirgin olmalıdır. BME tabakası boyutu azalmış ama hala görünür ise, dört santigrat derece ek bir 30 dakika kuluçka ve santrifüj tekrarlayın. BME depolimerize edildikten sonra, organoid pelet geride bırakarak hücre kurtarma çözeltisi kaldırın.
Organoidleri 10 mililitre bazal ortamla yıkayın. Beş dakika boyunca 200 kez g santrifüj, supernatant çıkarın ve en az beş dakika buz üzerinde organoid pelet ile tüp yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, tek bir hücre hazırlığı isteniyorsa, organoidler için 30 mikrolitre DNaase I çözeltisi ile birlikte üç mililitre tripsin ekleyin.
Bu enzimatik reaksiyonu 37 santigrat derecede, nazik inversiyon 10 dakikaya kadar her iki dakikada bir karıştırarak kuluçkaya yatırın. Tek hücreli dissosilasyonun başarılı olduğunu izlemek ve onaylamak için Brightfield mikroskobu kullanın. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için, 10 mililitre buz gibi bazal ortam ekleyin ve beş dakika boyunca 200 kez g'de aşağı doğru döndürün.
Sonra supernatant çıkarın. Hücreleri 10 mililitre bazal ortamla yıkayın. Santrifüj tekrar 200 kez g beş dakika için.
Supernatant çıkarın ve bu yıkama ve santrifüj işlemi bir kez daha tekrarlayın. En az beş dakika boyunca buz üzerinde hücre pelet ile tüp yerleştirin. Bundan sonra, hücre peletine buz gibi BME ekleyin ve çözeltiyi homojen olana kadar hafifçe karıştırmak için P200 pipetkullanın.
Daha sonra pipetin ucunu tüpün dibine yakın bir yere yerleştirin ve pipetleri en az 5-10 kez yukarı ve aşağı yerleştirin ve organoidleri mekanik olarak parçalayın. Önceden ısıtılmış 12 kuyulu bir plakanın ortasında 100 mikrolitrelik bir kubbeyi tespit etmek için P200 pipetkullanın. Tüm BME çözeltisi dağıtılana kadar tekrarlayın.
Daha sonra plakayı 37 santigrat dereceden bir kuvöze dikkatlice aktarın ve BME jelinin katılaşmasını bekleyin. 10 dakika sonra, plaka almak ve her kuyuya önceden ısıtılmış organoid tam medya bir mililitre ekleyin. Organoid kültürler genellikle kültür yoğunluğu ve çoğalması bağlı olarak yedi ila 10 gün içinde geçit edilir.
Gerekirse, büyüme faktörü tükenmesi ve buharlaşma telafi etmek için her beş günde bir önceden ısıtılmış organoid tam medya 200 mikrolitre ile kültürleri kontör. Organoidlerden tek hücreleri izole ettikten sonra, insan organoid tam medya bir mililitre tek hücreleri resuspend. Ardından, hücrenin canlılığını kaydettiğinden emin olmak için hücreleri saymak için otomatik bir hücre sayacı kullanın.
Bir mililitre süspansiyonmevcut hücre ve canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. Sonra 400.000 hücreye eşdeğer hacmi çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. 7.2 mililitre kadar hacmi getirmek için bu tüp organoid tam medya ekleyin.
Terapötik testler için, 800 mikrolitre BME'yi 7,2 mililitre organoid komple media ile karıştırarak hücreleri kaplamaya hazırlayın. Karışımı buzda tutulan bir rezervuara aktarın ve 12 kanallı pipet kullanarak bu karışımın 20 mikrolitresini 384 kuyulu bir plakanın her kuyusu içine koyun ve bu da kuyu başına yaklaşık 1.000 hücrenin kaplanmasıyla sonuçlanır. Daha sonra bir salıncak kovasında bir dakika boyunca 100 kez g'de plakayı aşağı çevirin ve plakayı 37 santigrat derecede bir doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
24 saat sonra, organoidlerin varlığını kontrol etmek için brightfield mikroskobu kullanın. Bu çalışmada, hasta kaynaklı PDAC organoid izole edilmiş, genişletilmiş ve karakterizedir. PDAC organoidlerin izole edilmesiile ilgili zorlukları göstermek için, küçük bir hiposellüler tümör örneğinden hasta kaynaklı organoid kültürü oluşturulur.
Organoidlerin iki hafta içinde daha da büyümesine izin verilir ve daha sağlam bir kültür oluşturmak için protokole göre geçiş yapılır. Kurulan ve hızlı büyüyen temsilcisi PDAC organoid tek hücreler daha sonra farmakotipleme protokolünün sonucunu göstermek için hazırlanır. 1,000 canlı hücre her kuyuda kaplanır ve sitotoksik kemoterapötik ajanlar dosed önce 24 saatlik bir süre içinde kurtarmak için izin verilir.
9.0 doz töz, düşük doz100 pikomolar ile başlayan ve iki mikromolar yüksek doz ile biten triplicate yapılır. Beş günlük bir tedaviden sonra, araçla tedavi edilen kuyular ve her kemoterapötik ajanın yüksek dozu ile temsili fotoğraflar çekilir. Fotoğrafları çektikten hemen sonra, hücre canlılığı Parlak hücre canlılığı reaktifi kullanılarak değerlendirilir ve grafik yazılımı kullanılarak çizilir.
Hasta kaynaklı organoidler heterojen morfolojilere sahip olabilir. Bu nedenle, her kültür için enzimatik ayrışmaları optimize etmek önemlidir. Hasta kaynaklı modellerin downstream analizi genellikle DNA ve RNA yeni nesil sıralama içerir.
Mümkünse, primer doku örneklerini kullanarak modellerin moleküler özelliklerini doğrulayın. Bireyselleştirilmiş organoid kültürler pankreas kanseri hastaları için kişiselleştirilmiş tıp yaklaşımları için olasılık açın. Fenol-kloroform ve kemoterapötik ajanlar gibi tehlikeli kimyasalların uygun PPE ve güvenlik ekipmanları ile ele alınması gerektiğini unutmayın.
