Yazar Annette Blak Rasmussen ve Kristine Moeller teknik verdikleri destek için teşekkür istiyor

Sağlıklı yetişkin gönüllü plastik cerrahisi uygulanan deri örnekleri koleksiyon ana bilgisayar kurumlarında etik kurul onayı gerektirir. Bu iletişim kuralı bölgesel Etik Komitesi, bölge Midtjylland tarafından Danimarka (M-20110027) kabul edildi. Burada açıklanan yöntemi Maciaq vd tarafından benzer çalışmalardan elde edilir 10 ve Liu ve Karasek11.
1. insan deri lenfositi yalıtım
<ol>
	<li>Başlatmak aşağıdaki çözümleri yaparak: 50 mL solüsyon % 0.25 tripsin ve % 0.1 glikoz DPBS içinde. Mix ve filtre (0.2 µm) çözüm sterilize. RPMI-1640 + % 2 FBS çözüm, DPBS ve keratinosit serum-Alerjik orta (KSFM) 50 mL 10 mL hazırlayın. KSFM takviyeleri ve 250 µL viomisin, 500 mL KSFM ekleyin. 37 ° C kullanmadan önce için çözümleri önceden ısıtmak.</li>
	<li>Cilt sağlıklı yetişkin gönüllüler plastik cerrahisi uygulanan toplamak. Kullanılan deri örnekleri yaklaşık 10 cm x 15 cm, vardır ama boyutu değişebilir. Ulaşım altında deri serin deri örnekleri soğutma bir öğeyi içeren bir Styrofoam kutusu taşıma tarafından tutmak. Gerekirse, deri örneği 4 ° C'de gecede depolanabilir.</li>
	<li>Steril makas, neşter ve forseps kullanarak cilt bölümü altında gelen yağ çıkarmak.</li>
	<li>Cilt bölümü (yaklaşık 10 cm x 15 cm) steril bir kapak iğneleri kullanarak bir plaka üzerine toka. Önce Cilt Kuru steril gazlı bez pad ile temizleyin. Sonra deri % 70 etanol ile steril gazlı bez pad kullanarak temiz.</li>
	<li>Bir ayak planer kullanarak, Cilt bölüm üst tabakası (epidermis) kesin ve bir 9 cm Petri kabına yerleştirin. O zaman, hemen 25 mL (1.1 adımda hazırlanan) DPBS/tripsin/glukoz çözeltisi Petri kabına ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Bir pipet kullanarak DPBS/tripsin/glikoz çözüm Petri kabına kaldırın ve 10 mL RPMI-1640 + %2 FBS tripsin devre dışı bırakın ekleyin.</li>
	<li>İki forseps kullanarak, şimdi epidermal hücrelerin orta yavaşça kazıma ve epidermal ve deri bölümleri dermal bölmesinin Tantanacı serbest.</li>
	<li>Epidermal hücre süspansiyon bir metal filtre (1 mm delik boyutu) filtre ve bir 50 mL tüp içinde toplamak. RPMI-1640 FBS ve girdap olmadan 10 mL süspansiyon ile metal filtre epidermal hücre süspansiyon içeren bir 50 mL tüp içine 10 s. filtre içeren bir 50 mL tüp için geri kalan cilt bölümleri ekleyin. DPBS toplam hacmi 50 mL için ekleyin.</li>
	<li>Hücre süspansiyon vasıl 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak ve epidermal hücre Pelet 37 ° C KSFM hücre Pelet boyutuna bağlı olarak yaklaşık 10 ml resuspend. Trypan boyama yöntemi mikroskop altında mavi kullanarak hücreleri saymak. Yaklaşık 50-100 x 106 hücre hücre bir 10 cm x 15 cm cilt bölümünden elde edilen sayıdır. Her 75 cm2 kültür şişesi için 8 x 106 hücreleri ile birlikte 37 ° C KSFM 12 mL aktarın. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeler sallamak.</li>
	<li>%100 nem oranı ve % 5 CO237 ° C kuluçka lenfositi kuluçkaya. Orta 2 gün ve üç kez haftalık sonra değiştirin. Geçiş hücreleri lenfositi proliferasyon oranını bağlı olarak yaklaşık 2 hafta sürer % 70-80 birleşmesi kültürdür.</li>
</ol>
2. passaging keratinositler
<ol>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 4.5 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi bir 75 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li>
	<li>Orta hücrelerden kaldırın ve 4.5 mL/75 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, hafifçe kalan hücreleri gevşetmek için el karşı kültür şişeye çarptı. Sonra tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 75 cm2 kültür şişesi için 6 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için transfer.</li>
	<li>Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 3 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. Hücreler için 450 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
	<ol>
		<li>KSFM (37 ° C) 10 mL pelleted hücrelerde resuspend. Hücreleri saymak ve 3 x 106 hücreler bir 150 cm2 kültür şişesi ile birlikte KSFM (37 ° C) 20 mL transfer. Yavaşça hücrelerin tekdüze dağılım sağlamak için kültür şişeyi sallayın. Kültür bağlı olarak (bkz: Bölüm 3, iletişim kuralı aşağıdaki buz gibi) lenfositi nükleer silahların yayılmasına karşı oranı yaklaşık 4-6 gün sürer % 80-90 birleşmesi olduğunda hücreleri dondur. Keratinositler uygun dondurulmuş hisse oluşturmak için genişletin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. lenfositi dondurulması
<ol>
	<li>Bir kuluçka 37 ° C'de % 0.05 tripsin-EDTA çözüm uygun miktarda ısı. 9 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi 150 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li>
	<li>Orta hücrelerden kaldırın ve 9 mL/150 cm2 kültür şişesi % 0.05 tripsin-EDTA çözüm hücrelere önceden ısınmış ekleyin. İnkübatör (37 ° C) kültür şişeye koyun ve hücreleri gevşeme başlattıysanız yaklaşık 5 dakika sonra mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Hücreleri yaklaşık % 50'si gevşetti, yavaşça kültür şişeye el karşı kalan hücreleri gevşetmek için çarptı. O zaman, tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 150 cm2 kültür şişesi için 12 mL RPMI-1640 + %2 FBS (37 ° C) ekleyin ve hücre süspansiyon 50 mL tüpler için Aspire edin.</li>
	<li>Kültür şişeler RPMI 1640 + %2 6 mL ile durulayın FBS ve 50 mL tüpler için ekleyin. 450 x g 4 ° C'de 10 dakika için tüpler santrifüj kapasitesi Orta (KSFM + % 10 DMSO) soğuk buz gibi hücre hazırlayın.</li>
	<li>Hücre Pelet KSFM + % 10 DMSO resuspend, hücreleri saymak ve hücreleri bir yoğunluk olarak 6 x 106 hücre/mL standart yavaş dondurma dondurma yöntemleri12kullanarak, Don.</li>
	<li>Keratinositler sıvı azot (Buhar fazı) kullanıma hazır kadar saklayın.</li>
</ol>
4. çözülme ve donmuş lenfositi kültür
<ol>
	<li>Hızla bir 37 ° C su banyosu uygun dondurulmuş şişeleri çözülme. % 70 etanol cryovial dışını temizlemek için kullanın. Hücreleri (yaklaşık 15.000 hücreler/cm2) uygun sayıda bir kültür şişesi aktarmak ve hemen kültür şişeye Önceden ısıtılmış büyüme orta (KSFM) ekleyin. Kültür şişeler herhangi bir boyut deneme kurulumuna bağlı olarak kullanılabilir.</li>
	<li>5 mL kültür orta bir 25 cm2 kültür şişesi için kullanın.</li></ol>Hücre sayısı hücrelerinin büyümesini donör donör değiştiğinden kültür şişeye değişebilir eklendi. Hücreleri %100 nem oranı ve % 5 CO237 ° C kuluçka kuluçkaya.
	<li>Değişim orta 2 gün sonra ve üç kez haftalık taze Önceden ısıtılmış KSFM kullanarak. Not: Bizim veri ortalama burada açıklanan protokol tarafından izole hücreler % 95'i keratinosit-marker cytokeratine-1413için olumlu olduğunu gösterdi.</li>

<ol>
	<li>Barker, J. N., Mitra, R. S., Griffiths, C. E., Dixit, V. M., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+as+initiators+of+inflammation.">Keratinocytes as initiators of inflammation.</a> Lancet. 337 (8735), 211-214 (1991).</li><li>Nickoloff, B. J., Turka, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes:+key+immunocytes+of+the+integument.">Keratinocytes: key immunocytes of the integument.</a> Am J Pathol. 143 (2), 325-331 (1993).</li><li>Fuchs, E., Raghavan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+under+the+skin+of+epidermal+morphogenesis.">Getting under the skin of epidermal morphogenesis.</a> Nat Rev Genet. 3 (3), 199-209 (2002).</li><li>Bos, J. D., Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+skin+immune+system+Its+cellular+constituents+and+their+interactions.">The skin immune system Its cellular constituents and their interactions.</a> Immunol Today. 7 (7-8), 235-240 (1986).</li><li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease.">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9 (10), 679-691 (2009).</li><li>Albanesi, C., Scarponi, C., Giustizieri, M. L., Girolomoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratinocytes+in+inflammatory+skin+diseases.">Keratinocytes in inflammatory skin diseases.</a> Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 4 (3), 329-334 (2005).</li><li>Gilliet, M., Lande, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+peptides+and+self-DNA+in+autoimmune+skin+inflammation.">Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation.</a> Curr Opin Immunol. 20 (4), 401-407 (2008).</li><li>Rohani, M. G., Pilcher, B. K., Chen, P., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdc42+inhibits+ERK-mediated+collagenase-1+(MMP-1)+expression+in+collagen-activated+human+keratinocytes.">Cdc42 inhibits ERK-mediated collagenase-1 (MMP-1) expression in collagen-activated human keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 134 (5), 1230-1237 (2014).</li><li>Meephansan, J., Tsuda, H., Komine, M., Tominaga, S., Ohtsuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+IL-33+expression+by+IFN-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+in+normal+human+epidermal+keratinocytes.">Regulation of IL-33 expression by IFN-gamma and tumor necrosis factor-alpha in normal human epidermal keratinocytes.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2593-2600 (2012).</li><li>Maciag, T., Nemore, R. E., Weinstein, R., Gilchrest, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+endocrine+approach+to+the+control+of+epidermal+growth:+serum-free+cultivation+of+human+keratinocytes.">An endocrine approach to the control of epidermal growth: serum-free cultivation of human keratinocytes.</a> Science. 211 (4489), 1452-1454 (1981).</li><li>Liu, S. C., Karasek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+growth+of+adult+human+epidermal+keratinocytes+in+cell+culture.">Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.</a> J Invest Dermatol. 71 (2), 157-162 (1978).</li><li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation.">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen Med. 10 (10), E354-E364 (2016).</li><li>Otkjaer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-20+gene+expression+is+induced+by+IL-1beta+through+mitogen-activated+protein+kinase+and+NF-kappaB-dependent+mechanisms.">IL-20 gene expression is induced by IL-1beta through mitogen-activated protein kinase and NF-kappaB-dependent mechanisms.</a> J Invest Dermatol. 127 (6), 1326-1336 (2007).</li><li>Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involucrin+and+other+markers+of+keratinocyte+terminal+differentiation.">Involucrin and other markers of keratinocyte terminal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 100s-103s (1983).</li><li>Boyce, S. T., Ham, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+differentiation+of+normal+human+epidermal+keratinocytes+in+chemically+defined+clonal+culture+and+serum-free+serial+culture.">Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture.</a> J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 33s-40s (1983).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+tissue+models+of+normal+and+diseased+skin.">Three-dimensional tissue models of normal and diseased skin.</a> Curr Protoc Cell Biol. , (2008).</li><li>Kamsteeg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+2+helper+T-cell+cytokines+induce+morphologic+and+molecular+characteristics+of+atopic+dermatitis+in+human+skin+equivalent.">Type 2 helper T-cell cytokines induce morphologic and molecular characteristics of atopic dermatitis in human skin equivalent.</a> Am J Pathol. 178 (5), 2091-2099 (2011).</li><li>van den Bogaard, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+keratinocytes+and+T+cells+in+a+3D+microenvironment:+a+model+to+study+inflammatory+skin+diseases.">Crosstalk between keratinocytes and T cells in a 3D microenvironment: a model to study inflammatory skin diseases.</a> J Invest Dermatol. 134 (3), 719-727 (2014).</li><li>Raaby, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans+cell+markers+CD1a+and+CD207+are+the+most+rapidly+responding+genes+in+lesional+psoriatic+skin+following+adalimumab+treatment.">Langerhans cell markers CD1a and CD207 are the most rapidly responding genes in lesional psoriatic skin following adalimumab treatment.</a> Exp Dermatol. , (2017).</li></ol>

. Yazar hiçbir çıkar çatışması vardır.

Burada, kolayca yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi yalıtmak ve onları vitrokültür anlatan. Bu model epidermal hücre biyolojisi incelenmesi için geniş bir uygulama olabilir ve araştırmacılar Kutanöz hastalıkları okumak isteyen için yararlı olabilir.
Burada açıklanan protokol avantajları bir kısmı yeni doğan erkek sünnet geçiren elde yenidoğan sünnet derisi üzerinden izole lenfositi aksine yetişkin hastalarda birincil insan lenfositi hem erkek hem de kadın izole edilmiştir ve herhangi bir yaş ≥18 yıl içerebilir. Böylece, biyolojik çeşitlilik lenfositi yenidoğan sünnet derisi üzerinden ile karşılaştırıldığında Bu hücrelerde çok daha büyüktür. Ayrıca, deri örnekleri parça nispeten büyük meme küçültme ameliyatı veya kilo kaybı cerrahi gibi plastik cerrahisi uygulanan hastalarda elde edilebilir.
Yukarıda da belirtildiği gibi epidermis lenfositi belirli ayırt etme aşamasına karşılık gelen farklı katmanlar halinde düzenlenmiştir. Deri Biyoloji çalışma için burada açıklanan modeli üç boyutlu bir microenvironment eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Epidermis olarak deride mevcut farklı hücre tipleri farklı katmanlar bu modelde taklit değil. Bu sorunu gidermek için insan derisi eşdeğer modelleri, hangi oluşur çok katmanlı bir epitel keratinositler maruz hava-sıvı arayüzü için üzerine ayırt etmek ve böylece, daha yakından yerli epidermis17, taklit eden kullanılabilir 18,19. Deri Biyoloji çalışma için elde edilen başka bir cilt biyopsileri kültürler, yukarıda açıklanan20olarak bir hava-sıvı Interphase tutulur ex vivo cilt modeli modelidir.

Deri insan vücudunun en büyük organı ve dış çevreye karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Deri iki ana katmandan oluşur: dermis ve epidermis nerede epidermis derinin en dış tabakası oluşturan,. Epidermisin en bol bulunan hücre türü hücre kitle1,%295'den fazla oluşan lenfositi değil. Keratinositler farklılaşma epidermisin içinde çeşitli aşamalarında korunur ve farklılaşma3belirli aşamalarında karşılık Bazal, spinöz, taneli ve cornified katmanlar halinde düzenlenir. Keratinositler birincil işlevi böylece dış dünyaya sağlam bir bariyer üreten epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır.
Keratinositler da deride patojenlere karşı savunma ilk satırı temsil eder ve bu nedenle doğuştan gelen bağışıklık yanıtı4,5' te önemli bir rol oynamaktadır. Keratinositler pozlama dış uyaranlara karşı harekete geçirmek için hücre içi sinyal yolları ve daha sonra üretim, sitokinler, kemokinler ve antimikrobiyal peptidler gibi çeşitli inflamatuar aracılar birkaç açar. Bu keratinosit kaynaklı proteinler alımı ve dendritik hücreler, nötrofil ve belirli T hücreleri6,7gibi bağışıklık hücreleri aktive tarafından inflamatuar yanıt olarak katılmak. Böylece, keratinositler çok sayıda biyolojik işlemlerinde çok önemli bir rol oynamak çünkü burada sunulan teknik arkasındaki mantığı deri Biyoloji çalışmaya bir vitro modeli oluşturmak için idi. Yenidoğan sünnet derisi elde edilen birincil keratinosit kültürler genellikle deri Biyoloji8,9incelemek için kullanılır. Ancak, burada açıklanan tekniği ile lenfositi üzerinden her iki cinsiyette hücreleri daha yüksek bir biyolojik çeşitlilik sonucu elde edilir.
Burada, yalıtım ve yetişkin deri, birincil insan lenfositi nesil için detaylı bir protokolü keratinositler dondurma ve bakım dahil olmak üzere mevcut. Bu yöntem genel amacı Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için bir model olarak kullanılan birincil insan lenfositi üretmektir.

<table><tbody><tr><td>KSFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-034</td><td>Cell culture medium</td></tr><tr><td>KSFM supplements</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37000-015</td><td>Supplements for KSFM</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Dimethyl sulfoxid</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15710-049</td><td>Cell culture medium additive</td></tr><tr><td>Sterilization filter</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td>Syringe filter with a pore size of 0.2 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td>Used to trypsinize cells</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>-</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td>-</td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Used to inactivate trypsin</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>-</td><td>-</td><td>Forceps from any company can be used</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>-</td><td>-</td><td>Scissors from any company can be used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann Morton</td><td>0501</td><td>Scalpels from any company can be used</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gauze pads</td><td>NOBAMED</td><td>875420</td><td>Gauze pads from any provider can be used</td></tr><tr><td>Foot planer</td><td>Credo Solingen</td><td>1510</td><td>Foot planer from any provider can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Petri dishes from any provider can be used</td></tr><tr><td>Metal filter</td><td>-</td><td>-</td><td>In-house 1 mm hole size metal filter</td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>NUNC</td><td>156499</td><td>-</td></tr><tr><td>150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; culture flasks</td><td>TTP</td><td>90151</td><td>-</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300-062</td><td>Used to trypsinize cells when passaging</td></tr></tbody></table>

generation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin

Keratinositler ana işlevi böylece dış dünya için mekanik bir engel Bakımı epidermis, yapısal bütünlüğünü sağlamaktır. Buna ek olarak, keratinositler hızlı, spesifik olmayan şekilde antijenik uyaranlara yanıt doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir bölümü olarak başlatma, bakım ve düzenleme epidermal bağışıklık yanıtı, temel bir rol oynar. Burada, biz birincil insan lenfositi yetişkin deri, izolasyon için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bu hücreler farklılaşma işaret involucrin artan bir ifade göre ölçülen kalsiyum kaynaklı terminal farklılaşma yanıt göstermektedir. Buna ek olarak, izole lenfositi aktivasyonu p38 MAPK tarafından ölçülen duyarlı hücre içi sinyal yolları için IL-1β-indüklenen aktivasyonu olduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında, yalıtım ve yetişkin cilt üzerinden birincil insan keratinositler, kültür için bir yöntem açıklanmaktadır. Lenfositi epidermis baskın hücre tipinde olduğu için bu moleküler mekanizmalar Kutanöz Biyoloji içinde vitroçalışma için yararlı bir yöntemdir.

Terminal farklılaşma kalsiyum kaynaklı İnsan lenfositi terminal farklılaşma üzerine kalsiyum14,15,16ile tedavi tabi. Birincil insan lenfositi izole ve yukarıdaki protokolünde açıklandığı gibi kültürlü. Ne zaman yaklaşık % 50-60 birleşmesi, hücreleri kalsiyum (1,2 mM) ile teşvik ya da araç ve hücreleri resimlerini 0, 1 ve 2 günde alınmıştır. Şekil 1 kalsiyum stimülasyon gözlenen lenfositi morfolojik değişiklikler gösterir.
Involucrin ifade artış üzerine kalsiyum stimülasyon olduğunu Kültürlü insan lenfositi yaklaşık % 50-60 birleşmesi sonra hücreleri kalsiyum (1,2 mM) veya 24 ve 48 s için bir araç ile teşvik kadar yetişkin. Keratinositler morfolojik değişiklikler tarafından gözlemlediği gibi hücreleri artan farklılaşma paralel olarak, farklılaşma işaret involucrin mRNA ifade önemli ölçüde kalsiyum stimülasyon artış gösterdi. Stimülasyon 24 ve 48 saat sonra involucrin mRNA ifade yaklaşık 5.5-fold artmış ve 3.5-fold, sırasıyla, araç (Şekil 2) ile karşılaştırıldığında.
IL-1β-indüklenen fosforilasyon p38 MAPK İzole insan lenfositi sitokin kaynaklı harekete geçirmek-in hücre içi sinyal yolları için duyarlı olsaydı, kültürlü lenfositi uyarılmış IL-1β ile belirlemek için (10 ng/mL) çeşitli zaman puan için. 5 dk içinde IL-1β stimülasyon Western Blot tarafından belirlendiği gibi bir hızlı harekete geçirmek/fosforilasyon için p38 MAPK, bir yol açtı. 1 saat sonra IL-1β-indüklenen p38 MAPK fosforilasyon Bazal seviyeye (şekil 3) geri döndü. IL-1β stimülasyon p38 MAPK (şekil 3) toplam protein düzeyi üzerinde etkisi olduğu gibi sadece p38 MAPK fosforile şeklinde artış olmuştur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig1.jpg"> 
Resim 1 : Kalsiyum kaynaklı farklılaşma lenfositi temsilcisi görüntülerini. Kültürlü birincil insan lenfositi araç (dH2O) ya da kalsiyum (1,2 mM) için belirtilen zaman puan ile teşvik. (A - E) Keratinositler gün 0(a), gün (B ve C) 1 ve 2. gün (D ve E) kalsiyum stimülasyon sonra faz kontrast görüntüler. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56863/56863fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig2.jpg"> 
Resim 2 : İnvolucrin kalsiyum stimülasyon üzerine mRNA ifade arttı. Kalsiyum (1,2 mM) ya da araç (dH2O) belirtilen süre puan için birincil kültürlü insan lenfositi eklendi (n = 3). RNA izole edildi ve farklılaşma işaret involucrin ifade qPCR tarafından analiz. RPLP0 (ribozomal Protein büyük P0) mRNA ifade normalleştirme için kullanıldı. Sonuçları ortalama ± SD üç farklı deneylerden temsil eder. p &#60; 0,05 araç ile karşılaştırıldığında. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56863/56863fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56863/56863fig3.jpg"> 
Şekil 3 : IL-1β-indüklenen fosforilasyon, p38 MAPK. Kültürlü birincil insan lenfositi uyarılmış araç (PBS + % 0.15 BSA) veya IL-1β (10 ng/mL) belirtilen süre puan için. Proteini özleri edildi p38 MAPK fosforile düzeyini ölçmek için kullanılan izole ve Western Blot analizi ve toplam p38 MAPK. Eşit yük bir anti-β-aktin antikor ile kuluçka tarafından doğrulandı. Üçte bir temsilcisi deney verileri gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56863/56863fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin at JoVE.com

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model vardır

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

generation-culturing-primary-human-keratinocytes-from-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

16.3K Görüntüleme.  Aarhus University Hospital. İnsan derisi dış ortamda karşı savunma ilk satırı olarak davranır. Biz yetişkin cilt üzerinden birincil insan lenfositi izole bir yöntem mevcut. Bu izole lenfositi çok sayıda deneysel kurulumları yararlıdır ve kutanöz Biyoloji vitro. moleküler mekanizmalar çalışmak için son derece uygun bir model vardır

Video: Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Gelişim Biyolojisi

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

İnsan Cilt Yetişkin Epitel Kök Hücre İzolasyonu ve Kültür

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Biyoloji

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Büyük Ölçekte Üç Boyutlu Yeniden Yapılandırılmış İnsan Epidermisi Yetiştirmek

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Biyomühendislik

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

İnsan Sünnet Derisinden Primer Schwann Hücrelerinin, Keratinositlerin ve Fibroblastların İzolasyonu, Kültürü ve Karakterizasyonu

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Nörobilim

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Yenidoğan ve Erişkin Fare Ciltlerindeki Primer Fare Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

Yetişkin Fare Damak Tadından Birincil Oral Keratinositlerin İzolasyonu ve Kültürü

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

İnsan Derisi Keratinosit İzolasyonu: Deri Örneklerinden Primer Keratinositlerin Kültürlenmesinde Bir Yöntem

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...