Bu yöntem, metatarsal kültür protokolünü daha büyük kemiklere uyarlayarak, kemik gelişimiile ilgili süreçleri ele almak için doğrudan kemik manipülasyonu ile karmaşık genetik modeller ile birleştirilerek izin verir. Bu teknik, canlı görüntüleme veya doğrudan fiziksel ve farmakolojik manipülasyon gibi in vivo mümkün olmayan kemik büyümesinin manipülasyon ve analizine olanak sağlar. Bu ex vivo kültür yöntemi, tedavinin organizma üzerindeki sistemik etkisinden ayıran kemikteki genetik insetin lokal etkilerinin özel olarak incelenmesini sağlar.
Gebe bir gebelik günü 14.5-18.5 fare% 80 etanol ile karın bölgesisterilize ve rahim boynuzları erişmek için cilt ve karın kasları açmak için küçük makas kullanarak başlayın. Karın boşluğundan rahim çıkarmak için, mesometrium kaldırmak ve boynuzları tabanını kesti. Daha sonra rahmi buz üzerinde buz gibi diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrelik petri kabına aktarın.
Bir biyogüvenlik kabine tek tek fetusları ayırmak için makas ile çuvallar arasında kesilmiş, ve bir diseksiyon stereo mikroskop altında taze diseksiyon ortamı ile yeni bir 60 milimetrelik çanak içine bireysel bir çuval transfer. Fetusları plasentalardan ayırmak ve fetusları membranlardan temizlemek için cımbız kullanın. Yeni bir 60 milimetre lik çanak içine vücut aktarmak için kesilmiş plastik pipet kullanın, ve daha fazla diseksiyon önce embriyo decapitate.
Sonra arkadan başlayarak ve tonbaş ve tonlarına soyma, cildi kaldırmak için cımbız kullanın. Omurgayakın kesmek ve vücuttan arka bacaklar ayırmak için cımbız kullanın. Arka ekstremiteleri buz gibi diseksiyon ortamı içeren temiz bir tabağa aktarın ve tibia'yı femurdan ayırmak için distal femur ve proksimal tibia yüzey kıkırdağı arasına cımbız yerleştirin.
Proksimal femur ve calcaneus kemik ve fibula tibia gelen kalça kemikleri çıkarın. Dikkatle nip ve femurlar ve tibias gelen yumuşak dokular çekin ve taze diseksiyon ortamı içeren 24-well plaka ilk kuyuya dört bacak kemikleri aktarmak için steril bir mililitrelik pipet kullanın. Bu kemik nabzı bağlayan yumuşak doku kaldırılır göstermek önemlidir.
Aksi takdirde, kemik bükülür ve uygun büyüme elde edemez. Kemikler uygun deneysel fetüs sayısından parçalara ayırıldığında, her kuyudaki kemikleri ışık mikroskobu altında iyi bir kontrastla sıfırda görüntüleyin ve her kuyudaki diseksiyon ortamını her kuyudaki bir mililitre kültür ortamıyla değiştirin ve kemikleri aspire etmemeye özen gösterin. Kültür koşullarında büyüme inhibisyonunun etkisini gözlemlemek için, sol tibias'ı 500 nanomolar retinoik asitle tedavi edin ve doğru tibiası eşdeğer bir araç hacmine sahip bir kontrol olarak kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, standart hücre kültürü koşulları altında bir hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. İki gün sonra, kemikleri 10 dakika boyunca %4 paraformaldehitiçeren tek tek iki mililitrelik tüplere aktarmadan önce kemik hücresi çoğalmasını değerlendirmek için 1-2 saat boyunca uygun bir timidin analogu ile tedavi edin. Daha sonra kemikleri PBS'ye aktarArak kemikleri son saat noktasında görüntüleyerek numuneleri dört santigrat derecede gece fiksasyonu için paraformaldehite geri döndürün.
Kemiklerin uzunluğunu ve mineralize bölgesini ölçmek için, uygun bir görüntüleme yazılımı programı açın ve görüntünün ölçeğini dikkate alarak, hem kemiğin toplam uzunluğunu hem de mineralize bölgeyi ölçün. Ölçümleri bir uçtaki ilk karanlık hücrelerden diğer uçtaki son karanlık hücrelere kadar başlatmak. Günlük ortalama uzunluk artışı olarak tanımlanan büyüme oranını hesaplamak için, kemiğin son uzunluğu ile başlangıç uzunluğu arasındaki farkı kültürdeki gün sayısına bölün.
Burada, kültürlenmiş tibia ve eşdeğer aşamalarında taze çıkarılan tibia arasında bir karşılaştırma gösterilmiştir. Kültürün iki güne kadar sonra elde edilen boyutu hem kıkırdak hem de mineralize kemik için in vivo kemik büyümesi ile karşılaştırılabilir. Daha uzun kültür dönemleri kültürlü kemikler ve taze çıkarılan kemikler arasında daha büyük farklılıklara yol açar.
Not, yumuşak doku eksik çıkarılması ile yetiştirilen tibia kültürlü tibia bükme neden olabilir. Retinoik asit ile tedavi tedavi nin iki gün sonra tibial büyüme üzerinde sağlam bir etkisi vardır. Kültürde iki gün sonra tibia toplam uzunluğu tutarlı bir artış olmasına rağmen, bu büyüme ilk uzunluğu sadece% 9-29 yaklaşık bir artış karşılık gelir.
In vivo gözlenecek kemik büyüme artışı daha az. Gerçekten de, timidin analog etiketleme eşdeğer bir aşamada taze çıkarılan kemiklere göre kültür sonra bu bölgede daha az pozitif hücreleri gösterir. Ayrıca, in vitro kültürkavi, iskelet elementinin toplam uzunluğu önemli ölçüde artar, mineralize bölgede hemen hemen hiçbir artış gözlenir.
Histolojik ve moleküler analize ek olarak, kültürden sonra kültüre uygulanan tedavilerin hücresel etkisini karakterize etmek için takas ve 3Boyutlu görüntüleme yapılabilir. Bu teknik, organlararası iletişimle ilgili soruları ele almamızı sağlar. Örneğin, bir çeşit ağrısız parabiyoz deneyinde farklı genetik modellerden kemikleri birleştirerek.
